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Ergebnisse und Diskussion
Abb. 3.4.4 Sekretion viraler Partikel ist nicht von der Integrität der TLMs abhängig.
LMH-Zellen wurden mit den entsprechenden Konstrukten transfiziert und nach
insgesamt sechs Tagen der gesammelte Zellkulturüberstand auf virale Partikel
untersucht. Ein Teil der Überstände wurde für die Cäsiumchlorid-Gradienten-
zentrifugation mit anschließender DNA-Dot Blot-Analyse verwendet (A), ein
anderer Teil für einen Immunblot mit dem PreS -spezifischen KpnI-Antikörper
(B).
Untersuchung und Quantifizierung der sekretierten viralen Partikel durch Dot
Blot-Analyse und Immunblot mit einem preS-spezifischen Antikörper zeigten,
dass bei DHBV-D1 die Menge sekretierter Partikel im Zellkulturüberstand im
Vergleich zum Wildtyp stark reduziert war (Abb. 3.4.4). Außerdem war im DNA-
Dot Blot zu erkennen, dass LMH-Zellen nach einer Transfektion mit DHBV-
Genomen nicht nur komplette Virionen, sondern auch (aus bisher unbekanntem
Grund) Core-Partikel sekretieren, denen die Hülle fehlt (Abb. 3.3.4 A).
102

Tabelle 4.1 Sekretion DNA-haltiger viraler Partikel
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Virus DNA-Menge (in pg) Virale Partikel Virale Partikel per ml
D1 100 3 x 10 7 1,2 x 10 7
D2 425 12,7 x 10 7 5,1 x 10 7
D1/2 462,5 13,9 x 10 7 5,5 x 10 7
wt 300 9 x 10 7 3,6 x 10 7
Im Gegensatz zu DHBV-D1 konnte bei DHBV-D1/2 oder der Mutante DHBV-D2
kein negativer Effekt auf die Sekretion nachgewiesen werden. Dies könnte
bedeuten, dass nicht die TLM-Defizienz per se der Grund für den Sekretions-
defekt von DHBV-D1 war, da diese Mutation auch in der Doppelmutante
vorhanden war. Allerdings könnte es auch sein, dass die TLM-Defizienz von
DHBV-D1 sehr wohl für die Sekretionsdefizienz verantwortlich war, dieser Effekt
jedoch in der Doppelmutante durch eine kompensatorische Mutation im TLM2
aufgehoben wurde. Grundlegend könnte auch ein Replikationsdefekt für die
stark verminderte Sekretion verantwortlich sein. Aus diesem Grund wurde die
Mutante DHBV-D1 in folgenden Versuchen nicht eingesetzt. Insgesamt ließ sich
sagen, dass die TLM-Integrität wahrscheinlich für die Sekretion kompletter
viraler Partikel nicht notwendig ist, da DHBV-D2 und DHBV-D1/2 eine normale
Sekretion DNA-haltiger Partikel und SVPs erlaubten.
Um die Replikationskompetenz der Genome zu überprüfen, wurden die
replikativen Intermediate durch Southern Blot und die Core-Expression durch
Immunblot für das wt-Virus und die TLM-Mutanten untersucht.
Abb. 3.4.5 Virale Replikation benötigt keine intakten TLMs.
Die DNA der mit den angegebenen Konstrukten transfizierten LMH-Zellen
wurden eine Woche nach Transfektion isoliert und im Southern Blot analysiert
103

Ergebnisse und Diskussion
(A) und die Proteine durch Immunblot nachgewiesen (B). rc (relaxed circular
DNA), oc (open circular DNA).
In Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen zeigte eine Immunblotanalyse
der zellulären Lysate mit einem Core-spezifischen Antikörper, dass reduzierte
Mengen dieses viralen Proteins in den mit dem D1-Genom transfizierten Zellen
produziert wurden (Abb. 3.4.5 B, Spuren 1 bis 3). Ein Southern-Blot zur
Analyse der viralen replikativen Intermediate zeigte vergleichbare Mengen in
den Fällen von wt-DHBV, DHBV-D2 und DHBV-D1/2 und im Gegensatz dazu
eine reduzierte DNA-Menge im Falle der DHBV-D1 transfizierten Zellen (Abb.
3.4.5 A, Spuren 1 und 4).
Diese Daten sprachen gegen einen Sekretionsblock von DHBV-D1, der
zu einer Retention der viralen Partikel in den Zellen und somit erhöhten viralen
Protein- und DNA-Mengen führen würde. Es schien wahrscheinlicher, dass die
Mutation im D1-Genom zu einer Störung der Replikation führt. Dies konnte aus
der stark reduzierten Menge replikativer Intermediate in den LMH-Zellen und
der reduzierten Core-Menge geschlossen werden.
Zusammenfassend zeigen die oben beschriebenen Ergebnisse, dass
funktionelle TLMs, möglicherweise mit Ausnahme des TLM1, für die virale
Morphogenese und Sekretion entbehrlich sind.
4.1.3 Die Integrität des TLM ist essentiell für die Infektiosität von DHBV
Nachdem sichergestellt war, dass bestimmte TLM-defiziente Viren ohne
sichtbare Defekte sekretiert werden können, wurde die Relevanz der TLMs für
den Infektionsprozess untersucht. Primäre Entenhepatozyten wurden mit wt-
DHBV oder den Mutanten DHBV-D2 und DHBV-D1/2 (je 100 GE pro Zelle)
infiziert. Aufgrund der in vorangehenden Experimenten beobachteten
reduzierten Replikationsrate von DHBV-D1 wurde die Infektiosität dieses Virus
nicht weiter verfolgt. Die produktive Infektion wurde drei Tage nach der
Inokulation durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung und Immunblot gegen L
untersucht.
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Abb. 3.4.6 Inaktivierung der TLMs führt zu einem Infektiositätsverlust.
Ergebnisse und Diskussion
PDHs wurden mit den rekombinanten Viren (100 MGE) infiziert und drei Tage
später die Etablierung einer produktiven Infektion mit Hilfe indirekter
Immunfluoreszenzfärbung (A) und Immunblot (B) für das virale L-Protein
untersucht.
Die Immunfärbung der Kulturen mit einem L-spezifischen Antikörper zeigte,
dass nur im Falle der mit wt-DHBV infizierten Kulturen de novo-Synthese des
viralen Oberflächenproteins nachgewiesen werden konnte (Abb. 3.4.6 A).
Dieses Ergebnis wurde durch die Immunblotanalyse der zellulären Lysate mit
einem L-spezifischen Antikörper bestätigt (Abb. 3.4.6 B). Im Falle der wt-
infizierten Zellen waren signifikante Signale nachweisbar, während in den
Lysaten der mit DHBV-D2 oder DHBV-D1/2-infizierten Zellen keine L-
spezifischen Signale sichtbar waren, die auf eine produktive Infektion
hingedeutet hätten. Dies könnte entweder dadurch bedingt sein, dass der
verwendete Antikörper die mutierten L-Proteine schlecht erkannte oder dass
tatsächlich sehr wenig L-Protein vorhanden war. Um daher die Etablierung
einer Infektion direkt zu analysieren, wurde die cccDNA-Etablierung und
Amplifikation in den infizierten Zellen untersucht.
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Ergebnisse und Diskussion
Die Etablierung einer produktiven Infektion wird durch die Bildung von
cccDNA während der Infektion charakterisiert. Die Analyse der cccDNA-Menge
fünf Tage nach der Infektion durch eine PCR, die präferentiell cccDNA
amplifiziert, zeigte, dass nur im Falle der mit wt-DHBV-infizierten Kulturen
cccDNA nachweisbar war (Abb. 3.4.7). Nach einer Infektion mit TLM-
defizienten Viren wurde die eventuell aufgenommene rcDNA nicht in cccDNA
konvertiert und so keine Infektion etabliert. Dies bestätigte die oben gezeigten
Daten des Immunblots und der Fluoreszenzfärbung (Abb. 3.4.6).
Abb. 3.4.7 Keine cccDNA-Bildung nach Infektion mit TLM-defizienten Viren.
PDHs wurden mit den rekombinanten Viren infiziert und nach fünf Tagen
wurden die Kulturen für die cccDNA-Analyse geerntet. cccDNA wurde isoliert,
ein Verdau mit Plasmid Safe-DNase durchgeführt und eine PCR durchgeführt,
die präferentiell diese virale DNA -Spezies amplifiziert.
Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass die Zerstörung von TLM2
oder beider TLMs die Infektiosität von DHBV stark reduziert. Die Bildung der
cccDNA nach Inokulation der Zellen mit TLM-defizienten Viren ist gestört.
4.1.4 Zerstörung der TLMs beeinflusst weder Bindung noch Internalisierung der
viralen Partikel
Um zu untersuchen, ob der Infektiositätsverlust der TLM-Mutanten auf eine
reduzierte Bindung an oder gestörte Internalisierung der Viren in die Wirtszellen
zurückzuführen ist, wurde ein Bindungs- und Internalisierungsassay
durchgeführt. Die primären Leberzellkulturen wurden für 2 h bei 4°C mit 100
MGE inkubiert, dann wurden die Kulturen entweder nach Waschen direkt
geerntet oder auf 37°C erwärmt, um die Aufnahme der Viren zu erlauben. Diese
Proben wurden mit Trypsin geerntet, um nur intrazelluläres Virus
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Ergebnisse und Diskussion
nachzuweisen. Alle Ansätze wurden erst mit Proteinase K verdaut und dann
eine DHBV-DNA-spezifische PCR durchgeführt.
Abb. 3.4.8 Zerstörung der TLMs beeinflusst weder Bindung noch Internalisierung der
viralen Partikel.
Mit den rekombinanten Viren wurde ein Bindungs- und Internalisierungsassay
durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen geerntet, mit Proteinase K
verdaut und eine PCR durchgeführt.
Dieser Assay zeigte, dass ähnliche Mengen Virus-DNA-haltiger Partikel nach
Inokulation mit wt-DHBV oder den Mutanten an die Zellmembran binden (Abb.
3.4.8, Spuren 1 bis 4, oben). Darüber hinaus zeigte eine Analyse der
intrazellulären viralen DNA 3 h nach Beginn des Viruseintritts in die Zellen nur
leichte Unterschiede zwischen wt-Virus und den TLM-Mutanten (Abb. 3.4.8,
Spuren 1 bis 4, unten). DHBV-D1/2 schien etwas weniger aufgenommen zu
werden als das wt-Virus und DHBV-D2; dieser leichte Unterschied würde
jedoch nicht den drastischen Infektiositätsverlust dieser Mutante erklären.
Die Daten weisen darauf hin, dass der Verlust der Infektiosität nach
Inaktivierung der TLMs weder auf eine verminderte Bindung noch auf eine
Beeinträchtigung der sehr frühen Infektionsschritte zurückzuführen ist. Der
Infektiositätsverlust der TLM-defizienten Viren muss damit auf die Inaktivierung
eines Schrittes nach Bindung und Internalisierung zurückzuführen sein.
107

Ergebnisse und Diskussion
4.1.5 Die Integrität des TLM ist für den Austritt von DHBV aus Endosomen
essentiell
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten, dass die Zerstörung der TLMs die
Infektiosität von DHBV stark herabsetzt, ohne die virale Bindung oder
Aufnahme zu beeinflussen. Unter der Annahme, dass DHBV nach Bindung an
einen Rezeptor oder Rezeptorkomplex durch Rezeptor-vermittelte Endozytose
aufgenommen wird [60, 81], wurde die Hypothese aufgestellt, dass die
Zerstörung der TLMs in der Akkumulation des Virus in endosomalen
Kompartimenten resultieren könnte. In diesem Modell wären beide TLMs,
ähnlich zu den bei anderen Viren beschriebenen Fusionspeptiden, daran
beteiligt, das Virus aus dem endosomalen Kompartiment freizusetzen. Um dies
zu untersuchen, wurden subzelluläre Kompartimente 9 h nach Inokulation der
Zellen mit den rekombinanten Viren durch differentielle Zentrifugation aus PDHs
isoliert und in der endosomalen sowie zytosolischen Fraktion in Berlin durch
Taqman-PCR die Menge der DHBV-DNA analysiert.
Abb. 3.4.9 TLM-Defizienz führt zur verminderten Freisetzung viraler DNA in das
Zytosol.
PDHs wurden mit 400 MGE der rekombinanten Viren inokuliert und 9 h bei
37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Trypsin geerntet und eine
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Ergebnisse und Diskussion
subzelluläre Fraktionierung durchgeführt. Danach wurde die virale DNA aus den
Proben isoliert und durch Taqman-PCR am Robert-Koch-Institut in Berlin
bestimmt. SA (Standardabweichung), e (endosomale Fraktion), c (zytosolische
Fraktion). Abb. zur Verfügung gestellt von E. Hildt (RKI, Berlin).
9 h nach der Inokulation zeigte die PCR ähnliche Mengen DHBV-DNA in der
endosomalen Fraktion von Zellen, die mit DHBV-D1, DHBV-D2 und DHBV-D1/2
infiziert wurden. Eine kleinere Menge wurde in Zellen gefunden, die mit dem wt-
Virus infiziert wurden (Abb. 3.4.9). Im Gegensatz dazu zeigte sich nur im Falle
der mit wt-Virus infizierten Zellen ein signifikantes Signal im Zytosol. Es wurden
keine signifikanten Mengen DNA in der zytosolischen Fraktion der mit den
Mutanten infizierten Zellen nachgewiesen (Abb. 3.4.9). Dies deutete darauf hin,
dass die TLM-defizienten Viren zwar in endosomale Kompartimente
aufgenommen werden, jedoch im Gegensatz zum wt-Virus daraus nicht
freigesetzt werden können.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Funktionalität der TLM
Voraussetzung für die Freisetzung internalisierter viraler Partikel aus dem
Endosom in das Zytosol ist.
4.2 Diskussion
Die Entdeckung des TLMs in der preS-Domäne des L-Proteins von HBV, das
Energie- und Rezeptor-unabhängig in Form eines Peptids durch Membranen
translozieren kann [181], führte zur Untersuchung der Rolle dieses Motivs im
Lebenszyklus von Hepadnaviren.
Eine Datenbankanalyse, die in Berlin am RKI von E. Hildt durchgeführt
wurde und auf den Parametern der amphipatischen Helix basierte, ergab, dass
die Oberflächenproteine aller bekannten Hepadnaviren putative TLMs in der
preS-Domäne enthalten. Auffallend war dabei, dass DHBV im Gegensatz zu
HBV und den anderen Hepadnaviren anscheinend zwei TLMs besitzt. Dies
könnte durch die unterschiedliche Organisation der Gene für die
Oberflächenproteine im Vergleich zu HBV bedingt sein. HBV besitzt die drei
Oberflächenproteine SHBs, MHBs und LHBs, wobei das TLM in MHBs und
LHBs vorkommt. DHBV besitzt nur die beiden Hüllproteine L und S, wobei die
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Ergebnisse und Diskussion
TLMs nur im L vorkommen. Der Vollständigkeit halber soll jedoch darauf
hingewiesen werden, dass aminoterminal verkürzte L-Proteine in geringer
Konzentration auch von DHBV exprimiert werden [184]. Keines dieser
verkürzten L-Proteine ist für die DHBV-Infektion essentiell [185].
Die Funktionalität der vorhergesagten TLMs wurde durch einen Assay in
Berlin bestätigt (Abb. 3.4.2). Dieser zeigte, dass die vorhergesagten TLMs eine
vergleichbare Zellpermeabilität zu dem zuerst identifizierten TLM aus dem
humanen Prototyp-Virus HBV aufweisen.
Die beobachtete Konservierung der TLMs in den Oberflächenproteinen
der verschiedenen Hepadnaviren deutet auf eine wichtige Rolle im viralen
Lebenszyklus hin. Es wurde jedoch keine Beeinträchtigung der Morphogenese
oder Sekretion viraler Partikel nach einer funktionellen Inaktivierung der TLMs
beobachtet. Dies stimmt mit dem aktuellen Modell der HBV-Morphogenese
überein, das keine Membrantranslokation beschreibt, sondern Budding-
Prozesse, die keine Zellpermeabilität benötigen [186]. Die reduzierte
Replikation im Falle von DHBV-D1 scheint auf einen sekundären Effekt
zurückzuführen sein, da die Doppelmutante, die dieselbe Mutation enthält,
keinen Replikationsdefekt zeigte. Allerdings könnte die zweite Mutation in
DHBV-D1/2 auch einen kompensatorischen Effekt auf die erste haben.
Im Gegensatz zur Morphogenese scheint die Infektiosität durch die
Inaktivierung der TLMs stark beeinflusst zu werden, die eingeführten
Mutationen führten zu einem nahezu kompletten Verlust der Infektiosität. Dieser
wurde nicht durch eine reduzierte Bindung oder Aufnahme der DHBV-Mutanten
in die Wirtszellen verursacht. Das bedeutet, dass die veränderte Struktur des
Oberflächenproteins der rekombinanten Viren keinen Einfluss auf die
Rezeptorbindung hat. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die
Bindung und die darauf folgende Internalisierung bei diesen Mutanten sich vom
normalen Aufnahmeweg des DHBV unterscheidet. Dies scheint jedoch
unwahrscheinlich, da die subzelluläre Fraktionierung sowohl das wt-Virus als
auch die Mutanten in denselben Zellkompartimenten offenbarte. Insgesamt
zeigt dies, dass die TLM-Strukturen sowohl für die virale Bindung als auch
Internalisierung entbehrlich sind. Das deutet auf einen Infektionsblock nach der
viralen Aufnahme hin.
110

Ergebnisse und Diskussion
Da die TLM-defektiven Viren in die Zellen aufgenommen wurden, jedoch
keine cccDNA gebildet wurde, kann gefolgert werden, dass der Infektionsblock
der Viren auf dem Weg von der Zelloberfläche zum Nukleus liegt, denn nur die
rcDNA eintretender Viren, die zum Nukleus gelangt, kann in cccDNA
umgewandelt werden.
Werden die viralen Partikel durch einen endozytischen Weg in die
Wirtszellen aufgenommen, liegen sie nach der Aufnahme in Endosomen vor.
Da der endosomale Aufnahmeweg oft zum Abbau der aufgenommenen
Substanzen führt, muss das aufgenommene Virus aus diesem Weg austreten.
In Endosomen könnten die TLMs nach einem bestimmten Signal exponiert
werden. Dies könnte zur Freisetzung der Viren aus dem endosomalen
Kompartiment führen. Die Exposition eines Fusionssignals während der
Infektion von Wirtszellen wurde für andere Viren beschrieben. So haben z.B.
Homotrimere des Hämagglutinins von Influenza-Viren fusogene Aktivität (als
HA0-Vorläuferproteine). Nach einer endolytischen Spaltung durch eine Furin-
ähnliche Protease entstehen HA1 und HA2. Dieser Spaltungsschritt ermöglicht
die HA-vermittelte Fusion durch Freisetzung bestimmter Sequenzen, die durch
Konformationsveränderungen Membranfusionen induzieren können [133]. Im
Falle des Poliovirus führt die Interaktion des Virus mit seinem Rezeptor zur
Freisetzung des N-myristylierten VP4-Peptids und der Exposition einer
amphipatischen Sequenz von VP1, die in die Wirtsmembran inseriert und so
den Eintritt des Virus in das Zytoplasma ermöglicht [187].
Interessanterweise benötigt die Infektiosität von DHBV die Integrität
beider TLMs. Ein Defekt in TLM2 kann nicht durch ein intaktes TLM1
kompensiert werden. Experimente mit zellpermeablen Kapsiden mit TLM-
HBcAg-Fusionsproteinen zeigten, dass die Zellpermeabilität dieser Partikel
durch die Verwendung zweier TLMs, die in einem ähnlichen Abstand liegen wie
im preS-Teil des DHBV-L, im Vergleich zu nur einem TLM stark verbessert wird
(B. Brandenburg, persönliche Mitteilung). Dies deutet darauf hin, dass beide
TLMs für eine effiziente Permeation benötigt werden und einen synergistischen
Effekt ausüben.
Die oben beschriebenen Ergebnisse könnten durch einen ähnlichen
Mechanismus bei Hepadnaviren erklärt werden. Nach einer Rezeptor-
vermittelten Endozytose des viralen Partikels und dem Eintritt in den
111

Ergebnisse und Diskussion
endosomalen Transportweg findet eine proteolytische oder pH-induzierte
Prozessierung des viralen Oberflächenproteins statt. Diese Prozessierung
könnte zu veränderten viralen Partikeln führen, die an der Oberfläche
exponierte TLMs besitzen. Diese TLMs könnten dann den Austritt des Virus aus
dem Endosom ermöglichen, bevor es zu einer Inaktivierung des Virus in einem
lysosomalen Kompartiment kommt.
In zukünftigen Studien sollte der genaue Mechanismus der
Virusfreisetzung aus dem endosomalen Kompartiment und der Beitrag der
TLMs dabei untersucht werden. Sollten die TLMs wie oben beschrieben nach
einer Proteolyse exponiert werden, könnte man nach der Exposition der Viren
mit endosomalen Kompartimenten eine Immunpräzipitation mit einem
Antikörper durchführen, der die TLMs spezifisch bindet. Außerdem sollte
untersucht werden, ob eine Translokation der Viren aus den Endosomen in das
Zytosol stattfindet, bei der die virale Membran erhalten bleibt oder ein normaler
Fusionsvorgang vorliegt, bei dem die virale mit der Wirtsmembran fusioniert.
112

Ergebnisse und Diskussion
5. Die Ausbreitung von Hepadnaviren erfolgt in vitro durch
extrazelluläre Nachkommensviren
Wenn Entenküken mit einer niedrigen MOI mit DHBV infiziert werden, sind
innerhalb kurzer Zeit (etwa eine Woche) alle Hepatozyten in der Leber infiziert
[188]. Die Art der viralen Ausbreitung muss sehr effizient sein, besonders wenn
man die Größe der Leber mit etwa 10 11 Hepatozyten berücksichtigt. In vivo
werden oft Gruppen Virus-replizierender Zellen in der frühen Phase einer
Infektion beobachtet [189]. Zusätzlich können ähnliche Cluster auch in
Primärkulturen von Hepatozyten beobachtet werden (eigene Beobachtung und
die anderer Arbeitsgruppen). Zusammengenommen legen diese
Beobachtungen indirekt nahe, dass Hepatitis B-Viren direkt von einer infizierten
Zelle auf eine nicht-infizierte Zelle übertragen werden und deuten auf eine
Bewegung der Nachkommensviren außerhalb der infizierten Zelle hin, die nicht
nur durch Diffusion kontrolliert sein kann. Auf der anderen Seite ist bekannt,
dass eine große Menge von Virionen und subviralen Partikeln von infizierten
Zellen in den extrazellulären Raum sekretiert werden. Dort sollte freie Diffusion
die Infektion weit entfernt gelegener Zellen ermöglichen. Um solide
Informationen über die Art der viralen Ausbreitung innerhalb einer primären
Leberzellkultur zu erhalten, wurden die folgenden Untersuchungen
durchgeführt.
Es wurde analysiert, ob bei Hepatitis B-Viren für die Übertragung ihrer
Nachkommensviren von einer infizierten auf eine nicht-infizierte Zelle nur
intrazelluläres Virus verantwortlich ist oder ob die Sekretion von
Nachkommensviren in den extrazellulären Raum zur Verbreitung der Infektion
beiträgt. Im ersten Fall sollte die Ausbreitung der Infektion in einer Zellkultur
nicht durch den Einsatz neutralisierender Antikörper oder Substanzen, die die
Bindung der Viren an ihre Zielzellen hemmen, beeinträchtigt werden. Die
intrazellulären Viren wären vor diesen Substanzen geschützt und bräuchten
außerdem nicht an die Oberfläche einer Zielzelle zu binden, um diese zu
infizieren. Für die Untersuchungen wurden verschiedene neutralisierende
Antiseren [190, 191] sowie die synthetische Substanz Suramin eingesetzt. Wie
in Kapitel III.3.1 gezeigt, vermindern diese Substanzen die Bindung viraler
113

Ergebnisse und Diskussion
Partikel und die anschließende Infektion stark und waren damit geeignet, die
Ausbreitung von Hepadnaviren in Zellkultur zu untersuchen.
5.1 Ergebnisse
5.1.1 Neutralisierende Antikörper und Suramin verhindern die virale
Ausbreitung in vitro
PDHs wurden mit DHBV infiziert, und drei Tage später wurde dem
Zellkulturüberstand Suramin oder preS-Antiserum zugegeben. Am Tag 3 war
die produktive DHBV-Infektion in den Hepatozyten etabliert und die ersten
Nachkommensviren sollten freigesetzt werden. Drei Tage nach dem Beginn der
Behandlung wurden die Zellen dann fixiert und das L-Protein als Indikator für
die produktive Infektion durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung
mikroskopisch analysiert.
114

Ergebnisse und Diskussion
Abb. 3.5.1 Neutralisierende Antikörper und Suramin verhindern die virale Aus-
breitung in vitro.
PDHs wurden mit DHBV infiziert und drei Tage später der neutralisierende
Antikörper DPSI oder Suramin zugegeben, um eine Ausbreitung durch
freigesetzte Viren von den primär infizierten Zellen auf nicht-infizierte Zellen zu
verhindern. Das Medium wurde täglich gewechselt und neue Substanzen
zugegeben. Nach drei Tagen wurden die Zellen fixiert und die infizierten Zellen
durch Immunfärbung des L-Proteins analysiert. A zeigt eine 10-fache Ver-
größerung der Kulturen, B eine 40-fache.
Die L-Färbung zeigte, dass in infizierten, unbehandelten PDH-Kulturen die
infizierten Zellen nicht zufällig in der Kultur verteilt waren, sondern in Gruppen
angeordnet waren (Abb. 3.5.1 A). In jeder dieser Gruppen waren eine oder
mehrere Hepatozyten am stärksten gefärbt, diese waren von weniger stark
gefärbten Zellen umgeben. Die Behandlung der Kulturen mit neutralisierenden
Antiseren verhinderte diese Gruppenbildung, es konnten hauptsächlich stark
gefärbte Zellen beobachtet werden (Abb. 3.5.1). Suramin hatte denselben
Effekt in den behandelten Kulturen.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die verwendeten Reagenzien
die virale Ausbreitung verhinderten, indem sie negativ auf die intrazelluläre
virale Replikation oder die Sekretion der Nachkommensviren wirkten, wurde die
persistent DHBV-produzierende LMH-Zelllinie D2 für drei Tage kontinuierlich
mit Suramin oder neutralisierendem preS-Antikörper behandelt. Anschließend
wurden die Kulturen sowie die Zellkulturüberstände geerntet und die virale DNA
und L-Protein analysiert.
115

Ergebnisse und Diskussion
Abb. 3.5.2 preS-Antikörper und Suramin beeinträchtigen weder virale Sekretion noch
Replikation.
Die DHBV-replizierende Zelllinie D2 wurde mit dem preS -spezifischen
Antiserum KpnI oder Suramin für drei Tage kontinuierlich behandelt. Danach
wurden die Zellkulturüberstände und die Zellen geerntet. (A) PCR-Analyse der
viralen DNA in den Überständen. 5 µl der Überstände wurden in PCR-
Lysepuffer aufgenommen und für eine DHBV-DNA-spezifische PCR eingesetzt.
Amplifizierte Produkte wurden auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten
Agarosegel nach der Elektrophorese visualisiert. (B) Immunblot-Analyse des
intrazellulären L-Gehalts. Behandelte Zellen wurden in Lämmli-Lysepuffer lysiert
und für einen L-Immunblot eingesetzt.
Es konnte weder ein Effekt auf die virale Sekretion (Abb. 3.5.2 A) noch auf die
L-Expression (Abb. 3.5.2 B) beobachtet werden. Dies spricht gegen einen
Effekt der Substanzen auf virale Replikation oder Sekretion.
Die oben beschriebenen Daten zeigen, dass Hepadnaviren von einer
primär infizierten Hepatozyte auf eine nicht-infizierte Zelle übertragen werden,
indem sie von der ersten Zelle in den extrazellulären Raum freigesetzt werden
und dann eine andere Zelle infizieren.
Es blieb jedoch offen, warum Gruppen infizierter Zellen beobachtet
wurden. Dies sollte nicht der Fall sein, wenn die Ausbreitung nicht über
Zellverbindungen erfolgt, sondern nur durch sekretierte Nachkommensviren.
Diese könnten an zufälligen Stellen der Plasmamembran einer infizierten Zelle
freigesetzt werden, von wo aus sie ungehindert im extrazellulären Raum
diffundieren oder weggeschwemmt werden können. Eine Erklärung für die
116

Ergebnisse und Diskussion
Gruppenbildung könnte eine polarisierte Ausschleusung der Nachkommens-
viren in interzelluläre Kompartimente sein. Diese Kompartimente würden eine
freie Diffusion der Viren verhindern, jedoch zugänglich für neutralisierende
Antikörper und Suramin sein. Wenn diese Annahme korrekt ist, so müsste man
annehmen, dass Nachkommensviren nicht an zufälligen Stellen der
Plasmamembran sekretiert werden, sondern präferentiell an spezifischen
Regionen. Dies ist gut vorstellbar, da polarisierter Egress für andere Viren wie
HIV schon gezeigt wurde [192] und insbesondere Hepatozyten für ihre stark
polarisierte Organisation bekannt sind [193, 194].
Um einen ersten Hinweis auf den oben genannten Egress und den
Modus der sekundären Infektion zu erhalten, wurden elektronenmikroskopische
und Immunfluoreszenz-Analysen durchgeführt.
Abb. 3.5.3 Elektronenmikroskopische Aufnahme der intrazellulären Verteilung von
viralen Partikeln in PDHs.
Chronisch infizierte PDHs wurden sieben Tage nach Ausplattierung fixiert und
für die Elektronenmikroskopie präpariert. Eine Detailansicht des Zytoplasmas
der infizierten Zelle ist gezeigt mit zwei einzelnen Vesikeln (Pfeile), Virionen
(weiße Pfeilspitzen) und einer Anzahl von SVPs (offene Pfeilspitzen). Die
Abbildung wurde von H. Hohenberg (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg) zur
Verfügung gestellt.
117

Ergebnisse und Diskussion
Die ultrastrukturelle Analyse offenbarte, dass Virionen (Abb. 3.5.3, weiße
Pfeilspitzen) und subvirale Partikel (Abb. 3.5.3, offene Pfeilspitzen) in
Membran-umgebenen, zytoplasmatischen Vesikeln und dort in einigen auch
gemeinsam zu finden sind (Abb. 3.5.3, Pfeile). Wie erwartet sind Virionen in
den Vesikeln zahlenmäßig weit unterrepräsentiert.
Abb. 3.5.4 Konfokale, mikroskopische Analyse der zellulären L-Protein-Verteilung in
PDHs.
Kulturen auf Glasplättchen wurden infiziert und sieben Tage später fixiert. Eine
indirekte Immunfluoreszenzfärbung für das virale L-Protein wurde durchgeführt
und mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop analysiert. Ausgesuchte
Schnitte derselben Gruppe von Zellen (1 bis 6, von apikal nach lateral) sind
gezeigt. Die Pfeilspitzen zeigen die Färbung der Plasmamembran, die Pfeile
zeigen partikelgefüllte Vesikel in den Hepatozyten.
Die L-Immunfärbung infizierter Hepatozyten zeigte ein punktförmiges Muster,
das konsistent mit den elektronenmikroskopischen Aufnahmen war. Es wies
zusätzlich darauf hin, dass präformierte, virale Partikel sub-kompartimentalisiert
in vesikulären Strukturen im Zytoplasma vorkommen (Abb. 3.5.4, Pfeilspitzen).
Die Untersuchung einer kleinen Kolonie von infizierten Hepatozyten durch
konfokale Laserscanning-Mikroskopie mit Schnitten von etwa 0,3 µm Dicke
118

Ergebnisse und Diskussion
ergab, dass die L-haltigen Vesikel nicht zufällig im Zytoplasma verteilt sind. Sie
akkumulieren präferentiell an der basolateralen Seite der Zytoplasmamembran
(Abb. 3.5.4, Pfeile). Darüber hinaus war auch eine starke Färbung der
Plasmamembran sichtbar (Abb. 3.5.4, Pfeilspitzen).
5.2 Diskussion
Wie im vorangehenden Ergebnis-Teil gezeigt, verhinderten sowohl
neutralisierende Antikörper als auch Suramin die Ausbreitung von
Hepadnaviren in Zellkultur. Voraussetzung dafür war, dass diese Substanzen
die Bindung der Viren an ihre Wirtszellen blockierten, jedoch nicht mit späteren
Schritten der Infektion interferierten. Unspezifische Effekte der Substanzen auf
die Infektion konnten ausgeschlossen werden, da eine Behandlung, nachdem
Inokulum zur Zellkultur gegeben wurde, keinen Effekt auf die Infektion hatte. Es
scheint ebenso unwahrscheinlich, dass die Substanzen intrazellulär wirkten, da
in D2-Zellen kein Effekt auf eine bestehende Infektion beobachtet wurde.
Wurden infizierte Zellkulturen nach 6 Tagen fixiert und für L gefärbt, so
waren in der Immunfluoreszenzfärbung unterschiedlich stark leuchtende
Hepatozyten erkennbar. Besonders stark leuchtende Zellen waren oft von
weniger stark leuchtenden Zellen umgeben. Erstere exprimierten sehr
wahrscheinlich größere Mengen L als letztere. Sie stellten daher vermutlich die
primär infizierten Zellen dar, von denen die Nachkommensviren produziert und
benachbarte Zellen infiziert wurden. In enger Nachbarschaft zu diesen Zellen
waren weniger stark gefärbte Hepatozyten sichtbar, die in größerer Zahl als die
stark gefärbten Zellen vorhanden waren. Dies ließ vermuten, dass sie von den
Nachkommensviren der primär infizierten Zellen infiziert wurden. In den mit
Suramin oder neutralisierenden Antikörpern behandelten Zellkulturen fehlten
diese sekundär infizierten Hepatozyten weitgehend. Dies deutete darauf hin,
dass sekretierte Nachkommensviren von den neutralisierenden Antikörpern
inaktiviert werden. Sie waren offensichtlich für die Antikörper zugänglich. Das
erhaltene Ergebnis lässt es sehr unwahrscheinlich erscheinen, dass
Hepadnaviren ihre Nachkommensviren durch direkten Transport von infizierter
Zelle zu nicht-infizierter Zelle verbreiten. Die Wirksamkeit von Suramin in diesen
119

Ergebnisse und Diskussion
Versuchen zeigt, dass Nachkommensviren sezerniert werden, die anschließend
an die Zelloberfläche nicht-infizierter Zellen binden und diese dann infizieren.
Zusammen weisen die Daten darauf hin, dass Hepadnaviren zuerst von
der primär infizierten Hepatozyte in den extrazellulären Raum freigesetzt
werden und dann an die Oberfläche einer nicht-infizierten, benachbarten Zelle
binden müssen, um eine erfolgreiche Verbreitung ihrer Nachkommen zu
garantieren. Die elektronenmikroskopischen und Fluoreszenzfärbungsanalysen
unterstützen diese Annahmen. Virale Partikel wurden nur in zytoplasmatischen
Vesikeln gefunden. Keine einzelnen freien Partikel konnten beobachtet werden.
Diese Partikel könnten leicht durch direkte Zell-Zell-Verbindungen übertragen
werden. Die virushaltigen Vesikel werden wahrscheinlich an die Zellmembran
transportiert, um dort ihren Inhalt freizusetzen. Folglich wurden auch die
meisten Vesikel in Nähe der Zytoplasmamembran infizierter Hepatozyten
gefunden. Obwohl einige wenige Vesikel nahe der apikalen Membran
vorhanden waren, waren die meisten in Nähe der basolateralen lokalisiert.
Wenn diese Viruspartikel-gefüllten Vesikel mit der Plasmamembran fusionieren,
würden Virionen und subvirale Partikel zusammen und gerichtet in den
basolateral lokalisierten, extrazellulären Raum freigesetzt. Dies könnte die
Erklärung dafür sein, dass freie Diffusion der viralen Partikel nicht stattfindet
und bevorzugt benachbarte Zellen infiziert werden.
In zukünftigen Untersuchungen könnte die genaue Stelle der viralen
Sekretion bestimmt werden. Dazu könnten z.B. Immunfluoreszenzstudien mit
Antikörpern gegen Marker der unterschiedlichen Membranen (z.B. apikal vs.
lateral) durchgeführt werden, die eine präferentielle Lokalisierung der
virushaltigen Vesikel in der Zelle aufzeigen könnten.
120

IV. Material und Methoden
1. Material
1.1 Chemikalien
Material und Methoden
Sofern nicht anders angegeben, wurden die Chemikalien der Firmen Sigma (Deisenhofen),
Roche Diagnostics (Mannheim), Roth (Karlsruhe), Biozol (München), Serva (Heidelberg) und
Merck (Darmstadt) verwendet. Radioaktive Reagenzien wurden von der Firma Hartmann
Analytik (Göttingen) bezogen.
Die verwendeten Chemikalien wiesen den Reinheitsgrad ‚reinst’ oder ‚zur Analyse’ auf.
Alle Medien, Puffer und Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser aus einer Wasser-
aufbereitungsanlage RO 35 TS-System von Millipore angesetzt.
1.2 Häufig verwendete Puffer und Lösungen
Blocking-Reagenz 3 % Trockenmilch
500 ml 1 x TBS
0,1 % Tween ® 20
DNA-Probenpuffer 30 % Glyzerin
6 x 60 mM EDTA
6 mM Tris, pH 7
Lämmli-Lysepuffer 100 mM Tris, pH 6,8
[195] 20 % Glyzerin
2 % SDS
0,1 % Bromphenolblau
0,2 % ß-ME
PBS 140 mM NaCl
10 x; pH 7,4 8 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4
3 mM KCl
121

PCR-Lysepuffer 50 mM KCl
Material und Methoden
[60] 10 mM Tris, pH 8,3
0,45 % Tween ® 20
0,45 % Nonidet P-40
SDS-Elektrodenpuffer 250 mM Tris
1 x 19 mM Glyzin
0,35 mM SDS
SSC 3 M NaCl
20 x 300 mM C6H5Na3O7 . 2H2O
TAE 800 mM Tris
20 x 40 mM EDTA
TBS 10 mM Tris
10 x; pH 7,4 100 mM NaCl
TBST (TBS plus Tween ® 20) 10 mM Tris
1 x, pH 7,4 100 mM NaCl
0,1 % Tween ® 20
TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, pH 8,1
1 mM EDTA
Transferpuffer für Immunblots 48 mM Tris
39 mM Glyzin
20 % Methanol
Weitere Lösungen und Puffer sind in den entsprechenden Abschnitten aufgeführt.
1.3 Nährmedien
1.3.1 Nährmedien für Bakterien
Standard I-Medium 15 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
1 g/l Glukose
6 g/l NaCl
122

Material und Methoden
Das Medium wurde als Fertigpulver geliefert (Merck, Darmstadt). Zur Herstellung des
Flüssigmediums wurden 25 g Pulver in 1 l ddH2O gelöst und autoklaviert. Zur Herstellung von
Agarplatten wurden dem Medium vor dem Autoklavieren 1,5 % Bacto-Agar (Difco, USA)
zugesetzt. Zur Herstellung von Selektionsmedium oder –Platten wurden dem autoklavierten,
abgekühlten Medium 30 µg/ml Kanamycin oder 100 µg/ml Ampicillin zugesetzt.
1.3.2 Medien für eukaryotische Zellen
Alle Substanzen für die Zellkultur stammten von Gibco BRL (USA), Sigma (Mannheim) oder
Biochrom (Berlin). Die flüssigen Nährmedien wurden vor der Verwendung wie folgt
supplementiert:
DMEM 10 % Hitzeinaktiviertes FCS
für LMH und D2 1 mM Natriumpyruvat
2 mM Glutamin
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
Williams’ Medium E 1,5 % DMSO
für PDHs 1 nM Insulin
10 µM Hydrokortison
15 mM HEPES, pH 7,2
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
Trypsin-Lösung 0,25 % Trypsin
1 mM EDTA-4Na
Alle eukaryotischen Zellen wurden unter einer Wasserdampf-gesättigten 5 % CO2-Luft-
Atmosphäre und bei 37°C kultiviert.
1.4 Biologisches Material
1.4.1 Bakterienstämme
XL1 blue (Stratagene) wurde für die Amplifikation von Plasmiden verwendet,
Genotyp: recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17,
supE44, relA1, lac [F'proAB lacI q Z?M15 Tn10 (Tet r )]
123

1.4.2 Eukaryotische Zellen
LMH Hepatomzelllinie aus Hühnern
Material und Methoden
D2 Hepatomzelllinie aus Hühnern (LMH), die stabil mit dem DHBV-Genom
transfiziert ist (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von J. Summers und W.
Mason, USA)
PDHs primäre Entenhepatozyten aus Entenembryonen, primary duck hepatocytes
1.4.3 Viren
Enten-Hepatitis B-Virus Als Inokulum diente DHBV-haltiges Gänseserum, das ungefähr
1.5 Antikörper
1.5.1 Primärantikörper und Antiseren
1,1 x 10 10 Genomäquivalente pro ml enthielt, wie durch eine Dot
Blot-Analyse von viralen Partikeln in Fraktionen nach CsCl-
Gradientenzentrifugation festgestellt wurde. Die ungefähre Zahl
der SVPs wurde mittels eines kalibrierten Immunblots bestimmt,
bei dem gereinigtes, rekombinantes preS-Peptid
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von S. Urban,
Universität Heidelberg) als Standard diente. Die Berechnungen
basierten auf der Annahme, dass von den ca. 100 viralen
Oberflächenproteinen ungefähr 20 L-Proteine sind [25, 50] und
ergaben für das verwendete Serum ungefähr 10 13 SVPs/ml.
Bezeichnung Spezies Antigen Herkunft/Referenz
anti-PreS-KpnI Kaninchen PreS-Teil des L (AS 44-
185) von DHBV
anti-PreS-1-41 Kaninchen PreS-Teil des L (AS 1-
41) von DHBV
anti-PreS-DPSI Kaninchen PreS-Teil des L (AS 1-
131) von DHBV
[184]
S. Urban, Heidelberg
[191]
anti-Core D103 Kaninchen Core-Protein H. Schaller, Heidelberg
anti-Aktin Maus Aktin Sigma, Deisenhofen
anti-GFP Kaninchen GFP Santa Cruz Biotechnology,
USA
anti-Caveolin-1 Kaninchen Caveolin Abcam, UK
124

Material und Methoden
Bezeichnung Spezies Antigen Herkunft/Referenz
anti-Caveolin-1 Kaninchen Caveolin Transduction Laboratories,
1.5.2 Sekundärantikörper
Bezeichnung Spezies Konjugat Herkunft
anti-Maus-HRPO Ziege HRPO Dianova, Hamburg
anti-Kaninchen-HRPO Ziege HRPO Dianova, Hamburg
anti-Maus-488 Ziege Alexa 488 Molecular Probes, Niederlande
anti- Kaninchen-488 Ziege Alexa 488 Molecular Probes, Niederlande
anti-Maus-594 Ziege Alexa 594 Molecular Probes, Niederlande
anti- Kaninchen-594 Ziege Alexa 594 Molecular Probes, Niederlande
anti-Maus IgG Kaninchen Ohne Sigma, Deisenhofen
1.6 Molekularbiologische Materialien
1.6.1 Synthetische Oligonukleotide
Primer 1: 5’-GCG CTT TCC AAG ATA CTG GAG CCC AA-3’
Primer 2: 5’-CTG GAT GGG CCG TCA GCA GGA TTA TA -3’
Primer 3: 5’-CCC TGT GTA GTC TGC CAG AAG TCT TC -3’
Die Sequenzen der Primer stammen aus [60]. Sie wurden von Invitrogen bezogen.
1.6.2 Plasmide
Plasmidname Inhalt Referenz/Herkunft
DHBV16t-27 Tandem-Sequenz des DHBV-
Genoms 16
DHBV wt 1,2-faches Genom des DHBV,
pDHBV16/1.1
DHBV D1 Wie oben, Punktmutationen in
preS -Region (siehe Kapitel III.4)
DHBV D2 Wie oben, Punktmutationen in
preS -Region (siehe Kapitel III.4)
USA
Kaninchenserum Kaninchen HIPK2 H. Sirma, Hamburg
[196]
[51]
E. Hildt, Berlin
E. Hildt, Berlin
125

Material und Methoden
Plasmidname Inhalt Referenz/Herkunft
DHBV D1/2 Wie oben, Punktmutationen in
1.6.3 Enzyme und Kits
Enzym Herkunft
Proteinase K (PCR grade) Roche Diagnostics, Mannheim
Plasmid Safe-DNase Epicentre, UK
Taq-Polymerase Invitrogen, USA
Kollagenase Roche, Mannheim
Zur Herstellung radioaktiver Sonden wurde das ‚Readyprime II Random Prime Labeling System’
von Amersham Pharmacia, Heidelberg, verwendet.
Für die Präparation von Plasmiden wurde das ‚Plasmid Maxi Kit’ von Qiagen, Hilden,
eingesetzt. Die Isolierung viraler DNA aus subzellulären Fraktionen erfolgte mit dem ‚High Pure
Viral Nucleic Acid Kit’ von Roche, Mannheim.
Für die Chemilumineszenz-Detektion wurde das ‚ECL Western Blotting Detection
System’ von Pierce, USA, verwendet.
1.6.4 Verwendete Substanzen und Inhibitoren
Name Arbeitskonzentration Lösungsmittel Herkunft
Calpaininhibitor I 10 µM DMSO Sigma
Cholera Toxin Unter-
einheit B (CTB)
preS -Region (siehe Kapitel III.4)
E. Hildt, Berlin
Tubulin-GFP Tubulin mit GFP fusioniert Clontech, USA
4 µg/ml H2O Sigma
Cytochalasin D 20 µM DMSO Sigma
Dichlorisocoumarin 10 µM DMSO Sigma
Filipin III 10 µg/ml H2O Sigma
FITC-CTB 4 µg/ml H2O Sigma
Fluoreszein-Diazetat ca. 1 µg/ml DMSO Sigma
preS -Peptid (AS 1-165) 0,47 µg/ml H2O S. Urban
Methyl-ß-Cyclodextrin 10 mM H2O Sigma
Mevinolin 10 µM DMSO Sigma
MG132 10 µM DMSO Sigma
Nocodazol 16,5 µM DMSO Sigma
Nystatin 100 µg/ml H2O Calbiochem
Paclitaxel 10 µM DMSO Molecular Probes
126

Material und Methoden
Name Arbeitskonzentration Lösungsmittel Herkunft
Suramin 100 µg/ml DMSO Sigma
TRITC-Phalloidin 4 µg/ml H2O Molecular Probes
Wasserlösliches
Cholesterin
Die Arbeitskonzentrationen wurden durch Eskalationsstudien ermittelt und der Literatur
entnommen. Alle Substanzen außer CTB (4°C) wurden bei -20°C gelagert.
1.7 Geräte
5 µg/ml H2O Sigma
Bild-Scanner UMAX, Taiwan
Filmentwickler Agfa Curix 60 PMA Bode, Hamburg
Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena
Fluor-S MultiImager Bio-Rad, USA
Fraction Recovery System Beckman, USA
Konfokales Laserscanningmikroskop LSM 510 Meta Zeiss, Jena
Mini-Ultrazentrifuge Sorvall Discovery M120 Hitachi, Japan
Mikroskop Olympus, Japan
PhosphoImager Fujix Bas Raytest, Straubenhardt
Photometer 3.000 pro Pharmacia, Freiburg
Photosystem für Gelaufnahmen MWG, Ebersberg
RoboCycler Gradient 40 Stratagene, Niederlande
SDS-PAGE-Apparatur Amersham, Freiburg
Semi-Dry-System Trans-Blot SD Bio-Rad, USA
Tischzentrifuge Centrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge Centrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg
Ultrazentrifuge Optima LE-80K Beckman, USA
UV-Stratalinker Stratagene, Niederlande
127

2. Methoden
2.1 Zellkultur von Zelllinien und PDHs
Material und Methoden
Alle Arbeiten in Zusammenhang mit der Zellkultur erfolgten in einer Sterilbank zur Vermeidung
bakterieller oder sonstiger Kontaminationen. Die verwendeten Medien und Chemikalien wurden
mit sterilen Lösungsmitteln angesetzt, sterilfiltriert oder autoklaviert. Alle Plastikwaren, die in der
Zellkultur verwendet wurden, stammten von Falcon, USA.
Zum Passagieren von nahezu konfluent gewachsenen LMH- oder D2-Zellen in 250 ml
Kulturflaschen wurde das Medium vollständig abgesaugt und die Zellen mit 0,25 % Trypsin-
EDTA-Lösung überschichtet. Die Lösung wurde durch Schwenken verteilt und wieder
abgesaugt. Dann folgte eine Inkubation für 2 min bei 37°C. Das Ablösen der Zellen wurde unter
dem Mikroskop kontrolliert und die Zellen durch Klopfen von der Kulturflasche gelöst. Der
Zellrasen wurde anschließend vorsichtig mit Medium abgespült und ein Zehntel der Suspension
in eine neue Kulturflasche zur weiteren Kultivierung gegeben. Primäre Entenhepatozyten
wurden nach der ersten Ausplattierung nicht passagiert.
2.1.1 Transfektion
Um Mikrotubuli in primären Entenhepatozyten sichtbar zu machen, wurden die Zellen zwei
Tage, nachdem sie auf Glasplättchen ausgesät wurden, mit 4 µg Plasmid transfiziert. Dieses
Plasmid kodierte für das Fusionsprotein Tubulin-GFP (Clontech, USA) und machte so die
Untersuchung der Mikrotubuli ohne die Anwendung einer indirekten Immunfluoreszenzfärbung
möglich. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe von FuGENE 6 (Roche, Mannheim) nach den
Angaben des Herstellers. 80 µl Kulturmedium ohne Zusätze und 20 µl FuGENE 6 wurden
vermischt, bevor 4 µg der Plasmid-DNA zugegeben wurden. Nach einer Inkubation für 5 min bei
Raumtemperatur wurde der Ansatz auf die Zellen gegeben. Einen Tag nach der Transfektion
wurde das Medium gewechselt und die Transfektionseffizienz mit einem Lebendzellmikroskop
bestimmt. Diese lag bei ca. 1 % der Zellen. Anschließend wurden die Zellen mit Nocodazol
behandelt, um den Effekt der Substanz auf die Mikrotubuli untersuchen zu können.
2.1.2 Produktion und Ernte rekombinanter Hepadnaviren
Rekombinante Hepadnaviren können nach Transfektion von wt-DHBV- oder von mutierten
DHBV-Genomen in LMH-Zellen aus dem Zellkulturüberstand gewonnen werden. In der
Hühnerkarzinomzelllinie laufen alle späten Schritte einer Infektion so ab, dass komplette Viren
und subvirale Partikel assembliert und anschließend auch sekretiert werden.
128

Material und Methoden
LMH-Zellen wurden nicht-konfluent in einer 6-Vertiefungsplatte ausplattiert. Am
nächsten Tag wurde das Medium gewechselt und die Zellen transfiziert. Pro Platte wurde ein
Konstrukt verwendet. Es wurden pro Vertiefung 2 µg Plasmid-DNA mit Hilfe von FuGENE 6
nach den Angaben des Herstellers transfiziert. Am nächsten Tag wurde das Medium
gewechselt. Etwa drei Tage nach der Transfektion wurde begonnen, den Kulturüberstand der
transfizierten Zellen zu sammeln, ab diesem Zeitpunkt sollten die rekombinanten Viren
sekretiert werden. Der Überstand wurde über drei bis vier Tage gesammelt. Anschließend
wurden die Zellen für die Analyse der viralen DNA (replikative Intermediate) geerntet und die
Viren im Zellkulturüberstand mit PEG gefällt (siehe IV.2.9.1).
2.2 Anlegen einer Kultur primärer Entenhepatozyten
Hepadnaviren sind nicht in der Lage, Zelllinien zu infizieren. Wichtige Wirtsfaktoren, die für die
Etablierung einer produktiven Infektion essentiell sind, scheinen in diesen Zellen zu fehlen. Um
Infektionsversuche durchführen zu können, mussten primäre Hepatozyten als Wirtszellen für
das Enten-Hepatitis B-Virus präpariert werden.
2.2.1 Präparation von primären Entenhepatozyten
Um Entenhepatozyten für Infektionsversuche zu isolieren, wurden Enteneier 21 Tage bei 37°C
und wasserdampfgesättigter Atmosphäre in einem Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden
die embryonierten Eier geöffnet, die Leber der Embryonen entfernt und in kleine Stücke
geschnitten. Die Homogenate wurden dann in je 3 ml einer sterilen Kollagenase-Lösung (0,5 %
Kollagenase in Williams’ Medium E) gegeben und für 45 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert,
um den Zellverband zu zerstören und die Zellen zu vereinzeln. Dabei wurden die Röhrchen in
Abständen von 5 min geschüttelt. Danach wurden die Zellen bei 800 rpm für 4 min
abzentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet in 5 ml Williams’ Medium E ohne Zusätze
resuspendiert, um die Zellen von Verunreinigungen zu befreien. Die Waschschritte wurden
insgesamt dreimal wiederholt. Das resultierende Zellpellet wurde in Wachstumsmedium (siehe
IV.1.4.2) aufgenommen und normalerweise auf 12-Vertiefungs -Platten mit einer Zelldichte von
ca. 5 x 10 5 Hepatozyten pro Vertiefung ausplattiert. Dabei wurde darauf geachtet, dass DHBV-
positive und -negative Lebern (siehe IV.2.2.2) getrennt wurden. Nachdem sich die Zellen
abgesetzt hatten (ca. 4 h nach Ausplattierung), wurde das Medium gewechselt. Typischerweise
wurden für folgende Versuche Kulturen verwendet, die drei bis fünf Tage alt waren, und jeden
Tag das Medium gewechselt.
Die Primärkulturen, die für Infektionsexperimente verwendet wurden, waren
Mischkulturen, in denen die Hepatozyten neben anderen Zellen der Leber (sog. Nicht-
Parenchymzellen) vorkamen. Bis zu 30 % der Leberzellkultur bestand aus Nicht-Parenchym-
zellen.
129

2.2.2 Protein-Dot Blot zum Nachweis DHBV-infizierter Lebern
Material und Methoden
Vor Beginn der Experimente mit den primären Entenhepatozyten wurde überprüft, ob eine
DHBV-Infektion der verwendeten embryonalen Lebern vorlag. Dies wurde mit Hilfe des Protein
Dot-Blot getestet, diese Art des Immunblot verzichtet auf die Auftrennung der Proteine in einer
SDS-PAGE.
Serum der verwendeten Entenembryonen wurde in PBS seriell verdünnt und mit Hilfe
einer Dot Blot-Apparatur auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht. Die Apparatur wurde
folgendermaßen aufgebaut: Zuerst wurde ein in 1 x PBS angefeuchtetes 3 MM Whatmanpapier
aufgelegt, dann folgte die angefeuchtete Membran. Die Dot Blot-Apparatur wurde
zusammengesetzt und ein Unterdruck in der Auffangkammer erzeugt. Die Dots wurden einmal
mit PBS gewaschen, anschließend die Proben (50 µl Volumen) aufgedottet und wieder
gewaschen. Als Positivkontrolle wurde immer ein bekanntes, virämisches Serum verwendet.
Die Membran wurde aus der Apparatur genommen und getrocknet. Dann wurde kurz mit
Blocking-Reagenz inkubiert und sofort danach der Primärantikörper PreS-KpnI zugegeben.
Dieser Antikörper war 1:20.000 in Blocking-Reagenz verdünnt. Nach 30 min Inkubation bei
Raumtemperatur wurde die Membran kurz mit TBST gewaschen und anschließend mit dem
Sekundärantikörper (Verdünnung 1:20.000, anti-Kaninchen) 30 min inkubiert. Die Membran
wurde dann dreimal mit TBST gewaschen und das Signal mit dem ECL-System (Pierce, USA)
auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht.
2.3 DHBV-Bindung, Internalisierung und produktive Infektion
2.3.1 Bindungs- und Interferenzassay
Um den Effekt von Suramin auf die Bindung der Viren zu untersuchen, die an die Zelloberfläche
der PDH-Kulturen binden, wurden die Zellen entweder für 1 h mit 100 µg/ml Suramin
vorbehandelt oder nicht behandelt. Anschließend wurden sie mit virämischem Serum inokuliert,
so dass 220 GE pro Zelle erreicht wurden. Danach wurden die Zellen für 2 h bei 4°C inkubiert,
um die virale Bindung, jedoch nicht die Aufnahme zu erlauben. Nach gründlichem Waschen
wurden die Zellen in PCR- oder Lämmli-Lysepuffer geerntet.
Um den Effekt neutralisierender Antikörper auf die virale Bindung zu untersuchen,
wurde das Inokulum mit 10 µl der Antiseren DPSI, KpnI, Kaninchen-Kontrollserum oder 20 µg
gereinigtes IgG für 30 min bei 37°C inkubiert und dann auf die Zellen gegeben. Die Kulturen
wurden 2 h bei 4°C inkubiert, dann mit PBS gewaschen und in 200 µl PCR- oder Lämmli-
Lysepuffer geerntet.
Für die Analyse der GE-Abhängigkeit und Sättigung der viralen Bindung, wurden PDHs
mit verschiedenen Mengen virämischen Serums wie oben beschrieben inkubiert und geerntet
oder die Inkubationszeit bei 4°C wurde verändert.
130

Material und Methoden
Um zu untersuchen, ob DHBV an lipid rafts bindet, wurden die Zellen zuerst mit kaltem
Medium gewaschen. Dann wurde virämisches Serum zugegeben und die Zellen mit dem Virus
für 2 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen extensiv mit eiskaltem PBS
gewaschen und entweder direkt geerntet oder für verschiedenen Zeitspannen bei 37°C
inkubiert und dann geerntet. Für die Ernte wurden die Zellen mit eiskaltem PBS gewaschen und
die Zellen in 1 ml eiskaltem TNE -X-Puffer (siehe IV.2.6.2) aus der Vertiefung geschabt.
Anschließend wurden Detergenz-unlösliche Membrandomänen isoliert (siehe IV.2.6.2).
2.3.2 Internalisierungs- und Protease-Schutzassay
Um die Internalisierung viraler Partikel untersuchen zu können, wurde ein
Internalisierungsassay etabliert. Nach der oben beschriebenen Bindung der viralen Partikel an
die Zelloberfläche, wurden die Zellen gewaschen, um das Inokulum zu entfernen. Dann wurde
neues Medium zugegeben und die Kulturen für verschiedene Zeitspannen bei 37°C inkubiert. In
dieser Zeit sollte das an die Zelloberfläche gebundene Virus in das Zellinnere aufgenommen
werden. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde das Medium abgenommen, die Zellen
gewaschen und 1 ml 0,25 % Trypsinlösung (Gibco BRL, USA) zugegeben. Die Kulturen wurden
5 min bei 37°C inkubiert, anschließend in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und durch
Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wurde entweder in 200 µl PCR- oder Lämmli-Lysepuffer
lysiert.
Sollte die Lokalisierung der viralen Partikel nach der Aufnahme untersucht werden,
wurde das Pellet nach der oben beschriebenen Ernte mit PBS gewaschen, in 500 µl
Homogenisierungspuffer aufgenommen und eine subzelluläre Fraktionierung durchgeführt
(siehe IV.2.6.1).
2.3.3 Infektion
Für die Infektion der Hepatozyten mit DHBV wurde ein virämisches Gänseserum eingesetzt,
das ca. 1,1 x 10 10 Genomäquivalente (GE) pro ml enthielt. Normalerweise wurden für Infek-
tionen 220 GE pro Hepatozyte eingesetzt, es wurde über Nacht bei 37°C inkubiert und
anschließend das Medium gewechselt. Drei Tage nach der Inokulation wurde die produktive
Infektion in den Kulturen getestet.
2.3.4 pH-Schock
Um extrazellulär gebundene Viren nach einer Inokulation zu inaktivieren, wurde ein
zweiminütiger pH-Schock mit einem Glyzin-Puffer pH 2,2 durchgeführt [60].
131

Glyzin-Puffer: 50 mM Glyzin
pH 2,2 150 mM Natriumchlorid
2.4 Behandlungen
2.4.1 Infektion der PDHs in Anwesenheit verschiedener Substanzen
Material und Methoden
Typischerweise wurde folgendes Behandlungsschema verfolgt: Das Medium in den Kulturen
wurden gewechselt, anschließend wurde neues Medium, das eine inhibitorische Konzentration
der Substanz enthielt, auf die Zellen gegeben und die Zellen für 1 h vorbehandelt. Danach
wurde das Virus zugegeben und über Nacht zusammen mit der Substanz inkubiert. Dann
wurden sowohl Virus als auch Substanz entfernt und die Zellen weitere drei Tage bis zur Ernte
inkubiert.
Um den Effekt neutralisierender Antikörper oder Suramin auf die primäre Infektion zu
untersuchen, wurden virämisches Serum oder die Zellen mit den Substanzen wie in IV.2.3.5.
beschrieben vorinkubiert (Vorbehandlung). Alternativ wurden 100 µg/ml Suramin oder 10 µl
DPSI zusammen mit dem Inokulum (synchrone Behandlung) oder 2 h nach der Inokulation
zugegeben (Nachbehandlung). Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei 37°C inkubiert
und ungebundene virale Partikel durch Waschen entfernt. Gebundene, aber nicht internalisierte
Viren wurden durch einen pH-Schock inaktiviert. Anschließend wurden die Zellen für weitere
drei Tage inkubiert, bevor sie geerntet und durch Immunfärbung und -Blot analysiert wurden.
2.4.2 Inhibition der Sekundärinfektion
PDHs wurden mit 220 GE pro Zelle über Nacht infiziert, dann wurde das Medium gewechselt
und die Zellen weitere drei Tage inkubiert. Anschließend wurden auf die Kulturen entweder
100 µg/ml Suramin oder 10 µl DPSI-Antiserum gegeben. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die
infizierten Zellen, Nachkommensviren zu sekretieren. Das Medium wurde täglich gewechselt
und frische Substanzen wurden zugegeben. Nach weiteren drei Tagen wurden die Zellen fixiert
und nach einer indirekten Immunfluoreszenzfärbung durch Mikroskopie analysiert.
2.4.3 wash out-Assay
Dieser Assay wurde verwendet, um die mögliche Reversibilität einer Behandlung zu
untersuchen. Dazu wurden Viren für 2 h bei 4°C an die Zelloberfläche gebunden. Anschließend
wurden die Zellen mit PBS gewaschen, um ungebundenes Virus zu entfernen. Neues Medium,
das die gewünschte Substanz enthielt, wurde zugegeben und die Platte bei 37°C inkubiert, um
die vi rale Aufnahme zu gewährleisten. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Beginn der Inkubation
132

Material und Methoden
wurden die Zellen gewaschen, um die Substanz zu entfernen. Nach weiteren drei Tagen
wurden die Zellen auf die Etablierung einer produktiven Infektion untersucht. Dasselbe
Vorgehen wurde auch bei unbehandelten Kontrollzellen angewandt.
2.4.4 add in-Assay
Mit diesem Assay sollte untersucht werden, zu welchem Zeitpunkt der Etablierung einer
Infektion eine Behandlung mit inhibierenden Substanzen effizient ist. Viren wurden für 2 h bei
4°C an die Zelloberfläche gebunden, dann wurde das Medium gewechselt und die Kulturen bei
37°C weiter inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde dann die verwendete Substanz
zugegeben. Die Zellen wurden über Nacht weiter inkubiert, dann das Medium gewechselt und
dadurch die Substanz entfernt. Nach weiteren drei Tagen wurden die Kulturen auf eine
produktive Infektion untersucht.
2.4.5 Effekt verschiedener Substanzen auf eine etablierte Infektion
Um den Effekt verschiedener Substanzen auf die virale Replikation und Sekretion zu
untersuchen, wurden entweder Kulturen von D2-Zellen oder chronisch infizierte PDHs
verwendet. Diese Kulturen wurden kontinuierlich zwischen 24 h und 72 h mit derselben Menge
Substanz inkubiert, die auch für die Infektionsversuche eingesetzt wurde. Dann wurden sowohl
die Zellen als auch die Zellkulturüberstände geerntet und auf virale Marker analysiert.
2.4.6 Effekt der Substanzen auf die Lebensfähigkeit der Zellen
Verschiedene Substanzen könnten sich nach längerer Inkubation toxisch auf die Zellen
auswirken. Um dies zu überprüfen, wurden Kulturen für 24 h mit den jeweiligen Substanzen
behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 0,4 % Trypanblau
(Gibco BRL, USA) in PBS für 3 min inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die
Kulturen auf blau gefärbte Zellen untersucht und fotografiert. Die Aufnahme des Farbstoffes in
die Zellen kommt nur zustande, wenn die Zellmembranen nicht mehr intakt sind und die
Substanz in die Zellen durch Diffusion eindringt. Dunkel erscheinen daher Zellen, die
geschädigt sind.
Parallelkulturen wurden mit 10 µl Fluoreszein-Diazetat (eine Spatelspitze gelöst in 1 ml
DMSO) für 5 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt und die
Kultur unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht und Bilder gemacht. Nur lebende
Hepatozyten nehmen das Fluoreszein-Diazetat auf und besitzen die entsprechende Lipase um
es in den Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein zu überführen. Diese Zellen erscheinen im
Fluoreszenzmikroskop dann grün.
133

2.4.7 Behandlung von DHBV
Material und Methoden
Bei einigen Substanzen bestand die Möglichkeit, dass sie nicht auf die Zellen, sondern auf die
viralen Partikel wirken. Um dies zu überprüfen, wurden 100 µl virämisches Serum für 1 h bei
37°C in Williams’ Medium E mit der Substanz inkubiert. Serum ohne Substanz wurde als
Kontrolle identisch behandelt. Dann wurden die viralen Partikel entweder mit PEG gefällt oder
pelletiert (siehe IV.2.9.1). Das Pellet wurde in PBS aufgenommen und damit Infektionsstudien
durchgeführt oder die physikalischen Eigenschaften (siehe IV.2.9.2) untersucht.
2.5 Nachweis viraler DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine Methode zur in vitro
Vermehrung (Amplifikation) definierter Nukleinsäureabschnitte mit Hilfe des Enzyms DNA-
Polymerase [197]. Sie erlaubt den schnellen und sensitiven Direktnachweis kleinster Mengen
von DNA.
In dieser Arbeit wurde die PCR dazu verwendet, virale DNA zu amplifizieren und
anschließend im Agarosegel semiquantitativ nachzuweisen. Für den Nachweis von rcDNA
wurde das Primerpaar P1 und P2 verwendet, für den Nachweis der cccDNA das Primerpaar P1
und P3.
2.5.1 Nachweis der viralen rcDNA in Zelllysaten
Die virale Bindung und Aufnahme in PDHs wurde durch eine semiquantitative PCR untersucht.
Der Zellrasen einer Vertiefung wurde nach einem erfolgten Versuch gründlich mit 1 x PBS
gewaschen, dann wurden 200 µl PCR-Lysepuffer in die Vertiefung gegeben und 5 min bei 37°C
inkubiert. Der Zellrasen wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und weitere 5 min bei RT
inkubiert. Anschließend wurden die in der Lösung befindlichen Proteine mit Proteinase K
verdaut. Dazu wurde das Lysat mit 0,1 mg/ml Enzym versetzt und für 2 h bei 56°C inkubiert.
Dann wurde das Enzym durch eine Inkubation bei 95°C für 10 min inaktiviert und 5 µl des
Lysats für die PCR eingesetzt. Es wurde folgender Reaktionsansatz für die PCR verwendet:
5 µl DNA
0,5 µl Primer P1 (50 pmol)
0,5 µl Primer P2 (50 pmol)
0,5 µl Taq-Polymerase (2,5 Units)
0,5 µl dNTP -Mix (0,2 mM)
5 µl 10 x PCR-Puffer
1,5 µl MgCl2
ad 50 µl ddH2O
134

Material und Methoden
Zur Vermeidung von Verdunstung flüssiger Bestandteile während der Reaktion wurden
die Ansätze mit Mineralöl überschichtet.
Als Kontrolle einer möglichen Kontamination wurde zu einem Ansatz keine DNA
hinzugegeben, sondern nur ddH2O. Außerdem wurde als Positivkontrolle und Standard
virämisches Serum mit bekanntem Virusgehalt verwendet, das in PCR-Lysepuffer verdünnt
wurde.
Das Temperaturprogramm für die Durchführung der PCR mit 25 Zyklen war wie folgt:
1 min 94°C Denaturierung
3 min 72°C DNA-Synthese
Der Annealing-Schritt wurde ausgelassen, um eine Bindung der Amplifikate
untereinander zu verhindern.
10 µl der PCR-Produkte wurden anschließend auf ein 1 % Agarosegel, das
Ethidiumbromid enthielt, aufgetragen und analysiert.
2.5.2 Reinigung und Nachweis der viralen cccDNA in infizierten Zellen
Um zu überprüfen, ob eine produktive Infektion in den mit DHBV inkubierten und behandelten
Zellen stattgefunden hatte, wurde die im Zellkern produktiv infizierter Zellen amplifizierte virale
cccDNA isoliert. Dies geschah nach einem modifizierten Protokoll von J. Summers [161].
Der Zellrasen wurde 10 min bei 37°C mit Trypsin-Lösung inkubiert, um an die
Oberfläche gebundenes Virus zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen in der Lösung
aufgenommen, in ein Eppendorfgefäß überführt und für 10 min bei 4°C und 13.000 rpm
pelletiert. Dann wurde das Pellet in 1 ml SDS -Lysepuffer aufgenommen und für 1 h unter
Schütteln bei 37°C inkubiert, um die virale DNA freizusetzen. Anschließend wurden 250 µl 2,5
M KCl zugegeben, um Proteine und an sie gebundene DNA zu fällen. Nach gründlichem
Vortexen wurden die nun unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugieren von den löslichen
abgetrennt. Im Überstand war nun die virale cccDNA vorhanden, im erhaltenen Pellet die
replikativen Intermediate. Der Überstand wurde mit 1 ml Phenol (Biomol, Hamburg) gründlich
gemischt, um eventuell noch vorhandene Proteine zu entfernen. Nach einer kurzen
Zentrifugation, die zur Trennung der organischen von der wässrigen Phase führte, wurde die
wässrige Phase (enthält die DNA) abgenommen und mit 1 ml Chloroform gemischt, um Reste
von Phenol zu entfernen. Nach Zentrifugation bei 13.000 rpm und 4°C für 5 min wurde die
wässrige Phase wieder in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Dazu wurden nun 2 ml eiskaltes
Ethanol und 100 µl 3 M Natriumazetat gegeben, um die DNA zu fällen. Dieser Ansatz wurde für
1 h bei -80°C inkubiert und anschließend für 30 min bei 13.000 rpm und bei 4°C zentrifugiert.
Das erhaltene Pellet wurde in 10 µl H20 aufgenommen. Davon wurden entweder 5 µl direkt für
die PCR eingesetzt oder ein DNA-Verdau mit Plasmid Safe-DNase durchgeführt (siehe
IV.2.5.3).
135

Material und Methoden
Die PCR zum Nachweis der cccDNA wurde unter denselben Bedingungen wie in
IV.2.5.1 beschrieben durchgeführt. Es wurde jedoch anstelle von Primer 2 der Primer 3
verwendet, der an die Region der cccDNA bindet, die im Zellkern erst vervollständigt wird.
Durch Verwendung dieser Primerkombination wird präferentiell cccDNA amplifiziert.
2.5.3 Plasmid Safe DNAse-Verdau
In einigen Fällen wurde die durch obige Prozedur erhaltene DNA mit einer DNase verdaut, die
präferentiell einzelsträngige DNA verdaut. Diese Plasmid Safe DNase (Epicentre, UK) sollte die
partiell einzelsträngige rcDNA und die replikativen Intermediate verdauen, während die cccDNA
nicht verdaut werden sollte. Dieser Verdau wurde durchgeführt, um eventuell vorhandene
Verunreinigungen, die in der PCR ein positives Signal geben könnten, auszuschließen.
Die 10 µl der DNA-Lösung wurden zuerst 10 min bei 95°C inkubiert, um den Verdau
effizienter zu machen. Dann wurde der Verdau angesetzt:
10 µl DNA
1,6 µl 10 x Reaktionspuffer
1,2 µl ATP (25 mM)
1 µl Plasmid Safe DNase
2,2 µl H2O
Dieser Ansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert; anschließend wurde die DNase durch
eine Inkubation von 30 min bei 70°C inaktiviert. 5 µl der Lösung wurden dann für eine PCR
eingesetzt.
2.6 Subzelluläre Fraktionierung
2.6.1 Fraktionierung durch sequentielle Zentrifugation
Um Zellen in ihre verschieden großen Bestandteile aufzutrennen, wurden sie durch sequentielle
Zentrifugation fraktioniert [181]. Dazu wurden die Kulturen zweimal mit 1 x PBS gewaschen und
in 500 µl Homogenisierungspuffer abgeschabt. Die Zellen wurden dann in einem Zellpotter
aufgeschlossen. Anschließend wurde das Ganze für 1 min bei 13.200 rpm in einer
Tischzentrifuge bei 4°C zentrifugiert, um unaufgeschlossene Zellen und große Membranstücke
abzutrennen. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, das Pellet in
Lämmli- oder PCR-Lysepuffer aufgenommen. Der Überstand wurde dann für 10 min bei 50.000
g zentrifugiert, um die Endosomen von den restlichen Zellbestandteilen zu trennen. Der
Überstand wurde wieder in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Er wurde für 18 min bei
136

Material und Methoden
430.000 g zentrifugiert. Das Pellet enthielt vorwiegend Mikrosomen und wurde daher als
Mikrosomen-Fraktion bezeichnet. Der Überstand dieser letzen Zentrifugation wurde als Zytosol-
Fraktion bezeichnet.
Aus diesen Fraktionen wurde die virale DNA mit Hilfe des ‚High Pure Viral Nucleic Acid
Kits’ (Roche, Mannheim) nach den Angaben des Herstellers isoliert.
Homogenisierungspuffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
5 mM MgCl2
30 mM KCl
5 mM DTT
250 mM Sucrose
1 Tablette Complete ® Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche, Mannheim)
2.6.2 Isolierung Detergenz-unlöslicher Membranen
Detergenz-unlösliche Membranen (detergent insoluble membranes, lipid rafts, DIM) zeichnen
sich im Vergleich zu der sie umgebenden Membran durch einen hohen Gehalt an Cholesterin
und Sphingolipiden aus. Die Anhäufung dieser Lipide führt dazu, dass dieser Membranteil bei
4°C nicht in einem Detergenz-haltigen Puffer löslich ist [198]. Diese Eigenschaft wurde genutzt,
um DIMs aus PDHs zu isolieren und zu untersuchen, ob DHBV nach der Bindung in DIMs
lokalisiert.
Nach der Bindung viraler Partikel (440 MGE) oder rekombinantem preS-Peptid (final
0,47 µg/ml, AS 1-165) an mit MßCD behandelte oder unbehandelte Kulturen wurden diese mit
eiskaltem PBS gewaschen. Dann wurde 1 ml eiskaltes PBS in die Vertiefung der verwendeten
6-Vertiefungsplatte gegeben und die Zellen darin abgeschabt. Die Zellen wurden dann durch
eine Zentrifugation bei 1.000 g und bei 4°C für 5 min pelletiert. Das Pellet wurde in 500 µl TNE-
X-Puffer aufgenommen und 30 min auf Eis inkubiert. In dieser Zeit lösten sich die Detergenz-
löslichen Membranteile. Anschließend wurde der Ansatz bei 13.000 g und 4°C für 10 min
zentrifugiert. Das Pellet enthielt nun die DIMs, der Überstand die DSMs (detergent soluble
membranes, Detergenz-lösliche Membranen). Das Pellet wurde in 200 µl Lämmli-Lysepuffer
aufgenommen, in den Überstand wurden 125 µl Lämmli-Lysepuffer gegeben. Für den
Immunblot wurden jeweils 5 % eingesetzt.
TNE-X-Puffer: 25 mM Tris-HCl, pH 7,4
100 mM NaCl
1 mM EDTA
0,1 % Triton X-100
1 Tablette Complete ® Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche, Mannheim)
137

2.7 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung und Mikroskopie
2.7.1 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung
Material und Methoden
Die Kulturen wurden einmal mit PBS gewaschen und entweder mit Methanol/Azeton (1:1,
eiskalt) oder 3,5 % Paraformaldehyd für 10 min bei RT fixiert. Die Zellen wurden anschließend
mit PBS rehydriert und für 1 h mit dem entsprechenden Antikörper in der korrekten Verdünnung
inkubiert. Dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit geeignetem
Sekundärantikörper für 1 h inkubiert, der mit einem Alexa-Farbstoff gekoppelt war. Die
Zellkerne wurden mit Hoechst (finale Konzentration 4 µg/ml) gefärbt. Dann wurden die
gefärbten Zellen entweder direkt in der Vertiefung untersucht oder die Glasplättchen wurden
eingebettet.
Zur Visualisierung der Aktinfasern wurden die Kulturen zweimal mit PBS gewaschen
und dann für 10 min mit 3,7 % Paraformaldehyd fixiert. Nach einem Waschschritt mit PBS
wurden die fixierten Zellen mit eiskaltem Azeton für 5 min behandelt und anschließend wieder
gewaschen. Dann wurden die Glasplättchen mit 1 % BSA (bovines Serumalbumin, von Sigma)
in PBS für 30 min geblockt. Anschließend wurde das TRITC-markierte Phalloidin (in PBS
verdünnt, finale Konzentration 4 µg/ml) für 30 min auf die fixierten Zellen gegeben. Dieses
bindet spezifisch F-Aktin. Nach gründlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen kurz in 0,1 %
Triton X-100 in PBS inkubiert. Dann wurden die Glasplättchen kurz gewaschen und mit Mowiol
eingebettet. Konfokale Aufnahmen wurden mit einem Zeiss Laserscanningmikroskop gemacht.
Um die Inaktivierung von lipid rafts zu kontrollieren, wurden Kulturen erst mit den
verschiedenen inhibitorischen Substanzen behandelt und dann für 20 min mit 5 µg/ml FITC-
CTB inkubiert. Konfokale Aufnahmen wurden mit einem Zeiss Laserscanningmikroskop
gemacht.
2.7.2 Konfokale Lasermikroskopie
Primäre Entenhepatozyten wurden auf Glasplättchen gezogen, behandelt und fixiert. Die Bilder
wurden mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgenommen (LSM 510 META, Zeiss,
Germany) und mit der LSM5 Image Browser Software prozessiert.
2.7.3 Elektronenmikroskopie
Primäre Entenhepatozyten wurden in Kapillaren transferiert, um die Verarbeitung zu erleichtern.
Diese wurden dann mit 2,5 % Glutaraldehyd in PBS für 20 min bei RT fixiert, dann gewaschen
und für 30 min mit 1 % OsO4 in PBS post-fixiert. Für die ultradünnen Schnitte wurden die
Proben graduell mit Ethanol dehydriert und in ERL-Harz eingebettet. Die Schnitte wurden mit
138

Material und Methoden
2 % Uranylazetat und Bleizitrat gefärbt. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden mit
einem Philips CM 120 Transmissions-Elektronenmikroskop bei 60 kV aufgenommen. Dies
wurde dankenswerterweise in der Abteilung für Elektronenmikroskopie und Mikromanipulation
am Heinrich-Pette-Institut von Dr. Hohenberg und seinen Mitarbeitern durchgeführt.
2.8 Immunblot
Nach vorangehender Behandlung, Transfektion oder Infektion wurden Lysate der
eukaryotischen Zellen hergestellt, um diese weiter analysieren zu können. Der Zellrasen in der
Vertiefung einer 12-Vertiefungsplatte wurde mit 1 x PBS mehrfach gewaschen. Dann wurde für
den Immunblot eine entsprechende Menge Lämmli-Lysepuffer direkt in die Vertiefung der
Zellkulturplatte gegeben (200 µl Puffer in eine Vertiefung einer 12-Vertiefungsplatte). Die Zellen
wurden mit einer Pipettenspitze abgeschabt und in ein Reaktionsgefäß überführt.
2.8.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS -PAGE) und Immunblot
Alle Proben wurden bei 99°C für 5 min gekocht, anschließend wurde ein Aliquot (5 bis 10 %)
jeder Probe durch eine denaturierende SDS-PAGE fraktioniert. Als Größenstandard wurden 3 µl
‚Prestained Protein Marker’ von Invitrogen aufgetragen. Anschließend wurden die Proteine auf
eine Nitrozellulose-Membran (Schleicher und Schüll, Dassel) transferiert. Nach Sättigen der
Membran mit 3 % Trockenmilch (Biorad, USA) in TBS (Tris buffered saline), wurde sie für 1 h
bei RT mit dem Erstantikörper in der korrekten Verdünnung inkubiert. Nach mehrfachem
Waschen mit TBST (TBS plus 0,1 % Tween ® ) wurde die Membran mit dem Zweitantikörper für
1 h inkubiert. Dieser war mit der Meerrettich-Peroxidase gekoppelt. Nach mehreren
Waschgängen wurden die Proteine mittels indirekter Chemilumineszenz (Pierce, USA)
visualisiert.
2.9 CsCl-Gradientenzentrifugation
Nach Transfektion viraler DNA in LMH-Zellen können in diesen nicht-infizierbaren Zellen die
späten Schritte einer Infektion stattfinden. Das bedeutet, dass virale Proteine synthetisiert und
diese zu kompletten viralen Partikeln (Virionen und SVPs) zusammengesetzt werden.
Zusätzlich zu diesen beiden Formen werden jedoch von den Zellen auch nicht-umhüllte Core-
Partikel freigesetzt, die das virale Genom enthalten.
Um Infektionsexperimente mit rekombinanten, aus den Kulturüberständen von
transfizierten LMH-Zellen mit angereicherten Viren durchführen zu können, musste vorher die
Menge der Virionen bestimmt werden. Dies geschah durch einen DNA-Dot Blot mit
139

Material und Methoden
vorhergehender CsCl-Gradientenzentrifugation. Die Gradientenzentrifugation war nötig, um die
DNA-haltigen Virionen von den nicht-infektiösen Core-Partikeln abzutrennen.
2.9.1 Anreicherung von Viren
Vor der Gradientenzentrifugation wurden die viralen Partikel aus Zellkulturüberständen
entweder mit PEG (Polyethylenglykol, Molekulargewicht 10.000, von Sigma, Deisenhofen)
gefällt oder pelletiert, um sie zu konzentrieren. Dazu wurde zu dem Zellkulturüberstand 10 %
PEG gegeben und das PEG sorgfältig aufgelöst. Dann wurden die Ansätze auf Eis für
mindestens 2 h inkubiert, daraufhin wurde bei mindestens 4.000 rpm und 4°C für 1 h
zentrifugiert. Das erhaltene Pellet enthielt nun die viralen Partikel und wurde in PBS oder
Medium aufgenommen. Dabei wurde eine Konzentrierung von bis zu 100-fach erreicht.
Alternativ wurden die viralen Partikel durch ein Kissen aus 500 µl 20 % Sukrose pelletiert. Dazu
wurde der Kulturüberstand vorsichtig auf das Kissen aufgetragen und anschließend für 2 h bei
38.000 rpm in der Ultrazentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das
Pellet in PBS gelöst.
2.9.2 CsCl-Gradientenzentrifugation
Ein Aliquot der angereicherten Viren wurde in 2 ml Medium aufgenommen und auf einen
Cäsiumchlorid-Gradienten aufgetragen. Dieser Gradient war wie folgt aufgebaut: am Grunde
des Zentrifugenröhrchens 0,5 ml 1,4 CsCl, darüber 0,5 ml 1,3 CsCl, darüber 0,5 ml 1,2 CsCl
und darüber 0,5 ml 20 % Sukrose. Darauf wurde dann das virushaltige Medium aufgetragen.
Die Auftrennung der verschiedenen viralen Partikel erfolgte durch diesen Stufengradienten in
einem SW60-Rotor bei 20°C und 58.000 rpm für mindestens 3,5 h. Anschließend wurden
verschiedene Fraktionen von unten nach oben mit einem ‚Fraction Recovery System’ von
Beckman gesammelt. Insgesamt waren dies 12 Fraktionen. Diese Fraktionen wurden dann für
den DNA -Dot Blot verwendet.
2.9.3 DNA-Dot Blot
Um die virale DNA in den einzelnen Fraktionen nachzuweisen, wurde die Methode des DNA-
Dot Blot genutzt. Jede Fraktion wurde mit Hilfe einer Dot Blot-Apparatur auf eine Nylon-
Membran (Hybond N von Amersham, Freiburg) aufgebracht. Außerdem wurden Standard-
verdünnungen des DHBV-Plasmids DHBV 16t aufgetragen, um nach dem DNA-Nachweis die
DNA-Menge in den Fraktionen genau berechnen zu können.
Nach dem Dotten wurde die Membran getrocknet. Anschließend wurde die DNA auf der
Membran denaturiert, indem diese zweimal 1,5 min auf einem mit Soak I getränkten
Whatmanpapier inkubiert wurde. Dazwischen wurde sie gut getrocknet. Dann wurde
140

Material und Methoden
neutralisiert, indem die Membran viermal 1 min auf ein mit Soak II getränktes Whatmanpapier
gelegt wurde. Diese Schritte wurden besonders vorsichtig durchgeführt, da die DNA auf der
Membran noch nicht fixiert war. Nach einem weiteren Trocknungsschritt wurde die DNA auf der
Membran durch eine Bestrahlung mit UV-Licht im UV -Stratalinker fixiert. Die Prähybridisierung
erfolgte anschließend mit 5 ml QuickHyb (Stratagene, USA) für 30 min bei 68°C, dann wurde
die denaturierte, radioaktive DNA-Sonde (siehe IV.2.10.2) zugegeben und über Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurde die Membran für 30 min mit Wash 1 bei 68°C gewaschen, dann für 30
min bei RT mit Wash 2. Anschließend wurde sie exponiert und die Signale mit dem
PhosphoImager quantifiziert. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm TINA 2.0.
Soak I: 0,5 M NaOH Soak II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4
1 M NaCl 3 M NaCl
Wash 1: 10 % 20 x SSC Wash 2: 1 % 20 x SSC
0,1 % SDS 0,5 % SDS
2.10 Isolierung replikativer Intermediate und Southern Blot
2.10.1 Isolierung replikativer Intermediate
Um replikative Intermediate aus mit DHBV-Konstrukten transfizierten LMH-Zellen zu isolieren,
wurden die Kulturen zuerst mit PBS gewaschen und dann von der Platte abgeschabt. Die
Zellen wurden durch eine Zentrifugation für 5 min bei 4°C und 8.000 rpm pelletiert. Das Pellet
wurde in 1 ml eines NP-40-haltigem Lysepuffer aufgenommen und lysiert. Dann wurde für 5 min
bei 13.000 rpm zentrifugiert, um die Nuklei zu pelletieren. Der Überstand wurde in zwei
Reaktionsgefäße überführt (je 500 µl), ein Gefäß wurde bei -20°C gelagert. Zu dem anderen
wurden 100 µg/ml DNase I (Roche, Mannheim) gegeben, um die Input-DNA der Transfektion zu
zerstören, virale DNA in Core-Partikeln war vor diesem Verdau geschützt. Es wurde für 30 min
bei 37°C inkubiert, woraufhin 50 µl 0,5 M EDTA zugegeben und für weitere 5 min bei 37°C
inkubiert wurde, um die DNase zu inaktivieren. Dann wurde die virale DNA freigesetzt, indem
100 µg Proteinase K (Roche, Mannheim) zugegeben und 2 h bei 56°C inkubiert wurde.
Anschließend wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA durchgeführt und danach die
DNA mit Ethanol präzipitiert. Das daraus resultierende DNA -Pellet wurde in 20 µl H2O
aufgenommen. 5 µl davon wurden für einen Southern Blot eingesetzt.
NP-40-Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8
1 mM EDTA
1 % Nonidet P-40
141

2.10.2 Herstellung radioaktiv markierter Sonden
Material und Methoden
Eine DHBV-DNA-spezifische, radioaktive Sonde wurde für den Nachweis viraler DNA nach
einem DNA-Dot Blot oder Southern Blot benötigt. Als Template für die Sondenherstellung
diente das Plasmid DHBV 16t, das eine Tandem-Sequenz des vollständigen DHBV-Genoms
enthielt. Von diesem Plasmid wurden 50 ng in TE -Puffer aufgenommen (Endvolumen 45 µl) und
diese erst für 5 min bei 99°C denaturiert und dann für 5 min auf Eis inkubiert. Die denaturierte
DNA wurde in ein Reaktionsgefäß mit dem ‚Readyprime II Random Prime Labeling System’ von
Amersham Pharmacia, Heidelberg, überführt. Nach Zugabe von 5 µl des radioaktiv markierten
Nukleotids ( 32 P-dCTP) wurde der gesamte Ansatz gut gemischt und für 30 min bei 37°C
inkubiert. Dabei wurde das markierte Nukleotid in kurze DNA -Stücke eingebaut, die
komplementär zur DHBV-DNA waren. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 5 µl
0,2 M EDTA gestoppt. Um nicht eingebaute Nukleotide aus dem Ansatz zu entfernen, wurde er
auf eine G25-Spin-Säule (Amersham, Heidelberg) gegeben und für 2 min bei 3.000 rpm
zentrifugiert. Die Aktivität der Sonde wurde in einem Scintillation-Zähler bestimmt. Wenn diese
ausreichend war, wurden 100 µl Heringssperma-DNA (Sigma, Deisenhofen) zugegeben, um
unspezifische Bindungen der Sonde an die Membran zu verringern. Bevor die Sonde auf die
Membran gegeben wurde, wurde sie bei 99°C für 5 min denaturiert.
TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 8,1
2.10.3 Southern Blot
1 mM EDTA
Um die vorher isolierten replikativen Intermediate nachweisen zu können, wurde ein Southern
Blot durchgeführt [199]. 5 µl der isolierten Intermediate wurden auf ein 1% Agarosegel
aufgetragen und das Gel bei 40 V in 1 x TAE-Puffer über Nacht laufen gelassen. Nach dem
Lauf wurde das Gel kurz mit ddH2O gewaschen und anschließend in 0,2 M Salzsäure für 30 min
inkubiert, um die DNA zu depurinieren. Es folgte ein kurzer Waschschritt mit ddH2O, woraufhin
die DNA durch dreißigminütige Inkubation in Denaturierungslösung denaturiert wurde. Dann
wurde wieder kurz gewaschen und das Gel in Neutralisierungslösung 30 min inkubiert.
Anschließend wurde das Gel kurz gewaschen und der Kapillarblot vorbereitet.
Denaturierungslösung: 1,5 M NaCl
0,5 M NaOH
Neutralisierungslösung: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4
3 M NaCl
142

Material und Methoden
Die Konstruktion für den Kapillarblot wurde wie folgt aufgebaut: In einer Schale befand
sich 20 x SSC, darin wurde ein langes Stück Whatmanpapier getränkt und auf eine erhöhte
Unterlage so gelegt, dass die Enden sich im Puffer befanden. Darauf wurden zwei
angefeuchtete Stücke 3 MM Whatmanpapier gelegt, worauf das Gel folgte. Nachdem die
Unterlage mit Parafilm abgedeckt war, wurde eine Nylonmembran (Amersham, Heidelberg) auf
das Gel gelegt. Darauf folgten zwei trockene Stücke 3 MM Whatmanpapier und ein Stapel
Papiertücher. Darauf wurde ein Gewicht gestellt (ca. 3 kg) und über Nacht geblottet. Der
Transfer der DNA auf die Nylonmembran erfolgte dabei durch die Kapillarkräfte.
Nach dem Kapillartransfer wurde die Membran kurz in 2 x SSC gewaschen und dann
getrocknet. Anschließend wurde die DNA durch UV-Bestrahlung wie in Abschnitt IV.2.9.3
beschrieben auf der Membran fixiert. Alle weiteren Schritte erfolgten wie in Abschnitt IV.2.9.3
für den DNA-Dot Blot beschrieben.
2.11 Vermehrung und Isolierung von Plasmid-DNA
2.11.1 Transformation von Bakterien
DNA wurde in kompetente Bakterien eingebracht, um eventuelle Strangbrüche zu reparieren
und das Plasmid zu vermehren. Dazu wurden 50 µl Bakteriensuspension auf Eis aufgetaut und
mit 1 µg Plasmid-DNA vermischt. Der Ansatz wurde für 15 min auf Eis inkubiert, dann erfolgte
der Hitzeschock für 90 sec bei 42°C. In dieser Zeit nahmen die Bakterien das an ihrer
Oberfläche befindliche Plasmid auf. Es folgte eine Inkubation auf Eis für 2 min, um die Poren
der bakteriellen Zellwand wieder zu schließen. Dann wurden 900 µl Standard I-Medium
zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde dann für 10 sec bei
12.000 rpm zentrifugiert, um die Bakterien zu pelletieren. Das Pellet wurde in 30 µl Standard I-
Medium aufgenommen und der gesamte Ansatz auf eine Selektionsplatte ausplattiert. Diese
Agarplatte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Resistente Klone, die das gewünschte Plasmid
enthielten wurden für eine Plasmidpräparation in größerem Maßstab in 1 ml Flüssigmedium
angeimpft.
2.11.2 Maxipräparation von Plasmid-DNA
Um große Mengen Plasmid-DNA für Transfektionen zu erhalten, wurden 250 ml Standard I-
Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum mit 1 ml Übernachtkultur angeimpft. Die
Suspension wurde über Nacht bei 37°C und unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die
Bakterien bei 4°C und 6.000 rpm für 15 min durch Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wurde
dann in den entsprechenden Puffern aufgenommen und die DNA isoliert.
143

Material und Methoden
Die DNA wurde mit Hilfe des ‚Maxi Plasmid Isolation Kits’ von Qiagen isoliert und über
eine Ionenaustauschsäule (Qiagen-Tip 500) nach den Angaben des Herstellers gereinigt.
Anschließend wurde die DNA mit Isopropanol gefällt. Das Pellet wurde in 500 µl ddH2O
aufgenommen und die Konzentration im Photometer bestimmt.
144

V. Literatur
Literatur
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and biological relatedness to human hepatitis B virus. J Virol, 1980. 36(3): p.
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153

VI. Anhang
1. Abkürzungen
ß-ME ß-Mercaptoethanol
µm Mikrometer, 10 -6 m
Abb. Abbildung
AP-2 Adaptorprotein 2
APS Ammoniumpersulfat
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
cccDNA covalently closed circular DNA, virale DNA in kovalent
CsCl Cäsiumchlorid
CT Cholera-Toxin
geschlossener, zirkulärer Form
CTB Cholera-Toxin Untereinheit B
DHBc Core-Protein von DHBV
DHBe e-Antigen, early antigen, frühes Antigen, PräC
DHBV duck hepatitis B virus, Enten-Hepatitis B-Virus
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
DR direct repeat, direkte Wiederholungssequenz
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiaminetraazetat
EEA1 early endosomal antigen 1, frühes endosomales Antigen
ER endoplasmatisches Retikulum
FCS fetal calf serum, fötales Kälberserum
FITC Fluoreszeinthiozyanat
GE genome equivalents, Genomäquivalente
GFP green fluorescent protein, grün fluoreszierendes Protein
Anhang
gp180 Glykoprotein von 180 kDa Größe, duck carboxypeptidase D,
GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
DCPD, Carboxypeptidase D aus der Ente
HBc Hepatitis B-Core-Protein
HBV humanes Hepatitis B-Virus
HBsAg Hepatitis B-Oberflächen-Antigen, Hepatitis B surface antigen
Hepadnaviren Hepatitis-DNA-Viren
154

HHBV heron HBV, Reiher-HBV
HIV humanes Immundefizienzvirus
HRPO horseradish peroxidase, Peroxidase aus Meerettich
HRV humanes Rhinovirus
Hsc70 heat shock cognate protein 70, Hitzeschockprotein 70
IgG Immunglobulin G
kb Kilobasen, 1.000 bp
kDa Kilodalton, 1.000 Dalton
L grosses virales Oberflächenprotein
LDL low density lipoprotein, Lipoprotein niedriger Dichte
MßCD Methyl-ß-Cyclodextrin
MGE multiplicity of GE, Genomäquivalente pro Zelle
min Minuten
mM millimolar, 10 -3 M
MOI multiplicity of infection, Zahl der infektiösen Viren pro Zelle
mRNA messenger RNA, Boten-RNA
MTs Mikrotubuli
NLS nuclear localization signal, nukleäres Lokalisationssignal
nm Nanometer, 10 -9 m
nM nanomolar, 10 -9 M
ORF open reading frame, offener Leserahmen
Anhang
PBS phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCR polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
PDHs primary duck hepatocytes, primäre Entenhepatozyten
PEG Polyethylenglykol
rcDNA relaxed circular DNA, virale DNA in relaxierter, zirkulärer Form
RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
rpm revolutions per minute, Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
S kleines virales Oberflächenprotein
SDS sodium dodecylsulfate, Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SNARE soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein
receptor, löslicher N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor-
Bindungsprotein-Rezeptor
STEM surface connected tubules entering macrophages, mit der
Zelloberfläche verbundene Röhren, die in Makrophagen
nachweisbar sind
SVPs subvirale Partikel
SV40 simian virus 40, Affenvirus 40
TBS Tris buffered saline, Tris-gepufferte Salzlösung
155

TCA Trichloressigsäure
TP terminales Protein
TRITC Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat
U Unit
V Volt
vATPase vesikuläre ATPase
WHBV woodchuck HBV, HBV des Waldmurmeltiers
WHO world health organization, Weltgesundheitsorganisation
wt Wildtyp
Anhang
156

2. Lebenslauf
Geburtsdatum 05.09.1978
Geburtsort Frankfurt am Main
Schulausbildung
1984 bis 1988 Grundschule in Mörfelden-Walldorf
1988 bis 1997 Prälat-Diehl-Gymnasium in Groß-Gerau
Studium
Abitur, Note 1,6
Anhang
1997 bis 2002 Studium der Biologie an der Technischen Universität Darmstadt
2002 Diplomarbeit am Heinrich-Pette-Institut für experimentelle
Praktika
Immunologie und Virologie an der Universität Hamburg,
Abteilung Allgemeine Virologie (Prof. H. Will)
Titel: ‚Studien zu Aufnahme und intrazellulärem Transport von
Hepatitis B-Viren’
Diplom, Note sehr gut
2000 Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, Abteilung
Tumorbiochemie (Prof. D. Keppler)
2001 Heinrich-Pette-Institut für experimentelle Immunologie und
Aktuelle Tätigkeit
Virologie an der Universität Hamburg, Abteilung für Allgemeine
Virologie (Prof. H. Will)
Seit 2002 Wissenschaftliche Angestellte im Heinrich-Pette-Institut für
experimentelle Immunologie und Virologie an der Universität
Hamburg, Abteilung für Allgemeine Virologie
Promotionsstudium an der Technischen Universität Darmstadt
157

3. Publikationen
3.1 Paper
Anhang
Funk, A., Mhamdi, M., Lin, L., Will, H. und Sirma, H. (2004). Itinerary of hepatitis B
viruses: delineation of restriction points critical for infectious entry. J Virol.
78(15): 8289-8300.
Funk, A., Hohenberg, H., Mhamdi, H., Will, H. und Sirma, H. (2004) Spread of
hepatitis B viruses in vitro requires extracellular progeny and may be
codetermined by polarized egress. J Virol. 78(8): 3977-3983.
Funk, A.*, Stöckl, L.*, Kopitzki, A., Brandenburg, B., Oess, S., Will, H., Sirma, H. und
Hildt, E. (2004) Identification of a novel structural motif critical for infectivity of
hepatitis B viruses. Zur Veröffentlichung eingereicht. * Gleichwertige Erstautoren.
Lin, L., Prassolov, A., Funk, A., Quinn, L., Hohenberg, H., Frölich, K., Newbold, J.,
Ludwig, A., Will, H., Sirma, H. und Steinbach, F. (2004). Evidence from nature:
interspecies spread of avian hepatitis B viruses. Zur Veröffentlichung eingereicht.
3.2 Buchartikel
Funk, A., Lin, L., Mhamdi, M., Will, H. und Sirma, H. (2004) Determinants of
hepadnaviral species and liver cell tropism. In: M. Roggendorf (ed.), Monographs in
Virology: Current models of viral hepatitis. S. Karger, Basel. Im Druck.
Sirma, H., Funk, A., Hohenberg, H., Petrimpol, M., Mhamdi, M., Lin, L., Schubert, U.
und Will, H. (2004) Functional modulation of virus-cell interactions by drugs: new
concepts for treatment of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. In:
Proceedings of the 11 th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease.
Im Druck.
158

3.3 Vorträge
Anhang
Funk, A., Lin, L., Will, H. und Sirma, H. (2003). Microtubules are essential for a
postentry step in the early life cycle of hepatitis B viruses. Jährliche Tagung der
Gesellschaft für Virologie, Berlin
Funk, A. und Will, H. (2003). Infectious entry of hepatitis B viruses: delineation of
restriction points critical for viral infection in vitro. The Molecular Biology of
Hepatitis B and Hepatitis C Viruses. Oderbrück
Funk, A., Lin, L., Will, H. und Sirma, H. (2003). Infectious entry of hepatitis B
viruses: delineation of restriction points critical for viral infection in vitro. The
molecular biology of hepatitis B viruses, Bergamo, Italien
Mhamdi, M., Hohenberg, H., Funk, A., Lin, L., Will, H. und Sirma, H. (2003).
Mechanisms regulating budding of hepatitis B viruses. The molecular biology of
hepatitis B viruses, Bergamo, Italien
Sirma, H., Petrimpol, M., Hohenberg, H., Funk, A., Prassolov, A., Schubert, U. und Will,
H. (2003). The ubiquitin-proteasome pathway is essential for the propagation of
hepadnaviruses. Jährliche Tagung der Gesellschaft für Virologie, Berlin
Sirma, H., Hohenberg, H., Schneider, C., Funk, A., Meins, T. und Will, H. (2003).
Ultrastructural analysis of hepadnavirus assembly and budding by use of a novel
liver organoid and culture system. Jährliche Tagung der Gesellschaft für Virologie,
Berlin
Funk, A., Mhamdi, M., Lin, L., Will, H. und Sirma, H. (2004). Infectious itinerary of
hepatitis B viruses: delineation of steps restricting viral entry. Jährliche Tagung
der Gesellschaft für Virologie, Tübingen
Mhamdi, M., Hohenberg, H., Funk, A., Lin, L., Will, H. und Sirma, H. (2004). Budding
and secretion of hepatitis B viruses involves an endosome-like compartment.
Jährliche Tagung der Gesellschaft für Virologie, Tübingen
159

Anhang
Funk, A., Mhamdi, M., Lin, L., Lambert, C., Prange, R., Hohenberg, H., Will, H. und
Sirma, H. (2004). Cholesterol is essential for the structural integrity and infectivity
of hepatitis B viruses. The molecular biology of hepatitis B viruses, Woods Hole, USA
Stöckl, L., Funk, A., Kopitzki, A., Will, H., Sirma, H. und Hildt, E. (2004). Identification
of a novel structural motif crucial for infectivity of hepatitis B viruses. The
molecular biology of hepatitis B viruses, Woods Hole, USA
3.4 Poster
Funk, A., Will, H. und Sirma, H. (2003). Spreading of duck hepatitis B virus mainly
occurs via extracellular progeny. The molecular biology of hepatitis B viruses,
Bergamo, Italien
Stoeckl, L., Funk, A., Kopitzki, A., Will, H., Sirma, H. und Hildt, E. (2003). Destruction
of the preS-associated cell permeability abolishes the infectivity of DHBV. The
molecular biology of hepatitis B viruses, Bergamo, Italien
Lin, L., Prassolov, A., Hohenberg, H., Frölich, K., Newbold, J., Funk, A., Krone, O.,
Steinbach, F., Will, H. und Sirma, H. (2003, 2004). HHBV from heron species
infected in nature: unusual high preS sequence conservation and spread across
heron species. The molecular biology of hepatitis B viruses, Bergamo, Italien;
Jährliche Tagung der Gesellschaft für Virologie, Tübingen
Funk, A., Hohenberg, H., Will, H. und Sirma, H. (2004). Spread of hepatitis B viruses
in vitro requires extracellular progeny and may be codetermined by polarized
egress. Jährliche Tagung der Gesellschaft für Virologie, Tübingen
Stöckl, L., Funk, A., Moebs, M., Kopitzki, A., Will, H., Sirma, H. und Hildt, E. (2004).
Identification of a novel structural motif crucial for infectivity of hepadnavirus.
Jährliche Tagung der Gesellschaft für Virologie, Tübingen
Lin, L., Ishikawa, T., Huang, J., Funk, A., Will, H. und Sirma, H. (2004). Breaking the
host barrier of hepatitis B viruses: requirement for a cooperative-synergistic
interaction between two domains in the preS-region. The molecular biology of
hepatitis B viruses, Woods Hole, USA
160

Anhang
Funk, A., Mhamdi, M., Hohenberg, H., Hildt, E., Will, H. und Sirma, H. (2004).
Infectious entry of hepadnaviruses is mediated by endocytosis. The molecular
biology of hepatitis B viruses, Woods Hole, USA
161

Die vorliegende Arbeit wurde von Juli 2002 bis Oktober 2004 am
Heinrich-Pette-Institut für experimentelle Immunologie und Virologie
in der Abteilung für Allgemeine Virologie angefertigt.
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende
Dissertation selbstständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln
angefertigt habe.
Hamburg, den 01.10.2004
Anneke Funk