Genetik von Saccharomyces cerevisiae - funnycreature.de

Biochemisches
Fortgeschrittenenpraktikum
Versuch Nummer F-06:
Genetik von Saccharomyces
cerevisiae
Gruppe C
Sven Enterlein
108 097 236 174
Parastoo Nasrollahzadeh
108 096 245 894

Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
Gliederung:
I. Einleitung............................................................................................................ 2
a) Die Bäckerhefe ........................................................................................................... 2
b) Vermehrung und Zell(teilungs)zyklus .......................................................................... 2
c) Purinstoffwechsel........................................................................................................ 3
d) Nährmedien ................................................................................................................ 4
II. Herstellung der Nährmedien.............................................................................. 5
Durchführung ..................................................................................................................... 5
III. Zellzyklusmutanten ............................................................................................ 5
a) Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 5
b) Versuchsdurchführung ................................................................................................ 5
c) Beobachtungen........................................................................................................... 5
d) Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 6
IV. Purinstoffwechsel-Mutanten.............................................................................. 6
a) Theoretische Grundlagen............................................................................................ 6
b) Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 6
c) Versuchsdurchführung ................................................................................................ 7
d) Beobachtungen........................................................................................................... 7
e) Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 8
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Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
I. Einleitung
a) Die Bäckerhefe
Neben dem alltäglichen Gebrauch von Hefe zur Herstellung von Lebens- und Genussmitteln,
hat Hefe den Einzug in wissenschaftliche Laboratorien angetreten. Hefezellen
können aufgrund ihrer recht kurzen Generationszeit von ca. 1.5 h gut für molekularbiologische
Untersuchungen benutzt werden. Sie lassen sich gut in geeigneten Medien und
auf Kulturplatten kultivieren, sind aber im Gegensatz zu den Bakterien eukaryote Zellen.
Das Genom der S. cerevisiae ist auf 16 Chromosomen aufgeteilt und haploid. Man kann
zwischen zwei „Geschlechtern“ (mating types) unterscheiden, dem a und dem !-Typ. Allerdings
können auch diploide Zellen beobachtet werden, die durch Fusion zweier verschieden
geschlechtlicher Zellen entstehen (s.u.)
b) Vermehrung und Zell(teilungs)zyklus
Die Vermehrung von Hefezellen erfolgt
unsymmetrisch durch Zellsprossung (budding,
Abb. I-1): Die Mutterzelle bildet eine
kleine Knospung aus, die einen vollständigen
Chromosomensatz erhält. Nach der
Abspaltung wächst die Tochterzelle bis
zur normalen Größe heran und kann ihrerseits
Knospungen bilden. Ist die Nahrung
knapp, fusionieren haploide Zellen
verschiedenen mating types zu einer
diploiden Zelle, die durch Meiose wiederum
haploide Zellen hervor bringen. Dabei
wird ein Zwischenzustand durchlaufen,
der Ascus genannt wird. Dieser besteht aus
einem dicken, zellwandumgebenen Sack,
der die haploiden Zellen als Sporen enthält.
Reißt diese Hülle, so können die Sporen
keimen und haploide Nachkommen
erzeugen.
Zur Untersuchung bestimmter Eigenschaften
ist es oft nützlich oder sogar notwendig,
dass sich die Zellen in demselben Stadium
des Zellzyklus befinden. Dies kann
erreicht werden, indem man temperatursensitive
Mutanten benutzt. Die Mutationen
sind in Genen lokalisiert, die für be-
stimmte Stadien des Zellzyklus notwendig sind. Eine bei normaler Temperatur heranwachsende
Population wird einer erhöhten Temperatur ausgesetzt, so dass die Zellen in
einem bestimmten Stadium verharren, da sie nötige Genprodukte nicht (funktionstüchtig)
produzieren können. Dadurch befinden sich alle Zellen im selben Stadium. Wird die
Temperatur gesenkt, können die Zellen synchron weiterwachsen (vgl. Abb. I-2). Tab. I-1
zeigt die verwendeten Mutanten und die Funktion der mutierten Gene.
- 2 -
Abb. I-1: Zellzyklus der S. cerevisiae. Je nach Nahrungsangebot
entstehen haploide oder diploide Zellen.

Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
Abb. I-2: Wichtigste Möglichkeit zur Synchronisierung von Hefezell-Populationen durch
temperatursensitive Mutanten.
Stamm cdc-Mutation Funktion
x4119-16C cdc9 Strukturgen der DNA-Ligase
Stxl 45-13D cdc19 keine Angabe
185-3-4 cdc28-1 Duplikation des Spindelpol-Körpers und zur Beendigung
der G1-Phase
314 cdc4-1 Initiation der mitotischen DNA-Synthese; Replikation von
Kern-Chromosomen
Tab. I-1: Zellzyklusmutanten von S.cerevisiae. Quelle: Watson et al., "Molecular Biology of the Gene",
fourth Edition.
c) Purinstoffwechsel
Die Synthese von Ribonukleotiden verläuft in der Hefe wie in anderen Eukaryoten. Um
einen Hungerzustand hervorzurufen, können Purinstoffwechselmutanten eingesetzt
werden. Diese besitzen Mutationen in einem oder mehreren Genen, die für Proteine des
Purinstoffwechsels kodieren. Wichtige Vertreter sind Adenin-Mangelmutanten, die auf
Adenin im Nährmedium angewiesen sind (Einbau über den salvage pathway). Die Schritte
des Purinstoffwechsels, die bei den Hefezellen dieses Versuchs gestört sind, sind die
folgenden:
• a-ade6, !-ade6:
H2C H
N
CH
O
C C
NH O
H
Rib-5-P
Formyl-Glycinamid
Ribonukleotid (FGAR)
ATP+Q
+ H 2O
ADP+E
+ P i
FGAM-Synthetase
H2C H
N
CH
HN C C
NH O H
- 3 -
Rib-5-P
Formyl-Glycinamidin
Ribonukleotid (FGAM)

Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
• a-ade2, !-ade2:
N
H 2
H
C N
C CH
N
Rib-5-P
5-Amidoimidazol
Ribonukleotid (AIR)
• a-ade1, !-ade1:
-
OOC
C N
C
H N
CH
2 N
Rib-5-P
5-Aminoimidazol-
4-carboxylat
Ribonukleotid (CAIR)
d) Nährmedien
CO 2
AIR-Carboxylase
ATP+D ADP+P i
SCAIR-Synthetase
-
OOC
C N
H N
C CH
2 N
Rib-5-P
5-Aminoimidazol-
4-carboxylat
Ribonukleotid (CAIR)
-
OOC
- 4 -
H
C
C
H 2
-
OOC
N
H
N
H 2
O
C
C N
C CH
N
Rib-5-P
5-Aminoimidazol-
4-N-succinocarboxamid
Ribonukleotid (SCAIR)
Die Wahl des Nährmediums für mikrobiologische Untersuchungen ist äußerst wichtig.
Denn ob eine Kultur (egal ob Bakterien oder Hefe) wächst oder nicht, hängt davon ab,
ob die nötigen Stoffe im Medium enthalten sind. Sei es, um Bausteine für benötigte Moleküle
zu gewinnen, oder um essentielle Nährstoffe aufzunehmen. Im folgenden sollen
daher die verwendeten Medien kurz charakterisiert werden:
• YEPAD-Medium (Yeast Extract Pepton Adenin Dextrose):
→ Hefe-Extrakt: Enthält sämtliche Inhaltsstoffe von kontrolliert autolysierten Hefezellen,
v.a. Vitamine und Wachstumsfaktoren
→ Bacto Pepton: Peptone dienen als Quelle für Aminosäuren, Stickstoff und Kohlenstoff.
Die genaue Zusammensetzung ist nicht genau bekannt.
→ Bacto Agar: Agar ist ein Heteropolysaccharid, das aus Algen gewonnen wird. Es
bildet Gele aus, die farb- und geschmacklos sind. Die Löslichkeit ist in kaltem
Wasser sehr gering, in heißem jedoch hoch. Nach dem Erstarren (bei etwa 40-
50° C) bildet sich das Gel, was durch Erhitzen wieder verflüssigt werden kann.
Für die Herstellung von Nährböden in der Mikrobiologie ist es sehr gut geeignet,
da es nur von wenigen Mikroorganismen abgebaut wird und nicht toxisch ist.
→ Adenin: Das Nukleotid ist für die Adenin-Mangelmutanten essentiell und wird in
die Zellen aufgenommen; Guanin hingegen kann nicht aufgenommen werden.
• MV-Medium:
Diese Medium wird hier eigentlich nur verwendet, um durch ein zusätzliches Überstempeln
Verunreinigungen zu entfernen und die Zellzahl zu reduzieren. Dadurch
ist eine gleichmäßigere Verteilung auf den folgenden beiden Platten gegeben.
• SC-Medium:
Entgegen dem YEPAD-Medium liegen hier die Nährstoffe in definierten Mengen
vor, um möglichst gleiche Lebensbedingungen zu schaffen. SC-ade bedeutet, dass
kein Adenin zugefügt wurde (also SC minus ade).

Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
II. Herstellung der Nährmedien
Durchführung
Die Nährmedien werden den Rezepten des Skript entsprechend angesetzt. Die nicht mit
einem Sternchen gekennzeichneten Bestandteile werden zuerst gelöst und sterilisiert.
Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven für etwa 15 min. Die restlichen Bestandteile werden
durch einen Sterilfilter zugegeben.
Der Arbeitsplatz wird sterilisiert, indem eine Fläche von ca. 1 m 2 mit 70%igem Ethanol
abgewischt und ein Bunsenbrenner in die Mitte gestellt wird. Nach dem Anzünden bewirkt
die aufsteigende warme Luft, dass keine Verunreinigungen von oben auf das
Nährmedium gelangen können.
Das Gießen der Platten erfolgt mit der noch heißen Lösung. Sind Blasen entstanden, so
können diese eventuell durch kurzen Kontakt mit der Bunsenbrennerflamme zum Platzen
gebracht werden. Die Deckel werden zuerst halb auf die Platte gelegt und nach dem
Abkühlen fest aufgesetzt. Die fertigen Platten werden auf dem Deckel liegend gelagert.
III. Zellzyklusmutanten
e) Versuchsziele, Aufgaben
Wie in der Einleitung beschrieben, sind synchrone Populationen sehr wichtig für eine erfolgreiche
Untersuchung von Hefekulturen. Dieser Versuchsteil soll das unterschiedliche
Wachstum (makroskopisch und mikroskopisch) bei Raumtemperatur und 37° C behandeln.
f) Versuchsdurchführung
Von bereitgestellten temperatursensitiven cdc-Mutanten werden je zwei neue YEPAD-
Platten durch einen Verdünnungsausstrich hergestellt. Diese werden über fünf Tage unter
optimalen Bedingungen inkubiert. Um zwei vergleichbare Platten zu erhalten, werden
die Platten mit der Samtstempelmethode auf je zwei YEPAD-Platten überstempelt. Je
eine von jeder cdc-Mutante wird bei Raumtemperatur, die andere bei 37° C einen Tag
land inkubiert. Eine Kolonie wird dann abgenommen und in sterilem Wasser suspendiert.
Die Zellen werden unter dem Mikroskop bei einer 320fachen Vergrößerung beobachtet.
g) Beobachtungen
In der folgenden Tabelle sind die makroskopischen und mikroskopischen Beobachtungen
zusammengefasst.
mikroskopisch
Wildtyp Temp. Beschreibung Zeichnung
cdc4 RT kartoffelförmig, rund
37° C länglich, aggregiert
cdc9 RT länglich, zwei aneinander
- 5 -
makroskopisch
(Wachstum)
gleich
gut

Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
cdc19 RT
37° C schlecht
37° C
kugelrund, einzeln,
teilweise zusammen
cdc28 RT rel. gut
37° C
h) Auswertung und Diskussion
länglich, mehrere hintereinander
schlecht
Beim Vergleich der Kolonien, die bei unterschiedlicher Temperatur inkubiert wurden,
sieht man auf den ersten Blick, dass die bei RT inkubierten gleiches oder sogar besseres
Wachstum zeigen. Eigentlich erwartet man, dass bei höheren Temperaturen ein beschleunigtes
Wachstum einsetzt. Hier aber kommen die temperaturabhängigen Mutationen
zum Tragen. Wichtige Proteine wurden zumindest bei den cdc9 und cdc28 Mutanten
nicht gebildet, weshalb dort das Wachstum bei erhöhter Temperatur gering ist. Aber
auch das Ergebnis, dass die cdc4 und cdc19 Mutanten bei beiden Temperaturen (ungefähr)
gleich gewachsen sind, lässt den Schluss zu, dass die erhöhte Temperatur nicht zu
einem (netto betrachtet) stärkerem Wachstum geführt hat. Anscheinend wird die mutationsbedingte
Sensibilität der Proteine durch schnellere Vermehrung ausgeglichen.
Die einzelnen cdc-Mutanten zeigen verschieden Phänotypen, wobei die Gründe für die
Ausbildung noch nicht geklärt ist.
IV. Purinstoffwechsel-Mutanten
a) Theoretische Grundlagen
Die Fusion von haploiden zu diploiden Zellen im Hungerzustand kann dazu führen,
dass Mutationen übergangen werden. Ein Nachweis der Veränderung des Genotyps
kann über makroskopisch sichtbare Veränderungen des Phänotyps erfolgen. Untersucht
man bspw. Hefestämme, die Mutationen in den Genen für bestimmte Purinsyntheseproteine
tragen, kann eine Akkumulation von AIR (5-Aminoimidazol Ribonukleotid) durch
eine Rotfärbung erkannt werden.
b) Versuchsziele, Aufgaben
Hefekolonien mit verschiedenen Purinstoffwechsel-Mutationen werden auf ein Adeninfreies
und ein Adenin-haltiges Medium überimpft. Man benutzt dabei Hefezellen unterschiedlichen
mating types, um eine Rekombination durch Vermischen der Kolonien zu
ermöglichen.
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ungefähr
gleich

Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
c) Versuchsdurchführung
Von Vereinzelungsausstrichen der ade-Mutanten wird je eine Kolonie nach folgendem
Kreuzungsschema auf eine YEPAD-Platte übertragen. Dies kann entweder mit einem
sterilen Zahnstocher oder der Impföse erfolgen.
a
! ade1
ade1
ade2
ade6
ade2 ade1
ade6
Die Platte wird über Nacht inkubiert, und am nächsten Morgen vermischt man die Kolonien
eines Feldes. Bis zum Abend wird erneut (bei 30° C) inkubiert. Dann wird mit der
Samtstempelmethode drei Mal überstempelt: zuerst auf eine MV-Platte, dann auf die SCade-Platte
und zum Schluss auf die SC-Platte. Die Auswertung erfolgt am nächsten Tag
nach wiederholter Inkubation.
d) Beobachtungen
Die Platten weisen unterschiedliche Färbung und Zelldichte auf. Die nachfolgenden Abbildungen
sollen die ungefähren Zustände darstellen:
a
! ade1
ade1
ade2
ade6
SC-Platte
ade2 ade1
ade6
Abb. IV-3: Schematische Darstellung der SC–ade-Platte.
Die Stärke der Schattierung soll auch hier die Wachstumsdichte
wiedergeben. Diese ist bei den meisten Kolonien auffallend
die geringer, die Rotfärbung dafür häufiger als auf
der obigen Platte.
Abb. IV-1: Kreuzungsschema der Purinstoffwechsel-Mutanten.
Die ausgefüllten schwarzen Kreise sind Kolonien der Mutanten
des !-mating types, die ungefüllten der Mutanten des a-mating
types. Die erste Spalte des Kreuzungsschemas ist nicht benutzt
worden, da die Mutanten a-ade1 nicht angesetzt worden
waren. Die unterschiedlichen mating types ermöglichen die Bildung
einer diploiden Zelle, in der die DNA durch Rekombination
die Mutationen eventuell eliminieren kann. Zur Kontrolle
wird weiter außen von jeder Mutante eine Kolonie aufgetragen.
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Abb. IV-2: Schematische Darstellung der SC-Platte.
Die Stärke der Schattierung soll die Wachstumsdichte
wiedergeben. Die roten Punkte bzw. Flächen sind
durch das polymerisierte AIR zustande gekommen,
wie in der Diskussion noch besprochen wird.
a
! ade1
ade1
ade2
ade6
ade2 ade1
ade6
SC–ade-Platte

Versuch Nummer F-06 06 BC-Fortgeschrittenenpraktikum
e) Auswertung und Diskussion
Die Ergebnisse entsprechen den Erwartungen. Es ist offensichtlich, dass Adenin-
Mangelmutanten auf Adenin-freiem Medium schlechter gewachsen sind als auf Adeninhaltigem.
Ist eine Kolonie von Mangelmutanten nur wenig dichter als die anderen, so
kann dies auch an unterschiedlicher Auftragungsstärke liegen (z.B. Kontrollkolonie von
!-ade6).
• SC–ade-Platte:
Mischkolonien unterschiedlichen mating types, aber gleichen Mutations-Typs zeigen so
gut wie kein Wachstum. Die Rotfärbung zeigt die Anhäufung von AIR. Die Mischpopulation
von ade6-Mutanten zeigt logischerweise keine roten Pigmente, da die Synthese vor
der Bildung des AIR abbricht. Dahingegen kann CAIR, das bei den ade1-Mutanten angehäuft
wird, spontan zu AIR decarboxylieren (Einstellung eines Gleichgewichts) und
so die Rotfärbung bewirken.
Die Mischkolonien der a-ade2/!-ade1 und der a-ade2/!-ade6 Mutanten sind gut gewachsen
und zeigen keine Rotfärbung. Hier ist die Mutation durch Rekombination der DNA
eliminiert worden.
Die Komplementation a-ade1,a-ade6/!-ade2 kam nicht zustande.
• SC-Platte:
Hier sind alle Kolonien gut gewachsen, da Adenin im Nährmedium enthalten und so
die Purinversorgung gesichert ist. Die Ansammlung des AIR bei der Kontrollkolonie der
!-ade1 Mutante scheint dennoch für eine Färbung auszureichen.
Der rote Rand der a-ade2/!-ade1 Mischkultur rührt von unzureichender Vermischung
her; eine Rekombination hat die Mutation in der restlichen Kolonie eliminiert. Die
Mischkolonie der a-ade2/!-ade6 Mutanten konnten keine Mutation auslöschen (→ Rotfärbung),
aber durch Aufnahme von Adenin und Purinsynthese über den salvage
pathway das Wachstum sichern.
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