Spurenanalyse von 2,4,6-Trichloranisol mittels Stir Bar Sorptive ...

GERSTEL Aktuell Applikation
Korkig schmeckender Wein - Spurenanalyse von
2,4,6-Trichloranisol mittels Stir Bar Sorptive
Extraction (SBSE), Thermodesorption und GC/MS
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Andreas Hoffmann
GERSTEL GmbH & Co.KG, Aktienstrasse 232 – 234,
D-45473 Mülheim an der Ruhr;
E-Mail: andreas_hoffmann@gerstel.de
Wolf Rüdiger Sponholz
Forschungsanstalt Geisenheim, Fachgebiet Mikrobiologie
und Biochemie, Von-Lade-Strasse 1, D-65366 Geisenheim;
E-Mail: sponholz@geisenheim.fa.fh-wiesbaden.de
Frank David
Research Institute for Chromatography,
Kennedypark 20, B-8500 Kortrijk, Belgien;
E-Mail: frank.david@richrom.com
Pat Sandra
Universität Gent, Abteilung Organische Chemie, Krijgslaan
281 S4, B-9000 Gent, Belgien;
E-Mail: pat.sandra@richrom.com
Keywords
Twister; Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE); 2,4,6-
Trichloranisol; Wein, Fehlgeschmack; Thermodesorption;
Kapillar-GC/MS; Ultra-Spurenanalyse.
Hauptverursacher des Korkgeschmacks im
Wein ist 2,4,6-Trichloranisol (TCA). Um eine quantitative
Aussage über die jeweilige Kontamination
machen zu können, waren bislang Anreicherungsverfahren
zur Aufkonzentrierung notwendig, da TCA
über eine extrem niedrige Geschmacksschwelle verfügt.
Die hier vorliegende Arbeit stellt eine Alternative
zu den herkömmlichen Vorgehensweisen vor: Mit Hilfe
einer erst kürzlich entwickelten, neuartigen und einfachen
Methode für die sorptive Extraktion von organischen
Bestandteilen aus wässrigen Proben läßt
sich 2,4,6-Trichloranisol in Wein nachweisen, ohne
dass irgendein klassisches Probenvorbereitungsverfahren
erforderlich wäre. Aus Kalibrationskurven
lässt sich die lineare Messempfindlichkeit über mehr
als drei Größenordnungen bis zu 10 ng/l im Fullscan
und unter 1 ng/l im Selected-Ion-Monitoring ersehen.
Einführung
Für den korkigen Fehlgeschmack von Wein ist
hauptsächlich 2,4,6-Trichloranisol (TCA) verantwortlich.
Der typische Korkgeschmack entsteht bereits
bei TCA-Konzentrationen von 15 – 20 ng/l; ab dieser
Konzentration könnte Wein bereits ungenießbar sein.
Man vermutet, dass TCA durch den Abbau durch
Pilze und Denaturierung von pentachlorphenolhaltigen
Fungiziden entsteht [1,2]. Das Vorhandensein
dieser Substanz im Wein läßt sich letztlich auf
kontaminierte Korkverschlüsse zurückführen: entweder
ist 2,4,6-Trichloranisol bereits im Korkholz vorhanden
oder entsteht erst während der Verarbeitung
zu Weinkorken.
Um Kork auf TCA hin zu untersuchen, wird die
Substanz im Allgemeinen aus dem Korken extrahiert
und anschliessend in einen Referenzwein oder in ein
Ethanol-Wassergemisch mit reproduzierbaren Parametern
übertragen. Nach Extraktion mit einem organischen
Lösungsmittel lässt sich TCA durch Rekonzentrierung
des Extraktes und Headspace-Probe-
GERSTEL Aktuell 25 / Oktober 2000

GERSTEL Aktuell Applikation
Tabelle 1 Analysebedingungen
GERSTEL-Twister
Säule
Pneumatik
TDS-Temperaturen
KAS-Temperaturen
Ofen-Temperaturen
Detektor
10 mm, 55 µl PDMS
30 m HP 5 (Agilent), di = 0,25 mm, df = 0,25 mm
He, Pi = 56,6 kPa, konst. Fluss = 1 ml/min
TDS-Desorptionsfluss = 50 ml/min (splitlos)
KAS-Splitloszeit = 1 min
20 °C, 60 °C/min, 180 °C (5 min)
-150 °C, 12 °C/s, 280 °C (5 min)
60 °C ( 1min), 10 °C/min, 150 °C, 25 °C/min,
300 °C (30 min)
MSD, 230 °C / 150 °C, Scan 35 – 350 amu,
SIM m/z 212/197/169
nahme oder durch direkte Injektion in ein Standard-
GC-System quantifizieren [4].
Ein anderes Verfahren ist die direkte thermische
Extraktion mit anschließender GC-Analyse: Das leere
Glasröhrchen eines Thermodesorptionssystems
wird mit einem kleinen Stück Korken beladen und
aufgeheizt, bis TCA aus der Matrix freigesetzt wird
und nach gaschromatographischer
Trennung detektiert
werden kann. Für extrem
niedrige Detektionsgrenzen
genügen Probengrößen von
unter 10 ng/l [5].
Abbildung 1
Allen genannten Vorgehensweisen
gemeinsam ist,
®
GERSTEL Twister
dass sie das analytische Problem
an der Quelle lösen, was bei einer präventiven
Aufgabenstellung wünschenswert sein kann. Im Hinblick
auf gesetzliche Aspekte ist es jedoch sinnvoll,
TCA direkt in der Matrix Wein zu bestimmen und
nicht, auf indirektem Wege, durch die Analyse des
Korkens. Hier liegt auch das Problem: Will man die
notwendige Empfindlichkeit erreichen, bedarf es vor
der Untersuchung lästiger Extraktions- und
Anreicherungsschritte, eben aufgrund der extrem
niedrigen Geschmacksschwelle des TCA.
Zudem kommt die Flüssig-Flüssig-Extraktion
nicht ohne zum Teil hoch-toxische Lösungsmittel
aus, was zur Folge haben kann, dass der resultierende
Abfall bedenklicher ist als die zu untersuchenden
Spuren in der Probenmatrix. Um eine umweltfreundliche
Vorgehensweise zu gewährleisten, sollten moderne
Analyseverfahren so gestaltet sein, dass sie
ganz oder teilweise ohne organische Lösungsmittel
auskommen.
Vor etwa zehn Jahren haben Arthur und
Pawliszyn eine solche Technik entwickelt: die Solid
Phase Micro Extraction (SPME) [6]. Dahinter verbirgt
sich ein Verfahren, welches die Extraktion organischer
Bestandteile aus Wasser mit Hilfe von
Sorbentien aus Polydimethylsiloxan (PDMS) ermöglicht,
damals noch mit PDMS beschichtete offene
röhrenförmige Traps. Mitte der 80er Jahre wurde dieses
Verfahren von mehreren Gruppen beschrieben.
Aufgrund praktischer Begrenzungen jedoch, etwa
einer zu geringen Probenkapazität oder einem zu
niedrigem Probendurchbruchsvolumen, fand diese
Technik aber keine Akzeptanz. Erst als mit PDMS beschichtete
Fasern zur Anwendung kamen, schaffte
die SPME den Durchbruch.
Die SPME ist eine Gleichgewichtstechnik, die
auf der Verteilung der Komponenten zwischen der
PDMS-Beschichtung und der wässrigen Matrix
beruht. Dieses Gleichgewicht lässt sich mit
Verteilungskoeffizienten für Oktanol/Wasser (K(o/w))
korrelieren, die kürzlich in verschiedenen Arbeiten
beschrieben wurden [7 – 9]. Für niedrige Koeffizienten
(20000 sein. Versuche haben
deutlich gezeigt, dass die Funktion von log K (o/w)
Wiederfindung als
Wiederfindungsrate von Komponenten
mit einem K(o/w) unter 10000 nur gering ist oder bei
nahezu Null liegt.
Im Folgenden wird die Bestimmung von 2,4,6-
Trichloranisol in Wein mit einer erst kürzlich
entwickelten Technik beschrieben, der sogenannten
Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE), die auf dem oben
genannten Sorptionsprinzip beruht. Für die Extraktion
wurde jedoch statt einer Faser ein mit PDMSbeschichtetes
Rührstäbchen für Magnetrührer eingesetzt.
Das Beschichtungsvolumen liegt in einer
Größenordnung von 55 µl, was einem Phasenverhältnis
von 100 führt. Eine Wiederfindung von
50 % lässt sich jetzt bereits mit einem K(o/w) von 200
erreichen.
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GERSTEL Aktuell 25 / Oktober 2000

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Abbildung 3
Response
Kalibrationskurve für
den Modus Total-Ion-
Chromatogramm
3.0e+06
Response = 3.67e+002 * Amt
Coef of Det (r^2) = 1.000 Curve Fit: Linear/(0,0)
Material und Methoden:
Instrumentierung
Abbildung 4
Kalibrationskurve für
den Modus Selected-
2.0e+06
1.0e+06
0
0 2.0e+03 4.0e+03 6.0e+03 8.0e+03
Response
Response = 2.34e+002 * Amt
Coef of Det (r^2) = 1.000 Curve Fit: Linear/(0,0)
2.0e+5
Amount
Das Rührstäbchen für Magnetrührer
(GERSTEL-Twister, GERSTEL GmbH & Co.KG,
Mülheim an der Ruhr) besteht aus einem Magnetstab
im Glasmantel, das in einer Dicke von 0,5 mm
mit PDMS beschichtet ist. Das analytische System
setzt sich zusammen aus: Thermodesorptionssystem
(GERSTEL-TDS 2), Gaschromatograph (6890,
Agilent Technologies, Little Falls, USA), massenselektiver
Detektor (5973, Agilent Technologies).
Ion-Chromatogramm
1.5e+05
Betrieb
Abbildung 5
Extracted-Ion-
Chromatogramm von
160 ng TCA pro Liter
Silvaner (160 ppt)
1.0e+05
5.0e+04
0
0 2.0e+02 4.0e+02 6.0e+02 8.0e+02
Abundance
60000
50000
40000
Amount
Ion 197
Ion 195
Ion 210
Ion 212
Ion 167
Ion 169
Die Extraktion der Proben erfolgt in der Weise,
dass 10 ml Wein in ein 10-ml-Headspace-Vial gefüllt
werden. Dazu wird das Rührstäbchen gegeben und
das Vial verschlossen, um einen Verlust von flüchtigen
Komponenten zu vermeiden. Dem schließt sich
ein 30 bis 120 Minuten dauernder Rührvorgang an.
Nach der Extraktion wird das Rührstäbchen aus dem
Vial genommen, mit Wasser abgespült, einem fusselfreien
Tuch getrocknet und in ein Thermodesorptionsröhrchen
aus Glas eingeführt. Weitere Probenvorbereitungsschritte
sind nicht erforderlich!
30000
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 6
Spektrum von 160
ng TCA pro Liter
Silvaner (160 ppt)
20000
10000
Time--> 8.75
9.00 9.25
Abundance
60000
50000
40000
30000
167
195
212
Zwei verschiedene Serien von Weinproben
wurden analysiert: Die erste Serie enthielt Weine, die
über einen klaren und ausgeprägten Korkgeschmack
verfügten, sowie über Weine, die einwandfrei waren.
Die zweite Serie bestand aus Weinen, die geschmackliche
Mängel aufwiesen, aber nicht eindeutig als
korkig bezeichnet werden konnten.
Kalibrierung
Abbildung 7
Extracted-Ion-
Chromatogramm von
9,5 ng/l TCA in einem
Liter Riesling-Wein
(9,5 ppt)
12
20000
10000
97 109
139
m/z--> 50 100 150
200
Abundance
5000
4000
3000
2000
1000
Time--> 8.75
9.00 9.25
Ion 197
Ion 195
Ion 210
Ion 212
Ion 167
Ion 169
Es wurden zwei Kalibrationskurven vorbereitet:
1. TIC-Modus mit Kalibrationsstufen bei 100.000,
50.000, 10.000, 5.000, 1.000, 500, 100, 50 und 10
ng/l (Abbildung 3),
2. SIM-Modus mit Kalibrationsstufen bei
10.000, 5.000, 1.000, 500, 100, 50, 10, 5 und 1 ng/
l (Abbildung 4)
Um den TIC-Standard zu erhalten, wurde einem
einwandfreien Wein TCA zugesetzt; für den
SIM-Standard wurde TCA einem 12%igen Ethanol-
Wassergemisch zugesetzt. Für jeden Standard und
für jede Probe wurde ein neues Rührstäbchen verwendet;
die Quantifizierung erfolgt nicht notwendigerweise
mit ein und demselben Rührstäbchen.
GERSTEL Aktuell 25 / Oktober 2000

GERSTEL Aktuell Applikation
Beide Kalibrationskurven
zeigten eine ausgezeichnete
Linearität über drei Größenordnungen für die Konzentration
der Analyten. Aus der ersten Serie wurden
mehrere Weine analysiert und zwei davon als Beispiele
ausgewählt: Abbildung 5 zeigt das Selected-
Ion-Chromatogramm eines Silvaners mit einem TCA-
Gehalt von 160 ng/l; dies war der größte Wert, den
wir in unseren Weinproben gefunden haben. Sogar
auf dieser niedrigen Stufe (ppt) erhält man sehr klare
Massenspektren (Abbildung 6). Das andere Extracted-Ion-Chromatogramm
zeigt einen Riesling, dessen
TCA-Gehalt mit 9,5 ng/l bestimmt wurde (Abbildung
7). Obwohl sich hier kein klares Massenspektrum
aufzeichnen ließ, da andere Bestandteile
überlappten, erlauben die Ionenspuren doch eine
sehr genaue und zuverlässige qualitative und quantitative
Aussage.
Der Betrieb des MSD im Selected-Ion-Modus
erhöht die Empfindlichkeit der Methode zusätzlich.
Abbildungen 8 und 9 zeigen die Proben aus den
Abbildungen 5 und 7, dieses Mal im SIM-Modus. Das
resultierende verbesserte Signal-Rausch-Verhältnis
steigert die Qualität der Quantifizierung.
Die zweite Serie der Weinproben bestand aus
8 Flaschen einer einzigen Weinsorte, einem Welsch-
Riesling. Hier wurde als interner Standard Bromanisol
zugefügt, und der gefundene TCA-Gehalt lag zwischen
0,3 und 1,3 ng/l. Abbildung 10 zeigt ein SIM-
Chromatogramm der Weinprobe, in der die niedrigste
TCA-Konzentration gefunden wurde.
Die Weine der zweiten Serie ließen sich nicht eindeutig
als korkig bezeichnen, da das sensorische Detektionslimit
von TCA (in Abhängigkeit von der Literaturquelle)
zwischen 3 und 15 ng/l liegt. Dennoch wurde
in allen Weinen dieser Serie ein geringer TCA-Gehalt
gemessen; unterschiedlich war nur der Betrag.
Zusammenfassung
Die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) erwies
sich als außerordentlich wirksam bei der Bestimmung
von 2,4,6-Trichloranisole in Wein. Dieses Verfahren,
welches die Kombination: leicht zu handhaben,
robust, präzise, schnell und empfindlich, in sich
vereinigt, verbessert und erleichtert die Spurenanalyse
von wässrigen Proben. Zudem erübrigt es eine
Probenvorbereitung im herkömmlichen Sinne: die
Probe muß grundsätzlich nur einige Zeit gerührt werden;
die Detektionslimits im sub-ppt-Bereich lassen
sich mit einem Standard-Benchtop-Massenspektrometer
erreichen. Darüber hinaus ist die gesamte
Technologie umweltfreundlich, da für die Analyse
keinerlei organische Lösungsmittel benötigt werden.
Abundance
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
Time--> 8.75
9.00 9.25
Abundance
5000
4000
3000
2000
1000
Time--> 8.75
9.00 9.25
Abundance
160
140
120
100
80
60
Ion 210
Ion 212
Ion 197
Time--> 8.75
9.00 9.25
Literatur
[1] S.L. Neidleman und J. Geigert,
Biohalogenation: Principles, Basic Roles
and Applications, Ellis Harwood, Chichester
1986, Kapitel 2,5,8.
[2] D.K. Nicholson, S.L. Woods,
J.D. Istok und D.C. Peek, Appl. Environ.
Microbiol. 1992, 58, 2280 – 2286
[3] H.-D. Belitz und W. Grosch, Food
Chemistry, Second Edition, Springer-Verlag,
1999, S. 860.
[4] M.S. Klee und C.M. Meng, Hewlett-
Packard Application Note 395, 1999,
S. 4 – 5.
[5] A. Hoffmann und W.R. Sponholz,
American Laboratory News 1997,
Vol. 29, 7, 22 – 24.
[6] C.L. Arthur und J. Pawliszyn,
J. Anal. Chem 1990, 62, 2145.
[7] J. Dugay, C. Miège und M.-C. Hennion,
J. Chrom. A 1998, 795, 27.
[8] L.S. De Bruin, P.D. Josephy und
J.B. Pawliszyn, Anal. Chem. 1998, 70, 1986.
[9] J. Beltran, F.J. Lopez, O. Cepria und
F. Hernandez, J. Chrom. A 1998, 808, 257.
Ion 197
Ion 212
Ion 169
Ion 197
Ion 212
Ion 169
Abbildung 8
Selected-Ion-
Chromatogramm von
160 ng TCA in einem
Liter Silvaner-Wein
(160 ppt)
Abbildung 9
Selected-Ion-
Chromatogramm von
9,5 ng TCA in einem
Liter Riesling-Wein
(9,5 ppt)
Abbildung 10
Selected-Ion-
Chromatogramm von
0,3 ng TCA in einem
Liter Welsch-
Riesling-Wein
(300 ppq)
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