Die Entwicklung des Innenohrs

Material und Methoden 22
inseriert wird. Das Operationsfenster im manipulierten Ei wird mit Gewebeband (Beiersdorf)
verschlossen und das Ei für die gewünschte Zeitspanne weiterinkubiert.
Implantation von Goldbarrieren:
Für diese Experimente wurde eine für die Elektronenmikroskopie hergestellte Goldfolie einer
definierten Dicke von 8µm (Fa. Goodfellow) verwendet. Mit einer Mikoschere werden aus dieser
Folie unter dem Binokkular Rechtecke der Länge eines halben Hinterhirns und der Breite, die etwa
der eineinhalbfachen Höhe des Neuralrohrs entspricht, zurechtgeschnitten und in eine kleine
Petrischale mit HBSS überführt. Dann werden die Rechtecke im Puffer entlang der oberen
Längskante rechtwinklig umgebogen, um zu verhindern, daß die Implantate durch das Wachstum
der Wirtsembryonen zu weit nach ventral absinken.
Mit einer feinen Pinzette wird die Goldbarriere in ein wie oben beschrieben vorbereitetes Wirtsei
überführt. Im Wirtsembryo wird mit einer geschärften Wolframdrahtnadel zwischen Hinterhirn und
Ohrplakode ein passender Schnitt eingeführt, in den die Goldbarriere mit einer stumpfen
Wolframdrahtnadel inseriert wird. Dabei wird die Goldbarriere so orientiert, daß die umgebogene
Kante an der dorsalen Seite des Embryos liegt, damit die Barriere nicht nach ventral absinken kann.
Das Operationsfenster im manipulierten Ei wird mit Gewebeband (Beiersdorf) verschlossen und
das Ei für die gewünschte Zeitspanne weiterinkubiert.
2.7.5 Explantation von embryonalem Hühnchengewebe
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Explantkulturen von Ohrgrubenektoderm angelegt. Dabei wurde
das Ektoderm isoliert von und zusammen mit den umliegenden Geweben in vitro kultiviert. Dazu
wurden zunächst Hühnerembryonen der H.H.-Entwicklungsstadien 13-14 (18-23 Somiten)
(Hamburger et al., 1951) in HBSS-Puffer präpariert (2.7.2), transversale Körperscheiben, welche
beide Ohrgruben vollständig enthalten, wie in 2.7.3 beschrieben, herausgeschnitten und der Länge
nach durchtrennt. Zur Isolierung der Ohrgruben wurde die eine Hälfte der Körperscheibe in HBSS
mit Dispaselösung (2.7.3) überführt, die Ohrgrube mit Hilfe einer Wolframdrahtnadel aus dem
umliegenden Gewebe herausgeschält und mehrmals in HBSS gewaschen, um Dispaserückstände zu
entfernen. Von der anderen Körperscheibenhälfte wurde der ventrale Anteil in HBSS ohne Zusatz
von Dispase mit einer scharfen Wolframdrahtnadel abgeschnitten.
Zellkulturschalen mit 24 Vertiefungen wurden mit 0,1% Gelatine/PBS beschichtet. Die isolierten
Gewebestücke wurden in DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium, Gibco) mit 10 U/ml