Protokoll 1 (Wallner)

Modul Immunologie Januar 2013
Protokoll zum
Modul
Immunologie
LV Nr. MOD.108
Dozent
Dr. Michael Wallner
Studierende
David Roula (0807435)
Anita Sinner (0722962)
David.Roula@stud.sbg.ac.at
Anita.Sinner@stud.sbg.ac.at
1. Februar
Wintersemester 2012/2013
Universität Salzburg 1 / 13

Modul Immunologie Januar 2013
1. Immunoblot
Im ersten Versuch möchten wir mittels Immunoblot das Allergen der Birkenpolle Bet v 1
nachweisen. In unserem Versuch werden wir Bet v 1 im Pollenextrakt nachweisen und
bedienen uns dabei an der SDS-Page, um das Protein aus dem Extrakt zu gewinnen. Als
Positivkontrolle verwenden wir gereinigtes Bet v 1.
Material und Methoden
Geräte
Pipetten (10er, 200er, 1000er)
Eppendorf-Gefäße (1,5ml)
SDS-Page
Immunoblot-Filter
Membran
Filterpapier
Schüttler
Blotter
Medien und Lösungen
Genaue Zusammensetzung siehe Praktikumsunterlagen zum Übungsteil Wallner, Modul Immunologie 2013
SDS-Page sample buffer 4x (Tris, SDS, Glycerol, Bromphenolblau, β‐merkapotethanol, H 2 O)
Transfer buffer (Tris, Glycine, Methanol)
Blocking buffer (Tris/Cl, NaCl, BSA, NaN 3 )
AP-buffer pH 9,5 (Tris/Cl, NaCl, MgCl 2 )
NBT stock solution / BCIP stock buffer gelöst in AP-buffer
Coomassie Brilliant Blue (Coomassie Brilliant Blue, Methanol, Essigsäure, H 2 O)
Page ruler plus, prestained protein ladder
(http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=717F6181-FACE-A3DF-CA2B-80430903A433)
Durchführung
1. Birkenpollenextrakt und gereinigtes Bet v 1 zusammen mit Marker in Eppendorfer-
Gefäße überfühen (jeweils 2x)
Pollenextrakt: c= 0,5mg/ml, Anfangsvolumen = 10µl, + 4x SDS-Page sample
buffer. Endkonzentration soll 3/4 Extrakt und 1/4 Puffer sein. Da 3/4 = 10µl,
entspricht 1/4 = 3,3 µl. Endvolumen daher 13,3 µl
Allergen: c=1mg/ml, daher entnehmen wir 1 µl Allergen und fügen 9 µl
Wasser dazu. Anschließend werden die 3,3 µl Puffer hinzugefügt.
2. Die 4 Proben werden auf dem Heizblock für etwa 5 Minuten bei 95°C denaturiert
3. Auftragen der 4 Proben auf SDS-Page
Die erste Reihe wird freigelassen. In die zweite Reihe kommen 10 µl Extrakt, in Reihe
drei 10 µl Allergen und in die vierte Reihe 1 µl Marker. Es werden zwei Reihen
freigelassen und anschließend kommt dieselbe Reihenfolge.
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Teilgel 2
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4. Gel läuft für etwa 40 Minuten bei 35 mA
5. Entnahme des Gels
6. Teilung des Gels (Teilgel 1, Teilgel 2)
Teilgel 1: Einlegen in Coomassie-Blue für 45 Minuten auf Schüttler.
Anschließend wird Gel mit Leitungswasser gewaschen und mit Papiertuch
entfärbt
Teilgel 2: Vorbereiten für Immunoblot
7. Immunoblot aufbauen
Gel in Transferpuffer einlegen
Blotmembran und Filterpapiere in Transferpuffer einweichen (Handschuhe
verwenden!)
Filter in Petrischale legen, Membran darüber legen
Gel auf Membran, Filter über Gel legen
eventuelle Luftblasen mit befeuchteten Handschuhen herausstreichen
8. Blotten für 45 Minuten bei 15 V
9. Membran in Petrischale überführen
10. Marker mit Kugelschreiber nachzeichnen und Farbigkeit festhalten
11. Hinzugabe von 5ml Blocking buffer (Stop der Absorptionsreaktion der Membran)
12. Nach etwa 1 Minute Einwirkzeit, Blocking buffer ableeren
13. Zugabe von 5ml Antikörperlösung 1 (mit BIP-1 und monoklonalem Bet v 1 Antikörper
im PBS)
14. Inkubiaton bei 4°C bis Tag 4
15. Waschen der Membran mit Blocking Buffer für 5 min am Schüttler (3 mal)
16. Zugabe von 5ml Antikörperlösung (monoklonaler rabbit anti mouse), wurde auf
1:10 000 vorverdünnt.
17. Inkubation am Schüttler für eine Stunde.
18. Waschen der Membran durch Zugabe von Blocking Buffer (3 mal)
19. Äquilibrieren des pH mit 5ml AP- buffer (1 Minute)
20. Farbreaktion NBT/ BCIP 5 ml, einwirken lassen
21. Teilgel 1 aus Entfärbungsgefäß entfernt und mit Teilgel 2 gescannt
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Ergebnisse
Wir wissen, dass Bet v 1 eine molekulare Größe von 17 kDa hat. Wir vergleichen nun unsere
Banden vom Bet v 1-Standard und dem Pollenextrakt mit den Banden unseres Markers.
15 kDa
Bet v 1 Pollenextrakt
Bet v 1 Standard
Markerbande
Bandenspektrum Extrakt
Abb. 1: Immunoblot Abb. 2: Coomassie-gefärbtes Gel Abb. 3: Marker-Banden (Quelle:
http://www.piercenet.com)
Diskussion
Im Gel zeigten sich beim Pollenextrakt verschiedene Banden, während sich beim Standard
nur eine Bande zeigte. Im Vergleich dazu bildete sich im Immunoblot ein Niederschlag
spezifisch an der Stelle an der die Antikörper Bet v 1 gebunden hatten. Die markierten
Banden im Immunoblot und die stark bläulichen Banden im Gel befanden sich knapp über
der 15 kDa-Bande des Markers, was den Erwartungen entsprach. Die Bande für Bet v 1 ist
deutlich ausgeprägt, was bedeutet, dass ein großer Anteil des Gesamtproteins aus Bet v 1
besteht.
Die Bandenverzerrung („Smiley-Effekt“) zum Rand des Gels hin entstand durch ungleiche
Ladungsverteilung bei der Elektrophorese.
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2. Indirekter Sandwich-ELISA
Einleitung
In diesem Versuch möchten wir den prozentuellen Anteil an Bet v 1 im Birkenpollenextrakt
herausfinden.
Material und Methoden
Geräte
Pipetten (10er, 200er, 1000er)
Eppendorf-Gefäße (1,5ml)
96er well Polystyrol Mikrotiterplatte (Nunc Maxisorp)
Medien und Lösungen
Genaue Zusammensetzung siehe Praktikumsunterlagen zum Übungsteil Wallner, Modul Immunologie 2013
Capture Antibody (BIP-1, c=1,8mg/ml in PBS)
Rabbit Anti Bet v 1 Antibody (c=1µg/ml in TBST
Goat Anti Rabbit Antibody (c=1µg/ml in TBST)
Phosphate buffered saline (PBS)
Tris-buffered saline (TBS), ph 7.4, 0,05% Tween-20
0,5% Rinderserumalbumin (BSA), TBS ph 7.4, 0,05% Tween-20
Substratlösung (4-NAG in Diethanolamin)
Durchführung
1. Coating:
Verdünnen des Capture-Antikörpers auf auf ein Endvolumen 1,4ml und einer
Konzentration c=2µg/ml mit PBS
=
Endvolumen entspricht 1,5 µl BIP-1 für 1,4 ml Lösung
Überführen von jeweils 50 µl in insgesamt 24 wells der Mikrotiterplatte
2. Inkubation für 20h bei 4°C
3. Waschen:
Ableeren der Antikörperlösung durch schwungvolles Umdrehen der Mikrotiterplatte
Zweimaliges Waschen mit 200µl TBS pro Well
Das Enzymdetektionssystem, das wir in diesem Experiment benutzen wird durch
Phosphatgruppen im Puffer inhibiert, deswegen benutzen wir in den folgenden
Schritten einen Tris-Puffer.
4. Blockieren:
Zugabe von 200µl 0,5% BSA, TBS pro Well.
Wobei Tween -20 Plastik- Proteinbindungen blockiert und BSA den Effekt zusätzlich
verstärkt, so dass restliche Bindestellen abgedeckt werden und nur noch der
Antikörper als Interaktionsfläche vorhanden ist.
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5. Inkubation mind. 30 min bei Raumtemperatur
6. Erstellen der Ausgangslösung für die Verdünnungsreihe Bet v 1:
Die Ausgangslösung hat jedoch eine Konzentration von 1 mg/ml und muss auf eine
Konzentration von 0,1µg/ml verdünnt werden. Wir verwenden 2
Verdünnungsschritte um eine exaktere Verdünnung erstellen zu können.
1:100 (2 *)
1000 µg/ml * x= 200µl * 10µg/ml
2 µl Bet v 1 Standardlösung in 198µl TBS, Endvolumen 200µl
2 µl Bet v 1 von Verdünnung 1 in 198µl TBS, Endvolumen 200µl
7. Erstellen der Ausgangslösung für die Verdünnungsreihe Extrakt:
Die Ausgangslösung hat eine Konzentration von 0,5 mg/ml und muss auf eine
Konzentration von 5 µg/ml verdünnt werden. Wir verwenden 2 Verdünnungsschritte
um eine exaktere Verdünnung erstellen zu können.
1:100
500 µg/ml *x= 200µl * 5µg/ml
x= 2 µl
a. 2 µl Extrakt Standardlösung in 198µl TBS, Endvolumen 200µl
1:10
5µg/ml*x= 200µl * 0,5µg/ml
x= 20 µl
b. 20 µl Extrakt Standardlösung in 180µl TBS, Endvolumen 200µl
8. Vorlegen des Puffers:
Die Verdünnungsreihe kann direkt auf der Mikrotiterplatte erstellt werden.
Vorlegen von 50 µl TBS in die markieren Wells: B3-B9, C3-C9 und D2-D9
Reihe D ist damit unsere negativ Kontrolle (Buffer only).
Abb. 4: TBS vorlegen
9. Verdünnungsreihe Bet v 1 Standard:
In B2 werden 100 µl der erstellten 0,1 µg/ml Verdünnung von Bet v 1 Standard
pipettiert. Nach folgendem Schema bis Well 8: Überführen von 50 µl von B(n-1) nach
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B(n) und resuspendieren. Well 9: Überführen von 50 µl aus Well 8, resuspendieren
und 50 µl verwerfen.
Abb.5: Verdünnungsreihe Bet v1
10. Verdünnungsreihe Extrakt:
In C2 werden 100 µl der erstellten 0,5 µg/ml Verdünnung von Extrakt Standard
pipettiert.
Nach folgendem Schema bis Well 8:
Überführen von 50 µl von C(n-1) nach C(n) und resuspendieren.
Well 9: Überführen von 50 µl aus Well 8, resuspendieren und 50 µl verwerfen.
Abb.6: Verdünnungsreihe Extrakt
11. Waschen mit 200µl TBST pro Well (2x)
12. Pro Well 50 µl Antikörperlösung (polyklonaler Rabbit Anti bet v 1-Antikörper),
Inkubation 30 Minuten bei RT
13. Waschen mit 200µl TBST pro Well (2x)
14. Pro Well 50 µl Antikörperlösung (Goat Anti-Rabbit gekoppelt mit alkaline
Phosphatase), Inkubation 30 Minuten bei RT
15. Waschen mit 200µl TBST pro Well (3x)
16. Pro Well 100 µl Substrat-Lösung (4-NAG)
17. Messung der Ergebnisse am Photometer nach 10, 20 und 30 Minuten bei 405nm
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Ergebnisse
Auswertung der Probe nach 30 Minuten im Photometer:
Vergleicht man die Werte mit derselben OD (z.B. 1,60) unter Berücksichtigung der
abweichenden Konzentration kann man abschätzen, dass sich im Pollenextrakt etwa 5% an
Bet v 1 befinden.
Es erfolgte eine grafische Darstellung der Messergebnisse im Excel:
Abb. 6: Grafische Auswertung vom ELISA
Bet v 1 Standard bei halbmaximalen OD: 1=0,6968Ln(x)-0,6359 = 10,46 ng/ml
Birkenpollenextrakt bei halbmaximalen OD: 1=0,8317Ln(x)-3,5775 = 245,60 ng/ml
Wieviel Prozent Bet v 1 ist in Birkenpollenextrakt enthalten?
10,46 ng/ml * 100 / 245,60 ng/ml = 4,3%
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Diskussion
Im Vergleich zu den Ergebnissen der anderen Gruppen hätten wir einen Wert zwischen 10%
und 20% erwartet. Die 4,3% aus der Grafik entsprechen den ungefähren 5% der Schätzung
aus den Rohdaten und es ist somit ein Rechenfehler auszuschließen. Pipettierfehler oder
eine falsche Verdünnungsreihe könnten die Ursache für den geringen Prozentwert sein.
Wie erwartet zeigt sich eine asymptotische Annäherung an den Maximalwert. Dieses Plateau
ist definiert durch die Menge an Capture-Antikörper mit denen die Platte inkubiert wurde.
Das untere Plateau ergibt sich durch die geringe Menge an Antigenen, da erst ab einer
bestimmten Menge ein messbarer Effekt eintritt.
In der Grafik erkennt man zwei lineare dynamische Bereiche, mit denen wir messen und
quantifizieren können.
3. RBL Assay
Einleitung
In diesem Versuch wollen wir die physiologische Degranulation von Basophilen über einen
RBL-Assay nachweisen und anhand der Ergebnisse den Anteil von Bet v 1 im Pollenextrakt
quantifizieren.
Material und Methoden
Geräte
Pipetten (10er, 200er, 1000er)
Durchlichtmikroskop
Eppendorf-Gefäße (1,5ml)
Neubauer Zählkammer
Zellkulturschalen
15ml Röhrchen
96er well Mikrotiterplatte (Nunc Nunclone)
96er well Mikrotiter platte (Greiner BioOne)
Folie (Nunc)
Medien und Lösungen
Genaue Zusammensetzung siehe Praktikumsunterlagen zum Übungsteil Wallner, Modul Immunologie 2013
RBL-Medium (RPMI, FCS, L-Gluatamine, Sodium Pyrovate, 2-MerkaptoEtOH, Pen/Strep)
Tyrode’s buffer (Tyrode salts according to GIBCO, HEPES, NaHCO 3 )
Citrate buffer (Citric acid, NaOH)
4-NAG (4-NAG, Citric buffer)
Glycine buffer (Glycine, NaCl)
TE-Puffer (Trypsin/EDTA)
DPBS
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Mausserum
Triton x-100, 10 %
Durchführung
1. RBL-Medium aus Zellkulturschale absaugen, die Zellen haften auf dem Boden
2. Waschen der Zellen durch Zugabe von 2,5ml DPBS, gut schwenken
3. Absaugen vom DPBS, Zugabe von 2,5ml TE zum Ablösen
4. Inkubation für 10 Minuten bei RT
5. Ablösen der Zellen durch seitliches klopfen
6. Zugabe von 5ml frischem RBL-Medium, Boden gut abspülen
7. Überführen der Zellsuspension in 15ml Gefäße
8. Zentrifugation für 5 Minuten bei 12000 rpm
9. Überstand abheben und entfernen, Pellet in neuem Medium (1ml) resuspendieren
10. Zählung der Zellen mittels Neubauer-Zählkammer
Gezählte Zellen: 3,4 x 10 5 Zellen/ml
Es wird ein Mindestvolumen von 2,5 ml benötigt. Dies wird durch verdünnen
mit 1 ml Medium erreicht, verdünnt jedoch die Zellzahl abweichend vom
Protokoll: Da 1ml 3,4 x 10 5 Zellen entspricht, ergeben 2,5ml 1,36 x 10 5
Zellen/ml.
11. Überführen von jeweils 100µl in insgesamt 24 wells (1,36 x 10 4 Zellen/well)
12. Inkubation der Zellen über Nacht bei 37°C und 7% CO 2
13. Beladen der RBL Zellen mit IgE Antikörpern aus Mausseren: Passive Sensibilisierung
10 µl Mausserum in B2-B9 und C2-C9
Abb. 7: Passive Sensibilisierung der RBL, Skript Teil Prof. Wallner, S.17
14. Inkubation in der Wärmebox für 50 min, die im Serum befindlichen IgE binden an die
FcεRI der Basophilen.
15. Erstellung der Bet v 1 Standardverdünnung:
Verdünnung der 1mg/ml Lösung auf 1 µg/ml, siehe Versuch 2. Schritt 7
16. Erstellung der Extrakt Standardverdünnung:
Verdünnung der 0,5 mg/ml Lösung auf 10 µg/ml in zwei Schritten:
1:10 Verdünnung
500 µg/ml *x= 200 µl* 50 µg/ml
x= 20 µl
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180 µl Tyrode´s Buffer in ein Epi vorlegen und 20 µl der 0,5 mg/ml Lösung
Extrakt zugeben.
1:5 Verdünnung
50 µl/mg *x = 200 µl * 10 µg/ml
x= 40 µl
160 µl Tyrode´s Buffer in ein Epi und 40 µl der 50 µg/ml Verdünnung zugeben.
Endvolumen 200 µl, Verdünnung 10 µg/ml.
17. Vorbereitung für die Zellaktivierung, Verdünnungsreihen:
Die Verdünnungsreihe wird zuerst in 1,5 ml Eppi´s vorbereitet und erst anschließend
auf die Platte übertragen!
Bet v 1 Verdünnungsreihe:
Vorlegen von 180 µl Tyrode´s Buffer in Eppi 2-7
Eppi 1 entspricht der hergestellten Verdünnung zu 1 µg/ml bet v 1.
Überführung von 20µl aus Eppi 1 in Eppi 2, resupsendieren.
Eppi 2-7: Überführen von Eppi (n-1) in Eppi 1 und resuspendieren.
Extrakt Verdünnungsreihe:
Vorlegen von 180 µl Tyrode´s Buffer in Eppi 2-7
Eppi 1 entspricht der hergestellten Verdünnung zu 10 µg/ml Extrakt.
Überführung von 20µl aus Eppi 1 in Eppi 2, resupsendieren.
Eppi 2-7: Überführen von Eppi (n-1) in Eppi 1 und resuspendieren.
18. Waschschritt nach der passiven Sensibilisierung:
Vorsichtiges ableeren des Überstandes, Zellen können durch klopfen ihre Interaktion
mit dem Plastik verlieren.
Zweimaliges Waschen mit 200 µl Tyrode´s Buffer pro Well.
19. Auftragen der Verdünnungsreihen:
Auftragung von 100 µl Tyrode´s Buffer in B 9, C 9, D2-9
Abb.8: Auftragungsschema für den Tyrode´s Buffer
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Auftragung von 100 µl der entsprechenden bet v 1 Verdünnung in well B2-B8
nach folgendem Schema:
Abb.9: Auftragungsschema für die Bet v 1 Verdünnungsreihe
Auftragung von 100 µl der entsprechenden Extraktverdünnung in well C2-C8,
nach folgendem Schema:
Abb.10: Auftragungsschema für die Extraktverdünnngsreihe
20. Inkubation für 30 min in der Wärembox
21. Max Lyse mit Triton X-100:
Auftragung von 10 µl 10 % Triton X-100 in well D6-D9. Dies liefert uns die
Referenzwerte für die maximal mögliche β- Hexosaminidase Ausschüttung.
Abb.11: Auftragungsschema für Max Lyse durch Triton X-100
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22. Überführen von je 50 µl Lösung pro well in das entsprechende well auf eine 2.
Mikrotiterplatte (Greiner BioOne). Durch leichtes schräg halten, kann die
Überführung von adherenten Zellen vermieden werden.
23. Lagerung der Greiner BioOne Mikrotiterplatte zugeklebt mit einer Folie (Nunc) bei
-70°C
24. 50µl Substratlösung (4-Nag) pro Well
25. Inkubation für 1 Stunde bei 37 °C
26. Reaktion mit 100 µl Glycinpuffer stoppen → kein Farbumschlag nach gelb trotz pHshift
Diskussion
Die Degranulation sollte über die β-Hexosaminidase nachgewiesen werden, ein Enzym,
welches von dem Substrat 4-NAG, die 4- Nitrophenylgruppe abspaltet. Bei basischem pH
entsteht 4-Nitrophenylat, welches für einen gelben Farbumschlag sorgt. Aufgrund eines
technischen Defekts beim CO 2 -Inkubator kam es allerdings nicht zu einem Farbumschlag. Es
wird vermutet, dass aufgrund zu hoher CO 2 -Konzentration der pH-Wert zu stark gesunken ist
und somit ein Großteil der Zellen abgestorben ist. Dieser Trend zeigte sich schon bei der
Zählung mit der Neubauerkammer und anschließender Verdünnung auf ein Mindestvolumen
von 2,5 ml. Die erzielte Zellzahl von 4x 10 5 Zellen für den RBL-Assay konnte nicht erreicht
werden.
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