Protokoll 1 (Wallner)

Modul Immunologie Januar 2013
Mausserum
Triton x-100, 10 %
Durchführung
1. RBL-Medium aus Zellkulturschale absaugen, die Zellen haften auf dem Boden
2. Waschen der Zellen durch Zugabe von 2,5ml DPBS, gut schwenken
3. Absaugen vom DPBS, Zugabe von 2,5ml TE zum Ablösen
4. Inkubation für 10 Minuten bei RT
5. Ablösen der Zellen durch seitliches klopfen
6. Zugabe von 5ml frischem RBL-Medium, Boden gut abspülen
7. Überführen der Zellsuspension in 15ml Gefäße
8. Zentrifugation für 5 Minuten bei 12000 rpm
9. Überstand abheben und entfernen, Pellet in neuem Medium (1ml) resuspendieren
10. Zählung der Zellen mittels Neubauer-Zählkammer
Gezählte Zellen: 3,4 x 10 5 Zellen/ml
Es wird ein Mindestvolumen von 2,5 ml benötigt. Dies wird durch verdünnen
mit 1 ml Medium erreicht, verdünnt jedoch die Zellzahl abweichend vom
Protokoll: Da 1ml 3,4 x 10 5 Zellen entspricht, ergeben 2,5ml 1,36 x 10 5
Zellen/ml.
11. Überführen von jeweils 100µl in insgesamt 24 wells (1,36 x 10 4 Zellen/well)
12. Inkubation der Zellen über Nacht bei 37°C und 7% CO 2
13. Beladen der RBL Zellen mit IgE Antikörpern aus Mausseren: Passive Sensibilisierung
10 µl Mausserum in B2-B9 und C2-C9
Abb. 7: Passive Sensibilisierung der RBL, Skript Teil Prof. Wallner, S.17
14. Inkubation in der Wärmebox für 50 min, die im Serum befindlichen IgE binden an die
FcεRI der Basophilen.
15. Erstellung der Bet v 1 Standardverdünnung:
Verdünnung der 1mg/ml Lösung auf 1 µg/ml, siehe Versuch 2. Schritt 7
16. Erstellung der Extrakt Standardverdünnung:
Verdünnung der 0,5 mg/ml Lösung auf 10 µg/ml in zwei Schritten:
1:10 Verdünnung
500 µg/ml *x= 200 µl* 50 µg/ml
x= 20 µl
Universität Salzburg 10 / 13