Protokoll 1 (Wallner)

Modul Immunologie Januar 2013
2. Indirekter Sandwich-ELISA
Einleitung
In diesem Versuch möchten wir den prozentuellen Anteil an Bet v 1 im Birkenpollenextrakt
herausfinden.
Material und Methoden
Geräte
Pipetten (10er, 200er, 1000er)
Eppendorf-Gefäße (1,5ml)
96er well Polystyrol Mikrotiterplatte (Nunc Maxisorp)
Medien und Lösungen
Genaue Zusammensetzung siehe Praktikumsunterlagen zum Übungsteil Wallner, Modul Immunologie 2013
Capture Antibody (BIP-1, c=1,8mg/ml in PBS)
Rabbit Anti Bet v 1 Antibody (c=1µg/ml in TBST
Goat Anti Rabbit Antibody (c=1µg/ml in TBST)
Phosphate buffered saline (PBS)
Tris-buffered saline (TBS), ph 7.4, 0,05% Tween-20
0,5% Rinderserumalbumin (BSA), TBS ph 7.4, 0,05% Tween-20
Substratlösung (4-NAG in Diethanolamin)
Durchführung
1. Coating:
Verdünnen des Capture-Antikörpers auf auf ein Endvolumen 1,4ml und einer
Konzentration c=2µg/ml mit PBS
=
Endvolumen entspricht 1,5 µl BIP-1 für 1,4 ml Lösung
Überführen von jeweils 50 µl in insgesamt 24 wells der Mikrotiterplatte
2. Inkubation für 20h bei 4°C
3. Waschen:
Ableeren der Antikörperlösung durch schwungvolles Umdrehen der Mikrotiterplatte
Zweimaliges Waschen mit 200µl TBS pro Well
Das Enzymdetektionssystem, das wir in diesem Experiment benutzen wird durch
Phosphatgruppen im Puffer inhibiert, deswegen benutzen wir in den folgenden
Schritten einen Tris-Puffer.
4. Blockieren:
Zugabe von 200µl 0,5% BSA, TBS pro Well.
Wobei Tween -20 Plastik- Proteinbindungen blockiert und BSA den Effekt zusätzlich
verstärkt, so dass restliche Bindestellen abgedeckt werden und nur noch der
Antikörper als Interaktionsfläche vorhanden ist.
Universität Salzburg 5 / 13