Brucellose Milch-ELISA

Anwendung des Milch-ELISA 

zur Brucellose-Überwachung in den Rinderbeständen 

K. Nöckler 1 , P. Bahn 1 , F. Melzer 2 

Nationales Referenzlabor für Brucellose 

1 Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) 

2 Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere (BFAV) 

AVID-Workshop Tankmilchuntersuchungen 14.-15.10.03

Anwendung des Milch-ELISA 

zur Brucellose-Überwachung in den Rinderbeständen 

Inhalt 

(1) Schema zur Tankmilch-Untersuchung der Rinderbestände 

auf Brucellose (Beispiel) 

(2) Gesetzliche Vorschriften zur Brucellose-Untersuchung 

(VO 535/2002/EG / Anhang C der RL 64/432/EWG) 

(3) Ringversuch Brucellose (Milch-ELISA) 

(4) Brucellose Milch-ELISA: experimentelle Untersuchungen 

zur diagnostischen und analytischen Sensitivität 

(5) Simulation von Poolgrößen für die Untersuchung von Milch 

auf Brucella-Antikörper

(1) Brucellose-Untersuchung in den Rinderbeständen 

- Untersuchungsschema - 

Bestands-Screening (Milch) 

Einzelgemelk 

Tankmilchpool 

Poolprobe (50) 

Milch-ELISA 

Brucella-positiv 

Brucella-negativ 

Einzeltier-Untersuchung 

SLA RBT ELISA KBR

) Gesetzliche Vorschriften zur Brucellose-Untersuchung 


Brucellose-Teststandards (RL 64/432/EWG; VO 535/2002/EG) 

OIE-Standardserum (OIE SS) 

Serum-Tests 

SLA: 50% Agglutination in Serumverdünnung 1:600-1:1000 (30 IE 

KBR: 50% Hämolyse in Serumverdünnung 1:200 (20 Sens.E.) 

RBT: pos. in Serumverdünnung 1:45 / neg. 1:55 

ELISA: pos. in Serumverdünnung 1:150 / neg. 1:600 (Einzelprobe) 

Milch-Tests 

ELISA: pos. in Serumverdünnung 1:1000 + Verdünnung 1:10 in Milch

) Gesetzliche Vorschriften zur Brucellose-Untersuchung 


Brucellose-Teststandards 

OIE-Standardserum (OIE SS) / äquivalente OIE-ELISA-Standards 

Serum-ELISA-Tests (Einzel) 

OIE SS: 

1:150=pos. / 1:600=neg. 

OIE ELISA SP SS: 

1:16=pos. / 1:64=neg. 

OIE ELISA WP SS: 

1:2=pos. / 1:8=neg. 

Milch-ELISA-Tests 

OIE SS: 

1:1000 + 1:10 in Milch=pos. 

OIE ELISA SP SS: 

1:125 + 1:10 in Milch=pos. 

OIE ELISA WP SS: 

1:16 + 1:10 in Milch=pos.


Grundsatz 

• Durchführung u. Auswertung gemäß Protokoll der EU-Ringversuche 

für NRL‘s 

- Doppelproben 

- Wiederholungsuntersuchungen (1. / 2. Tag) 

- Ergebnisauswertung (Sollwert / Durchschnittswert Teilnehmer) 

• Verwendung von Negativ- u. Positiv-Proben sowie Standards 

Ablauf 

Versand: 29.04.02 ðð Ergebnisse: 14.06.02 ðð Bericht: 02.07.02 

21 Teilnehmer / 19 Teilnehmer haben Ergebnisse übersandt


Probenmaterial / Beurteilung 

Proben-Nr. Bezeichnung Ergebnis 

1 + 14 OIE ELISA SP SS 1:625 positiv 

10 + 22 OIE ELISA SP SS 1:1250 positiv 

17 + 18 OIE ELISA SP SS 1:2500 positiv/fraglich 

19 + 26 EG-Stop-Referenz, pos. positiv 

2 + 15 EG-Referenz, pos. positiv 

3 + 7 EG-Referenz, pos. 50% positiv /fraglich 

12 + 16 EG-Referenz, 25% negativ 

11 + 23 EG-Referenz, neg. negativ 

20 + 24 neg. Milch # 1 negativ 





*EG-Referenz = Nationales Standardserum 1:20.000 (OIE SS 1:10.000)


Teilnehmer: ELISA-Testsysteme u. Bewertung 

Teilnehmer-Nr. Testsystem Kontrollsystem Cut-off 

1 Bommeli EG-Referenz 44 % 


3a / 3b Bommeli / Synbiotics EG-Referenz 40 % / 60% 


5 Bommeli EG-Referenz 30-50% 

7 Bommeli Testkontrolle 70-100 % 







15 Synbiotics Testkontrolle 60 % 



18a / 18b Bommeli / Boehringer EG-Referenz 50 % / 50 % 



21 Bommeli EG-Referenz 44 %


Ergebnisse: Mittelwerte der Doppelprobe (1./2. Tag) 

Identifikation 

Teilnehmer 

1 2 3a 3b 4 5 7 8 9 10 12 13 14 15 16 17 18a 18b 19 20 

IE ELISASPSS 1:625 273,3 211,8 152,4 152,9 137,6 245,0 167,6 210,6 204,4 187,2 228,9 172,2 142,4 161,8 169,5 138,7 209,1 151,7 163,8 217,8 1 



-Stop-Referenz, pos. 193,8 152,1 144,3 149,5 130,0 176,5 133,7 228,8 179,0 169,7 202,2 135,0 140,5 137,8 156,9 139,5 176,2 132,1 152,0 165,5 1 

-Referenz, pos. 118,3 102,4 99,8 119,4 91,7 97,9 95,9 132,4 98,1 115,8 126,4 92,0 86,7 115,2 106,2 96,6 111,2 97,0 106,9 98,5 

-Referenz, pos. 50% 62,3 64,9 66,3 97,4 62,4 54,5 58,9 78,0 53,4 65,3 71,4 51,3 48,4 94,7 63,7 53,2 56,9 58,3 65,7 63,8 

-Referenz, 25% 24,3 38,1 36,9 78,9 40,4 29,5 38,1 43,2 26,1 35,1 33,6 33,9 33,3 65,8 36,8 29,8 28,2 32,6 31,8 43,6 

-Referenz, neg. -4,0 6,6 0,8 45,4 12,0 1,0 4,8 7,0 -0,8 9,4 -6,5 9,0 10,9 43,2 3,4 -2,1 1,6 12,8 -8,8 21,5 

g. Milch # 1 -14,0 -10,1 -13,4 14,6 0,5 -7,0 -7,9 0,6 -1,9 1,2 -20,9 2,3 -2,1 21,9 -5,1 -13,7 -6,2 12,0 -26,0 11,2 

g. Milch # 2 -13,3 -6,3 -12,6 16,6 1,6 -6,2 -7,1 0,6 1,2 1,9 -20,7 4,5 -2,7 22,4 -5,6 -9,7 -5,2 18,3 -10,8 11,5 

g. Milch # 3 -10,5 -0,5 -9,6 20,5 3,2 -3,3 -4,7 4,2 1,5 3,1 -18,4 7,6 -1,3 25,6 -3,4 -12,6 -4,8 17,7 -11,9 14,8 

g. Milch # 4 -9,5 -7,2 -5,4 39,8 5,5 -1,0 -0,3 3,8 -1,5 3,6 -11,6 3,4 1,8 43,4 -0,5 -9,3 -1,4 10,7 -11,2 19,1 

g. Milch # 5 -6,3 6,2 -0,1 41,1 11,0 1,4 4,3 6,4 0,0 9,0 -6,6 6,3 5,0 41,4 3,7 -2,8 1,0 14,1 -9,0 20,2


Ergebnisse: Reproduzierbarkeit am 1.+2. Tag* 

Gepaarte Differenzen 

1. Ansatz 

95% 

zu Mittelwert Standardabw. 

(s) 

(2-seitig) 

Standardfehler 

des Konfidenzintervall T 

Sig. 

2. Ansatz 

Mittelwertes der Differenz 

Untere Obere 

OIE ELISASPSS 1:625 8,8016 36,44877 8,15019 -8,2569 25,8602 1,080 0,294 



EG-Stop-Referenz, pos. 2,0582 14,33810 3,20610 -4,6523 8,7686 0,642 0,529 

EG-Referenz, pos. -1,7631 11,04204 2,46907 -6,9310 3,4047 -0,714 0,484 

EG-Referenz, pos. 50% 0,8705 8,06834 1,80414 -2,9056 4,6466 0,482 0,635 

EG-Referenz, pos. 25% 11,9514 13,91896 3,11237 5,4371 18,4657 3,840 0,001 

EG-Referenz, neg. -1,0132 6,17713 1,38125 -3,9042 1,8778 -0,734 0,472 

neg. Milch#1 -0,2200 6,13244 1,37125 -3,0900 2,6501 -0,160 0,874 





* T-Test bei gepaarten Stichproben (kritischer Wert: > 2,09; ƒ=19, α=0,05)

Mittelwert / Abweichung der Probenwerte über alle Teilnehmer 

Proben-ID 

OIE ELISASPSS 1:625 OIE ELISASPSS 1:1250 OIE ELISASPSS 1:2500 

Proben-Nr. 

1 14 10 22 

17 18 

Teilnehmer Tag 1 Tag 2 Tag 1 Tag 2 Tag 1 Tag 2 Tag 1 Tag 2 Tag 1 Tag 2 Tag 1 Tag 2 

1 331 247 303 215 186 167 203 145 116 106 109 107 

2 174 233 179 261 144 160 154 147 115 92 110 93 

3a 156 143 166 146 124 120 130 119 89 84 85 83 

3b 156 149 156 151 144 130 131 131 125 120 119 117 

4 144 138 137 132 122 121 125 120 82 87 84 88 

5 249 221 275 234 162 150 163 154 101 91 104 91 

7 151 182 154 183 125 151 119 149 86 112 91 113 

8 202 223 206 211 132 145 132 153 96 108 91 93 

9 214 205 186 213 120 143 123 120 67 80 81 82 

10 198 179 186 186 175 171 176 149 94 94 105 116 

12 229 262 216 209 161 175 161 155 108 98 70 101 

13 183 157 199 150 142 124 131 113 106 94 91 98 

14 151 134 152 132 99 82 105 122 72 73 82 81 

15 153 171 140 183 122 143 119 163 114 122 102 105 

16 169 174 164 172 131 134 129 143 87 91 90 92 

17 148 135 152 120 102 97 102 106 70 66 72 70 

18a 172 216 206 242 132 151 142 153 84 81 86 88 

18b 159 144 116 102 69 70 

19 180 173 184 119 138 134 135 103 68 91 96 87 

20 231 213 228 200 150 155 160 156 96 102 115 106 

21 202 140 226 144 164 121 171 126 126 93 119 91 

Mittelwert 188,2 184,8 188,5 180,0 137,7 138,7 138,8 136,3 93,8 94,2 93,9 95,2 

Median 174 176 184 183 132 143 131 144 94 93 91 93 

Standardabw. 44,7 38,8 42,9 41,5 22,0 23,3 25,1 18,5 17,4 14,4 14,2 12,6 

MW +2s 277,5 262,3 274,3 263,0 181,7 185,2 189,0 173,4 128,6 123,0 122,3 120,3 

MW +1s 232,8 223,6 231,4 221,5 159,7 161,9 163,9 154,9 111,2 108,6 108,1 107,8 

MW -1s 143,5 146,0 145,7 138,5 115,6 115,4 113,6 117,8 76,4 79,8 79,7 82,6 

MW -2s 98,8 107,2 102,8 97,0 93,6 92,1 88,5 99,3 59,0 65,4 65,5 70,0 

Variationskoe. 24 21 23 23 16 17 18 14 19 15 15 13 

Minimum 144 134 137 119 99 82 102 103 67 66 70 70 

Maximum 331 262 303 261 186 175 203 163 126 122 119 117


Ergebnisse: Anteil der abweichenden Probenwerte (%) 

Teiln. Nr. MW + 1s MW + 2s MW > 2s 

1 50,0 40,4 9,6 

2 88,5 11,5 0 

3a 98,1 1,9 0 

3b 26,9 36,6 *36,5 

4 88,5 11,5 0 

5 86,5 11,6 1,9 

7 88,5 11,5 0 

8 78,8 9,7 11,5 

9 86,5 13,5 0 

10 90,4 9,6 0 

12 38,5 94,2 5,8 

13 86,5 13,5 0 

14 71,2 25,0 3,8 

15 23,1 32,7 *44,2 

16 100,0 0 0 

17 67,3 32,7 0 

18a 96,2 3,8 0 

18b 53,8 19,3 *26,9 

19 63,5 30,7 5,8 

20 57,7 42,3 0 

21 80,8 19,2 0 

*kein Bommeli-ELISA


Schlußfolgerungen 

• Mindestanforderungen gemäß RL 64/432/EWG; VO 535/2002/EG 

wurden von allen Milch-ELISA-Tests erfüllt 

• Ringversuchs-Teilnehmer haben Brucella-positiven u.- negativen 

Milchproben bzgl. qualitativer Beurteilung korrekt erkannt 

• Abweichungen bei grenzwertigen Proben in Abhängigkeit des 

Systems der Auswertung (interne Testkontrolle vs. EG-Referenz) 

• gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse innerhalb der Doppelprobe 

und zwischen dem 1. + 2. Tag



Material und Methoden 

• OIE Standardserum (OIE SS) 

1. Verdünnung je nach Grad in Serum 

2. Verdünnung 1:10 in Milch 

Endverdünnung: 1:10.000 ‣ 1:15.000 ‣ 1:20.000 ... ‣ 1:40.000 

• Doppelprobe je Ansatz 

• Untersuchungen am Tag 1-5 (3 Tests) bzw. 1-2 (1Test) 

• Brucellose-Milch ELISA Kits von 4 Firmen 

(zugelassen nach § 17c TierSeuchG) 

• Auswertung der Ergebnisse (ELISA Index %) nach Testkontrolle



Ergebnisse / Testkit Boehringer 

Verdünnung 1: ELISA Index (%) Untersuchungstag Mittelw. Stdabw. 

1 2 3 4 5 

10.000 29,9 44,3 36,8 33,2 33,3 35,5 4,90 

15.000 24,5 33,5 29,8 25,3 28,6 28,3 3,26 

20.000 19,5 27,2 23,1 17,5 21,2 21,7 3,32 

25.000 17,8 24,1 20,6 17,4 19 19,8 2,40 

30.000 16,5 21,9 19,6 17,5 18,9 18,9 1,86 

35.000 15 19 16,6 13,3 14,8 15,8 1,93 

40.000 13,5 18,7 17,6 15 15,4 16,0 1,87 

ELISA Index (%) 

cut off: 

> 10 = positiv 

40 

30 

20 

10 

0 

10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 

Verdünnung 1:



Ergebnisse / Testkit Bommeli 


1 2 3 4 5 

10.000 176,5 302,1 163,8 229,1 170,1 208,3 50,03 

15.000 149,7 221,2 124,6 164,8 140,2 160,1 33,41 

20.000 113,5 182,5 94,8 119,4 118,2 125,7 29,30 

25.000 88,0 123,4 80,2 100,2 88,8 96,1 16,65 

30.000 80,7 134,5 68,2 87,8 79,9 90,2 22,87 

35.000 67,5 102,7 58,4 75,0 70,8 74,9 16,38 

40.000 63,5 103,7 53,5 68,9 67,2 71,3 17,75 


cut-off: 

> 70 = fraglich 


250 

200 

150 

100 

50 

0 

10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 

Verdünnung 1:



Ergebnisse / Testkit Pourquier 


1 2 3 4 5 

10.000 129 127 125 141 145 133,3 8,46 

15.000 115 108 115 125 126 117,9 6,56 

20.000 106 99,8 102 114 104 105,1 5,36 

25.000 98,7 86,2 94,4 107 100 97,3 6,95 

30.000 89,6 86,1 89,5 91,3 103 91,9 6,13 

35.000 99 94,1 101 101 114 101,9 10,77 

40.000 80,2 82 88,2 80,7 97,4 85,7 6,45 


cut off: 



150 

100 

50 

0 

10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 

Verdünnung 1:



Ergebnisse / Testkit Synbiotics 


1 2 3 4 5 

10.000 128 127 - - - 127,4 0,61 

15.000 105 109 - - - 107,2 2,09 

20.000 93,7 98,6 - - - 96,2 2,45 

25.000 87,3 97,8 - - - 92,5 5,26 

30.000 88,2 94,1 - - - 91,1 2,95 

35.000 97,2 104 - - - 100,8 3,60 

40.000 83,9 85,7 - - - 84,8 0,86 


cut off: 



150 

100 

50 

0 

10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 

Verdünnung 1:




• in allen 4 Brucellose Milch-ELISA Tests wurde das OIE- 

Standardserum in einer Endverdünnung von 1:10.000 an allen 

Untersuchungstagen als Brucella-positiv erkannt; 

‣ die Anforderungen an die diagnostische Sensitivität wurden erfüllt 

• das OIE-Standardserum wurde in einer Endverdünnung von 1:25.000 

bis 1:40.000 als Brucella-positiv bzw. -fraglich beurteilt; 

‣ bei den ELISA Tests war die analytische gegenüber der diagnostischen 

Sensitivität deutlich höher 

• die quantitativen Ergebnisse (ELISA-Index %) waren an den 

verschiedenen Untersuchungstagen von Test zu Test unterschiedlich 

reproduzierbar: Stdabw.: (+) 1,86 - 4,90 / (-) 16,38 - 50,03

(5) Simulation von Poolgrößen für die Untersuchung 

von Milch auf Brucella-Antikörper 

Material und Methoden 

• OIE Standardserum (OIE SS) 

1. Verdünnung 1:150 in Serum (Sensitivität / Einzeltier) 

2. Verdünnung je nach Poolgröße in Milch 

Poolgrößensimulation: 25 ‣ 50 ‣ 100 ‣ 150 ‣ 200 Tiere 

• Doppelprobe je Ansatz 

• Untersuchungen am Tag 1-5 (3 Tests) bzw. 1-2 (1 Test) 

• Brucellose-Milch ELISA Kits von 4 Firmen 

(zugelassen nach § 17c TierSeuchG) 

• Auswertung der Ergebnisse (ELISA Index %) nach Testkontrolle



Ergebnisse / Testkit Boehringer 

Pool ELISA Index (%) Untersuchungstag Mittelw. Stdabw. 

(Tierzahl) 1 2 3 4 5 

25 61 61,8 53,8 52,6 58,3 57,5 3,71 

50 49,3 42,1 40,4 35,2 39,3 41,3 4,61 

100 33,5 27,3 26,1 23,3 24,2 26,9 3,61 

150 24,4 16,8 17,4 18,6 16,7 18,8 2,91 

200 20,1 15,7 15,8 16,9 11,9 16,1 2,64 


cut off: 


70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

25 50 100 150 200 

Poolgröße



Ergebnisse / Testkit Bommeli 


(Tierzahl) 1 2 3 4 5 

25 413,1 435,0 333,9 411,2 312,0 345,0 48,24 

50 409,9 329,3 240,7 295,4 222,0 291,0 113,26 

100 403,9 215,9 153,4 196,2 147,7 225,0 140,39 

150 367,8 148,0 103,8 151,2 118,0 185,0 168,80 

200 230,7 122,5 88,9 119,1 93,3 167,0 173,41 


cut-off: 



400 

300 

200 

100 

0 

25 50 100 150 200 

Poolgröße



Ergebnisse / Testkit Pourquier 


(Tierzahl) 1 2 3 4 5 

25 151 142 159 173 150 155,1 10,60 

50 134 130 136 151 141 138,3 6,93 

100 114 113 117 111 109 112,9 2,87 

150 97,6 97,5 102 90 92,4 95,9 4,10 

200 86,4 85,1 91,9 75,8 77,2 83,3 6,52 


cut off: 



200 

150 

100 

50 

0 

25 50 100 150 200 

Poolgröße



Ergebnisse / Testkit Synbiotics 


(Tierzahl) 1 2 3 4 5 

25 225 254 - - - 239,5 14,48 

50 153 196 - - - 174,8 21,40 

100 117 138 - - - 127,5 10,08 

150 99 122 - - - 110,3 11,31 

200 84,1 102 - - - 92,8 8,75 


cut off: 



300 

200 

100 

0 

25 50 100 150 200 

Poolgröße




• in allen 4 Brucellose Milch-ELISA Tests wurde das schwach-positive 

OIE Standardserum (Verdünnung 1:150) in simulierten Milchpools 

von 25 bis 150 Tieren als Brucella-positiv und in einem Pool von 200 

Tieren als Brucella-positiv bzw. -fraglich erkannt 

‣ selbst in größeren Pools von 100 -200 Tieren können einzelne 

schwach-positive Brucella-Seroreagenten mit dem Milch-ELISA 

nachgewiesen werden 

• die quantitativen Ergebnisse (ELISA-Index %) waren an den 

verschiedenen Untersuchungstagen von Test zu Test unterschiedlich 

reproduzierbar: Stdabw.: (+) 2,64 - 4,61 / (-) 48,24 - 173,41

Danksagung 

• den Mitarbeitern des NRL Brucellose: P. Bahn, A. Draeger 

• dem VLA Weybridge: John Mc Given, Alastair MacMillan 

• den Firmen Boehringer, Bommeli, Pourquier, Synbiotics 

Vielen Dank 

für Ihre Aufmerksamkeit !

Brucellose Milch-ELISA

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