BE 319 128 111 80 HE 255 92 64 100 MV 19 1

Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger (INNT) 

Ute Ziegler, Diana Seidowski, Martin Eiden und Martin H. Groschup 

AVID-Tagung "Virologie" 2010. 15.-17. September 2010 in Kloster Banz


Flaviviridae 

Flavivirus 

• Gelbfiebervirus (YFV) 

• Denguevirus Typ1-4 (Dengue-Virus) 

• Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME) 

Japan-Enzephalitis-Virus-Serokomplex 

• Japan-Enzephalitis-Virus 

• St.-Louis-Encephalitis-Virus 

• Murray-Valley-Enzephalitis-Virus 

• West-Nil-Virus, Kunjin-Virus 

• Usutu-Virus 

Pestivirus 

BVDV 

KSPV 

Hepacivirus 

Hepatitis-C-Virus 

• 45-50 nm, behüllt 

• ss(+) RNA, 11 kb, 

ikosaedrisches Capsid (35 nm) 

• 1 ORF, 1 Polyprotein (>3400 AS) 

(Envelope) 

(Memrane) 

(Core)


Klinik: Vögel 

West Nil-Virus 

Übertragung 

Reservoir 

Wildvögel 

Vektor 

Culex spp. 

„Brücken-Vektoren“ 

Infektion in der Regel symptomlos (Wildreservoir), 

Passeriformes, v. a. Corviden besonders empfänglich 

(massives Vogelsterben in USA seit WNV-Eintrag 1999, 

Amerikanische Krähe/Corvus brachyrhynchos, Blauhäher/ Cyanocitta cristata) 

Klinik: Mensch 

80% der Infektionen asymptomatisch, 

20 % „West-Nil-Fieber“, 


Verbreitung des WNV 

1999 

nach Mackenzie et al. 2004


Jahr 

Bedeutender 

Ausbruch in Linie 

Menschen 

krank / 

Pferde 

krank / 

Vögel 

krank / 

1937 Uganda 2 1 

1951 Ägypten 1 123 / 0 

1962/63 Frankreich 1 einige 80 / 24 

1974 Südafrika 2 18.000 / 0 

1994 Algerien 1 50 / 8 

1996 Rumänien 1 835 / 17 

1996 Marokko 1 1 94 / 42 

1998 Italien 1 keine 14 / 6 

1998 – 2000 Israel 1 417 / 33 einige Gänse 

1999 Russland 1 480 / 40 


�� 9/2010 

… 

USA (NewYork) 

�� Kanada 

�� Mittel- und 

Südamerika 


1 31.108 / 1.169 

(cdc.gov, 

07.09.2010) 

> 25.000 / 

30-40% (?) 

unzählige, 

v.a. Corviden 

(Blauhäher, 

Am. Krähe etc.)


Anzahl der Fälle 

12000 



6000 

4000 

2000 

0 


2000 

2001 

WNV-Erkrankungen beim Menschen 

in den USA von 1999-2010 

2002 

2003 

2004 

2005 

Jahr 

2006 

2007 

2008 

2009 

09/2010 

gestorben 

unspez. Klinik 

Fieber 

Enzephal./Mening.

Institut für WNV neue und neuartige in Europa Tierseuchenerreger und (INNT) der mediterranen Region: 

1950 - 2010 

Portugal 


Frankreich 

2003, 2004, 2006 

Frankreich 2000 

Frankreich 

1962, 1965 

Spanien 

2010 

2007 

Marocco Marocco 

2003 1996 

2010 

Algerien 


Österreich 

2008 

Italien 


Tschech. Rep. 


Russland 

Ungarn 

1999-2002 

2003-2008 

2010 Rumänien 

1996-1998 

Italien 

2010 

2008, 2009 

2010 Griechenland 2010 

Tunesien 


Ägypten 


Türkei 2010 

Israel 

1951, 1957 

Israel 

1998-2000 

Russland 

2005-2008 

2010 

modifiziert nach Jiménez-Clavero et al. 2009


Jahr 

Bedeutender 

Ausbruch in Linie 

Menschen 

krank / 

Pferde 

krank / 

Vögel 

krank / 

2000 Frankreich 1 keine 76 / 21 

2003 Frankreich 1 7 / 0 4 / 1 

2003 Marokko 1 8 / 5 

2003 Ungarn 1 14 / 0 keine Gänse 


2004, 2005, 

2007 

�� 2008 

Ungarn 2 20 / 0 15 / 0 ~15 Habichte, 

~ 5 Falken 


2007 Spanien 1 keine ? Greifvögel 

2008 (Nord-)Italien 1 9 / 3 32 / 5 Elster, 

Taube 

2008 Österreich 2 keine keine ~10 Habichte 

2009 


Falke, Kea 

(Nord-)Italien 1 16 / ? 33 (79) / 8 Elster,Taube, 

Krähe


Türkei 

Ungarn 

Italien 

Spanien 

Marokko 

2010 

Griechenland 

Rumänien 

Russland 

(Wolgograd) 

Mensch 

114 infizierte: 

- davon 9 tödlich 

(promed: 27.08.10) 

7 infizierte: 


(promed: 12.09.10) 



(promed: 12.09.10) 



(promed: 04.09.10) 

3 Fälle 

(promed: 07.09.10) 

Pferd 

5 Ausbrüche: 

- 18 empfängliche 

- 5 klinische Fälle 

(oie: 27.08.10) 

4 Ausbrüche: 


- 4 klinische Fälle, davon 1 tot 

(promed: 07.09.10) 

2 Ausbrüche: 


- 2 klinische Fälle 

(promed: 10.09.10) 

16 Ausbrüche: 

- 111 empfängliche 

- 17 klinische Fälle, davon 8 tot 

(promed: 18.08.10) 

Linie 2 Virus


Bericht aus dem Referenzlabor: 

Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen (TierSeuchAnzV) 

neugefasst durch B. v. 03.11.2004 BGBl. I S. 2764; 

zuletzt geändert durch Artikel 5 V. v. 18.12.2009 BGBl. I S. 3939; Geltung ab 01.06.1991 

FNA: 7831-1-49-3; 7 Wirtschaftsrecht 78 Landwirtschaft und Ernährungswirtschaft 

783 Veterinärwesen 7831 Tierseuchenbekämpfung 

Änderungen / Synopse | 6 Gesetze verweisen aus 7 Artikeln auf TierSeuchAnzV 

12e. Infektion mit dem West-Nil-Virus bei einem Vogel oder Pferd 

seit 18.12.2009 Anzeigepflicht 

Bundesanzeiger 

S. 1149 vom 18. März 2010



Was bei WNV – Nachweis? � bisher keine VO für Deutschland 

nach Chapter OIE vorgehen (8.16): 

� folgende Kriterien definieren das Vorkommen von WNF: 

1. WNV wurde von einem Tier isoliert, welches Zeichen von WNF zeigt 

2. spezifisches virales AG oder virale RNA wurde aus Proben von einem 

oder mehreren Tieren isoliert, welche Zeichen von WNF zeigen oder die 

epidemiologisch verbunden sind mit einem bestätigten oder mutmaßlichen 

WNF-Ausbruch 

3. WNV-Ak wurde im Tier gefunden, die nicht von einer Vakzination 

herstammen, welches klinische Symptome von WNF zeigt oder das 

epidemiologisch verbunden ist mit einem bestätigten oder mutmaßlichen 

WNF-Ausbruch


Nachweismethoden einer WNV-Infektion: 

Viremia 

Viral RNA 

Symptoms 

Infection Onset of Disease 

2-4 

fever 3-7 days 

months 

> 1 year 

nach S. Lecollinet, 2009


Virologie Serologie 

• RT-nPCR 

• qRT-PCR 

• Virusisolierung 

• IHC (Ag-Nachweis) 

Untersuchungsmethoden 

Immunoassays 

• indirekter 

Immunfluoreszenz-Test (IIFT) 

• IgG- ELISA (comp. /indirekt) 

• IgM-ELISA (indirekt) 

Neutralisationstests (NT) 

• VNT 

• PRNT 90


Lanciotti et al. 

Linke et al. 

FLI-1 

CDC-WN Env-r (1209, 100.0%) 

CDC-WN Env-probe (1186, 100.0%) 

CDC-WN Env-f (1160, 100.0%) 

RKI-ProC-R (132, 100.0%) 

INNTr1.5nc.100 (100, 100.0%) 

INNTr2.5nc.97 (97, 100.0%) 

RKI-ProC-TM (89, 100.0%) 

INNTs2.5nc.23 (21, 100.0%) 

RKI-ProC-F1 (10, 100.0%) 

INNTf1.5nc.1 (1, 100.0%) 

INNTf2.5nc.1 (1, 100.0%) 

preM 

C 

FLI-WNF6-R (3603, 100.0%) 

FLI-WNF-Probe3-FAM (3581, 100.0%) 

FLI-WNF5-F (3558, 100.0%) 

M gpE NS1 

NS2A 

NS2B 

FLI-2 

CDS 1 

WN V .N Y 9 9 flamingo.A F1 9 6 8 3 5 

11029 bp 

one-step quantitative real time-PCR (qRT-PCR) 

NS3 

NS4A 

NS4B 

QLD-Flav100F (8320, 100.0%) 

Flav-probe1 (8443, 100.0%) 

Flav-probe2 (9029, 100.0%) 

NS5 

QLD-Flav200R (9109, 100.0%) 

5`NTR 3`NTR 

Eiden et al. 2010, J Vet Diagn Invest 22:748–753 

Sp-WN-LCV-F1 (10597, 100.0%) 

Sp-WN-LCV-S2 (10633, 86.7%) 

Sp-WN-LCV-S1 (10633, 100.0%) 

Jimenez-Clavero et al. 

Sp-WN-LCV-R1 (10649, 100.0%) 

CDC-WN 3ŃC-f (10668, 100.0%) 

CDC-WN 3ŃC-probe (10691, 100.0%) 

CDC-WN 3ŃC-r (10756, 100.0%)

qRT-PCR 


sample FLI-1 

Linke et al. 

(RKI) 

Lanciotti et 

al. 

(CDC) 

FLI-2 

Jimenez- 

Clavero et 

al. (INIA) 

Virus Dilution Ct Ct Ct Ct Ct 

NY99 10-1 17,25 19,58 15,15 17,69 18,07 

10-2 19,95 23,27 17,89 20,69 22,21 

10-3 24,76 26,87 21,48 24,39 25,74 

10-4 28,01 30,25 25,44 27,72 29,45 

10-5 31,13 32,56 28,21 31,34 32,46 

10-6 34,39 No Ct 31,22 34,46 37,68 

10-7 38,76 No Ct 34,49 37,04 No Ct 

Uganda 10-1 

10-8 

18,04 

38,42 No 

21,42 

Ct 

No 

40,19 

Ct 

No 

19,99 

Ct 36,86 

22,15 

10-2 

10-9 

22,69 

No Ct No 

26,94 

Ct No 

31,95 

Ct No 

23,79 

Ct No 

27,12 

Ct 

10-3 26,1 29,8 No Ct 26,87 30,90 

10-4 29,32 33,3 No Ct 30,54 33,02 

10-5 33,06 No Ct No Ct 33,02 No Ct 

10-6 35,22 No Ct No Ct 36,68 38,20 

10-7 36,85 No Ct No Ct 41,07 No Ct 

10-8 No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct 

Table 1: Sensitivity of the quantitative real-time PCR assays for WNV strains NY99 (Lin.1) and Uganda 956 (Lin.2) 

10-9 No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct


Virologie Serologie 

• RT-nPCR 

• qRT-PCR 

• Virusisolierung 

• IHC (Ag-Nachweis) 

Untersuchungsmethoden 

Immunoassays 

• indirekter 

Immunfluoreszenz-Test (IIFT) 

• IgG- ELISA (comp. / indirekt) 

• IgM-ELISA (indirekt) 

Neutralisationstests (NT) 

• VNT 

• PRNT 90



Prüfung von ELISA`s: 

1. kompetitiver ELISA für Pferde, Hühner, Enten und Gänse von ID VET 

(ID Screen ® West Nile Competition) 

2. IgM ELISA für Pferde von IDEXX (Pourquier ELISA IgM WNV) 

- In house ELISA-Methoden auf der Basis von 

rekombinantem E-Protein oder der 

Domäne III 

Nach Nybakken et al., 2006: 

Crystal structure of the West Nil Virus 

envelope glycoprotein


Immunfluoreszenz-Technik 

OT-System: von Firma EUROIMMUN 

(für human) 

Anti-West-Nil-Viren-IIFT (IgG) 

humanes Serum (RKI) 

„goat-anti-horse“ 

Pferd 

Möglichkeiten der Untersuchung 

von Pferde- und Vogelseren 

im S2-Bereich 

„konjugat-abhängig“ 

„goat-anti-bird“ 

anti WNV + Huhn Rc2 

ICL, Inc. 

„rabbit-anti-bird“ 

(2. Ab: goatt anti rabbit) 

für eine Vielzahl von Vogelspezies


VNT 

(nach Linke et al. 2007, Mildenberg pers. com.) 

Vero E6 (1d) 

1,5x10 5 /ml 

WNV-Strain NY99 

100 KID 50 /50µl 

Inkubation bei 37°C, 5%CO 2 ; Ablesen nach 6-7 d 

nativ oder nach Färbung mit 1% Kristallviolett 

Neutralisationstest (NT): 

Virus + Serum 

SK 1:10 1:20 1:40 1:80 SK 1:10 1:20 1:40 1:80 VK ZK 

PRNT 90 

(nach Weingartl et al. 2003, Lecollinet pers. com.) 

Vero B4 (1d) 

1,0x10 5 /ml 

Virus + Serum 

WNV-Strain NY99 

100 pfu /200µl 

1:5 1:15 1:45 

1:135 1:405 VK 

Inkubation bei 37°C, 5%CO2 ; Ablesen nach 3 d 

nach Färbung mit NBF/KV-Mischung 

BSL 3



Teilnahme: 

im Juni Ringtest vom EU-Referenzlabor 

- PCR ( 15 RNA-Proben, qRT-PCR) 

- Serologie (16 Seren, ELISA + NT) 

im August, QCMD 2010 West Nile Virus RNA EQA Pilot Study 

Ergebnisse stehen noch aus


Verbundprojekt (2007-2010) 

Arbovirusinfektionen in Deutschland: 

Pathogenese, Diagnostik und Überwachung 

Probensammlung 

Wildvögel 

Zugvögel 

Standvögel 

Freilandgeflügel 

Enten 

Gänse 

Hühner 

Pferde 

Einschleppung ? 

Indikator ? 

Indikator ? 

Indikator ? 

West-Nil-Virus: 

Studien zur Antikörper- und Virusprävalenz in Deutschland und zu 

allgemeinen die Übertragungseffizienz zwischen Mensch und Vogel 

modulierenden Faktoren


Herkunft der Wildvogelproben (Bundesland) 

Ciconiiformes 

25 

Ciconiiformes 

867 

Accipitriformes/Falconiformes 

Accipitriformes/Falconiformes 

Strigiformes 

Anseriformes 

Strigiformes 

Charadriiformes 

Anseriformes 

Charadriiformes 

Passeriformes 

Other 

Passeriformes 

Other 

andere 

SH & NI (∑ =997) 

(Schreitvögel) 

(Eulenvögel) 

445 

445 

(Gänsevögel) 

BW (∑ =240) 

(Greifvögel) 

(Regenpfeiferartige) 

(Sperlingsvögel) 


972 

37 

2 

∑ =3030 

29 

MV (∑ =772) 

446 

429 

SN (∑ =15) 

1 

1 

4 

21 

BE & BB (∑ =1006) 

14 

93 

19 

124 

256 

3 

34 

55 

1 

64 

207 

5 

445


Herkunft 

(Geflügel) ∑ 2005 2006 2007 2008 

BB 514 55 219 40 200 

HE 20 20 

MV 200 100 100 

NW 160 50 110 

ST 40 40 

TH 205 205 

∑ 1139 55 219 455 410 

Spezies ∑ 

Huhn 60 

Ente 435 

Gans 644 


Herkunft 

(Pferde) ∑ 2007 2008 2009 

BY 81 - 81 - 

BE 319 128 111 80 

HE 255 92 64 100 

MV 19 1 - 18 

NI 94 - 63 31 

NW 160 - 80 80 

SN 204 70 83 51 

TH 69 24 45 - 

BW 80 - - 80 

∑ 1282 315 527 440


Zusammenfassung Surveillance-Studie 

� Sammlung und Untersuchung von > 5000 Proben von Vögeln und Pferden 

� verschiedene Nachweisverfahren (VNT, IIFT, ELISA, RT-nPCR, qRT-PCR) 

� Nachweis von WNV-Ak –Titern in der Wildvogelpopulation �� Zugvögel 

(Kontakt in Endemiegebieten) 

� kein Hinweis auf Zirkulation des WNV in Pferdepopulationen und 

Wirtschaftsgeflügelbeständen 

� in keiner untersuchten Probe WNV-spezifische Nukleinsäure nachweisbar, 

bisher kein Nachweis von WNV (-Genom) in Deutschland 

� derzeit kein Hinweis auf autochthone WNV-Infektion in Deutschland 

Seidowski et al. 2010, Vect. Borne Zoon. Dis, 2010 Oct;10(7):639-47 

Ziegler et al. 2010, Arch Virol. 2010 Jun;155(6):965-9


FLI 

Diana Seidowski 

Ines Nedow 

Dr. Markus Keller 

Dr. Martin Eiden 

Prof. Martin H. Groschup 

Dr. Bernd Hoffmann 

Dr. Anja Globig 

Dr. Christian Grund 

Dr. Timm Harder 

Dr. Horst Schirrmeier 

Dr. Thomas Müller 

PD Dr. Franz Conraths 

Colleagues abroad 

Dr. Sylvie Lecollinet, France 

Prof. Peter Timoney, USA 

Prof. Norbert Nowotny, Austria 

Dr. Yu-Wei Chang, USA 

Dr. Eileen Ostlund, USA 

Dr. Zvia Mildenberg, Israel 

Paul-Ehrlich-Institut 

Prof. Micha Nübling 

BNI Hamburg 

Prof. Herbert Schmitz 

Dr. Petra Emmerich 

Arbo-Network Partner 

Prof. Frank Hufert, Göttingen 

Dr. Manfred Weidmann, Göttingen 

Prof. Matthias Niedrig, Berlin 

Dr. Gerhard Dobler, München 

Prof. Martin Pfeffer, München 

Landesuntersuchungsämter: 

Rostock / Veterinäramt PCH + OVP 

Frankfurt (Oder) 

Bad Langensalza 

Heidelberg, Stuttgart 

(Wolmirsleben) 

Veterinärmedizinische 

Fakultäten 

Prof. Dr. B. Hertsch (Berlin) 

Prof. Dr. A. Grabner (Berlin) 

Dr. K. Müller (Berlin) 

PD Dr. K.Fey (Gießen) 

Prof. Dr. W. Brehm (Leipzig) 

Prof. Dr. Feige (Hannover) 

Prof. Dr. Gerhards (München) 

Pferdekliniken und 

Ornithologen 

Geflügelpraktiker 

Prof. Franz Bairlein (Helgoland), Drs. Hüpopp 

(Helgoland),Dr. Uli Köppen (Hiddensee), Dr. Wolfgang 

Fiedler (Radolfzell), Dr. Daniel Schmidt (NABU), Dr. 

Jochen B.W. Wolf (MPI, Plön), Dr. Norbert Kenntner 

(IZW), Dr. Thomas Heinicke (DDA), Matthias Streitz 

(Charité), Matthias Bräse, Frank Tetzlaff 

und viele Vogelberinger und Volontäre

BE 319 128 111 80 HE 255 92 64 100 MV 19 1

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