MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Identifzierung klinisch ...

mikrobiologie
S. Burak, A. Gehrt 1
Verkürzte Analysezeit bei höherer Genauigkeit
MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Identifizierung klinisch relevanter Mikroorganismen
Die korrekte und gleichzeitig schnelle
Identifizierung von Mikroorganismen
bis auf Speziesebene stellt einen der
Eckpfeiler der Medizinischen Mikrobiologie
dar. Zusammen mit der
Resistenzbe stimmung liefert sie die nötigen
Infor ma tionen zur Auswahl geeigneter
Anti infektiva. Insbesondere bei
schweren mikrobiellen Infektionen
kann der frühzeitige Einsatz einer zielgerichteten,
adäquaten Antibiotika-
Therapie entscheidend zum Therapieerfolg
beitragen und unter Umständen
lebensrettend für den betroffenen Patienten
sein. In diesen Fällen wird man
nicht bis zum Vorliegen der Resistenzbestimmung
warten, sondern bereits
vorher mit einer empirischen antibiotischen
Therapie beginnen. Eine zeitnahe
Identifizierung der pathogenen Erreger
kann hierzu bereits wertvolle Informationen
liefern.
Anforderungen an die
Erregeridentifizierung
1
Dr. rer. nat. Sonja Burak, Dr. med. Andreas Gehrt
Medizinische Laboratorien Düsseldorf
Die klassischen Verfahren zur Erregeridentifizierung
in der Medizinischen
Mikro biologie umfassen neben der mikroskopischen
Darstellung zellmorphologischer
Eigenschaften in erster Linie biochemische
Tests, welche auf artspezifischen
Wachstumsmustern und metabolischen
Aktivitäten der Zellen beruhen. Die Mikroorganismen
müssen hierfür zunächst angezüchtet
und als Reinkultur isoliert werden,
um sie gegebenenfalls von der
physiologischen Flora zu trennen und genügend
Zellmaterial zu erhalten. Abhängig
von der Wachstumsgeschwin digkeit bzw.
Generationszeit des Mikroorganismus, erfordert
dies mindestens ein bis zwei Tage,
kann jedoch bei langsam wachsenden
Bakterien- und Pilzarten auch deutlich
länger dauern. Die eigentliche biochemische
Identifizierung nimmt dann in der
Regel trotz weitgehender Automatisierungsmöglichkeiten
nochmals einige Stunden
bis mehrere Tage in Anspruch. Den
Anforderungen einer schnelleren und ge­
1naueren
Erregeridentifizierung kann daher
nur durch den Einsatz neuer Methoden in
der Laborroutine begegnet werden. Eine
Möglichkeit sind molekulargenetische Methoden
wie die partielle Sequenzierung der
bakteriellen 16S-rDNA. Sie wird zwar in der
Forschung eingesetzt, ist für einen breiten
Einsatz in der Routine diagnostik jedoch zu
zeitaufwändig und kostenintensiv. Eine
neue, deutlich schnellere und kostengünstigere
Alternative stellt die Identifizierung
von Bakterien und Pilzen mittels MALDI-
TOF Massenspektrometrie dar, die im Folgenden
vorgestellt werden soll.
Abb. 1: Prinzip der MALDI-TOF Massenspektrometrie. Die Analytmoleküle (z. B. Proteine, grün) bilden
zusammen mit den Matrixmolekülen (gelb) Kristalle auf dem Target. Durch Laserbeschuss werden die
Proteine desorbiert und ionisiert, durch ein elektrisches Feld werden sie beschleunigt, und in der
Driftstrecke im Vakuum des Flugrohres werden sie dann nach ihrer Masse und Ladung aufgetrennt.
Die Flugzeiten der detektierten Ionen werden schließlich in Massenspektren umgewandelt.
MALDI-TOF MS: Ein
massenspektrometrisches
Verfahren zur Proteinanalytik
Unter Massenspektrometrie versteht man
ein Analyseverfahren, das die Auftrennung
ionisierter Teilchen nach ihrem
Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) ermöglicht.
Es geht zurück auf den britischen
Physik-Nobelpreisträger J. J. Thomson, der
1912 zum ersten Mal verschiedene Neon-
Isotope aufgrund ihrer Masse trennen
konnte, und dessen Schüler F. W. Aston
1919 das erste funktionierende Massenspektrometer
baute.
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Jedes Massenspektrometer besteht aus
einer Ionenquelle, die aus dem Probenmaterial
gasförmige Ionen erzeugt, einem
Massenanalysator, der die Ionen nach ihrem
Masse/Ladungs-Quotienten auftrennt,
und einem Detektor, der das Massenspektrum
der untersuchten Probe
liefert. Inzwischen sind verschiedene Verfahren
der Massenspektrometrie entwickelt
worden, die sich vor allem durch die
Art der Ionisierung des jeweiligen Analyten
und durch die nachfolgende Ionen-
Auftrennung unterscheiden. Eines dieser
Verfahren ist die sogenannte MALDI-TOF
MS. Das Kürzel steht für Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionisation Time of
Flight Mass Spectrometry, eine Technik
zur massenspektrometrischen Auftrennung
von Makromolekülen, welche 1985
von F. Hillenkamp und M. Karas entwickelt
wurde. Das Besondere hierbei ist die
schonende Ionisierung, bei der die Analytmoleküle
nicht zerstört werden. Dadurch
ermöglicht diese Methode erstmals
auch die Analyse von nicht-flüchtigen Biomolekülen
größerer Molekülmasse (über
20–30 kDa) wie Proteinen und Peptiden,
sowie von komplexen Analytmischungen.
Daher ist sie zu einer der wichtigsten Methoden
in der Proteomanalytik geworden.
Die Funktionsweise eines MALDI-TOF
Massenspektrometers ist schematisch in
Abbildung 1 dargestellt. Geringe Mengen
der zu untersuchenden Moleküle oder Molekülgemische
werden auf einen kleinen
Probenträger (Target) aufgetragen und dort
mit einem großen Überschuss der sogenannten
Matrix gemischt, die zur Ionisierung
der Analytmoleküle erforderlich ist.
Als Matrix können verschiedene niedermolekulare,
aromatische organische Säuren
wie z. B. 2,5-Dihydroxy-Benzoesäure
(DHB) oder α-Cyano-Hydroxyzimtsäure
(CHCA) eingesetzt werden, die in der Lage
sind, die Energie des eingesetzten Lasers zu
absorbieren. Durch Trocknung des Matrix-
Analyt-Gemisches entsteht eine kristalline
Probe, in welcher die Makromoleküle des
Analyten in die kleinen Matrixmoleküle
eingebettet sind. Diese Probe wird im
Hochvakuum des Massenspektrometers
mit kurzen Laserpulsen beschossen. So
werden sowohl Matrixmoleküle als auch
Analytmoleküle aus der Kristalloberfläche
herausgelöst und in die Gasphase überführt
(Desorption). Durch Kollision der
neutralen Analyt- mit den protonierten Matrixmolekülen
kommt es zur Ladungsübertragung,
so dass die Analytmoleküle ionisiert
werden. Man bezeichnet dies als
„sanfte Ionisierung“, da die komplexen Biomoleküle
bei der Ionisierung nicht frag­
1Abb. 2: Massenspektrum eines Escherichia coli Stammes.
mentieren, so dass sie als intakte, meist einfach
protonierte Ionen detektiert werden
können. Hierzu werden sie oberhalb der
Ionenquelle zunächst in einem starken
elektromagnetischen Feld beschleunigt,
wobei die schwereren Ionen aufgrund ihrer
höheren Trägheit langsamer sind als die
leichteren.
In der feldfreien Driftstrecke des langen
Vakuum-Flugrohres können sie dann aufgrund
ihrer unterschiedlichen Geschwindigkeiten
aufgetrennt werden und erreichen
den Detektor nach unterschiedlichen Flugzeiten
(time-of-flight). Dort werden die auftreffenden
Ionen registriert, und durch Kalibrierung
des Systems mit Ionen bekannter
Masse kann das Massenspektrum der detektierten
Probe ermittelt werden. In Abbildung
2 ist ein typisches Massenspektrum eines
Escherichia-coli-Stammes dargestellt, in
dem die Masse/Ladungs-Verhältnisse (m/z)
gegen die Signalintensität aufgetragen sind.
Identifizierung von
Mikroorganismen: Eine neue
Anwendung für die MALDI-TOF MS
In den 1990er Jahren wurde erstmals eine
Messmethode für MALDI-TOF MS publiziert,
welche die Analyse ganzer Zellen
ohne vorherige Extraktionsschritte ermöglicht.
Diese Methode kann zur Identifizierung
von Mikroorganismen genutzt werden.
Sie beruht auf der Tatsache, dass die
Massenspektren ganzer Bakterienzellen
bestimmte artspezifische und reproduzierbare
Peaks aufweisen. Es handelt sich um
die Massensignale kleiner, konservierter
Strukturproteine, die bei Mikroorganismen
relativ unabhängig vom physiologischen
Status der Zelle und damit von den Kulturbedingungen
in hohen Konzentrationen
vorliegen. Man findet sie im Massenbereich
von 2.000 bis 20.000 Dalton und geht
davon aus, dass es sich überwiegend um ribosomale
und andere DNA-bindende Proteine
handelt. Da ihre Sequenzen hochkonserviert
sind, spiegeln die messbaren
Sequenz- bzw. Massenunterschiede die
phylogenetischen Unterschiede zwischen
Bakterienarten und -gattungen wider. Damit
können sie als Biomarker zur Speziesidentifizierung
genutzt werden, indem man
die gemessenen Proteinspektren gegen
eine Datenbank mit Referenzspektren abgleicht.
Die Qualität dieser Referenz-Datenbank
ist letztlich entscheidend für die
Identifizierungsraten und für die Zuverlässigkeit
eines solchen Systems.
Diese neue spektrometrische Identifizierungsmethode,
auch ICM-MS (Intact
Cell MALDI-TOF Mass Spectrometry) genannt,
wurde zunächst anhand einiger
gramnegativer und grampositiver Bakteriengruppen
etabliert. Inzwischen sind viele
Arbeiten zu diesem Thema publiziert, und
es konnte für eine Vielzahl klinischer Mikroorganismen
nachgewiesen werden, dass
eine Identifizierung basierend auf MALDI-
TOF Massenspektren möglich ist. Beispiele
sind Staphylokokken, Streptokokken,
Nonfermenter, Enterobacteriaceae,
aber auch mit konventionellen Methoden
schwieriger zu identifizierende bakterielle
Spezies wie Anaerobier, Mykobakterien,
Bacillus-Sporen, Helicobacter und Campylobacter,
Mykoplasmen, Legionellen und
weitere Gattungen. Auch Hefen, Dermato­
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phyten und Schimmelpilze können mittels
MALDI-TOF MS identifiziert werden,
was die Routinediagnostik von Pilzinfektionen
erheblich verkürzt und erleichtert.
Das Messprinzip ist für alle Gruppen
von Mikroorganismen gleich: Eine geringe
Menge Zellmaterial wird von der Kulturplatte
auf ein MALDI-Target übertragen,
dort mit der Matrixlösung gemischt und
nach dem Auskristallisieren im Massenspektrometer
analysiert. Auch Flüssignährmedien
können abzentrifugiert und
die Zellpellets aufgetragen werden. In der
Regel erfolgt dies ohne eine Vorbehandlung
des Zellmaterials. Lediglich bei Hefen
und Schimmelpilzen, deren Zellwand
schlechter aufzuschließen ist als die bakterielle
Zellwand, kann eine vorherige Extraktion
der Zellen in geeigneten Lösungsmitteln
oder eine Vorbehandlung mit
Formiat nötig sein, um eine ausreichende
Qualität der Spektren zu erzielen.
Einsatz im Routinelabor:
Verbesserung von Workflow
und Diagnosezeiten
Die wesentlichen Voraussetzungen für den
Einsatz einer solchen Methode in der Diagnostik
eines Routinelabors sind: Eine einfache
Probenvorbereitung, kurze Messzeiten
bis zum Ergebnis, eine automatisierbare
Abarbeitung großer Probenmengen und
natürlich eine breit aufgestellte, gut gepflegte
Referenzdatenbank zum Abgleich
der gemessenen Spektren. Wichtig ist, dass
die Datenbank nicht nur Spektren altbekannter
Typstämme, sondern vor allem
die Variabilität aktueller klinischer Isolate
innerhalb einer Bakterienspezies abbildet.
Ebenso wichtig ist ein Algorithmus, der im
Zuge des Datenbankabgleiches entweder
ganze Spektren oder gewichtete Peaks innerhalb
der Spektren miteinander vergleicht
und die Ergebnisvalidität mittels eines
Wahrscheinlichkeitswertes angeben
kann, wie er auch bei konventionellen
Identifizierungssystemen üblich ist.
Diese Anforderungen werden inzwischen
von mehreren kommerziellen Systemen
verschiedener Firmen erfüllt. Als erste
brachte die Firma AnagnosTec, ein Spin-
Off-Unternehmen der TU Berlin, im Jahre
2000 ihre Auswertungssoftware und Datenbank
SARAMIS TM (Spectral Archiving
and Microbial Identification System) auf
den Markt. Sie wurde bisher mit den
AXIMA-Massenspektrometern der Firma
Shimadzu als AXIMA@SARAMIS TM -System
vertrieben, zukünftig wird die Firma
bioMérieux dieses System als Vitek MS TM
anbieten. 2004 folgte die Firma Bruker Dal­
1tonics mit dem MALDI BioTyper TM -System,
das mit verschiedenen Bruker-Massenspektrometern
genutzt werden kann.
Obwohl anfänglich durchaus mit Skepsis
aufgenommen, so haben sich beide Systeme
inzwischen im Routineeinsatz bewährt
und werden in vielen Laboratorien
zur Erregeridentifizierung eingesetzt.
Einer der großen Vorteile ist die geringe
Menge an Zellmaterial, die zur Messung
benötigt wird. Schon eine einzeln liegende,
stecknadelkopfgroße Kolonie auf
einem Nährboden liefert genügend Zellmaterial
zur Analyse. Dadurch ist es möglich,
eine Identifizierung mittels MALDI-
TOF MS bereits von der Primärplatte des
Kulturansatzes durchzuführen, auch wenn
diese eine Mischkultur mehrerer Keime
enthält. Bei schnell wachsenden Bakterien
kann daher bereits weniger als 24 Stunden
nach dem Probeneingang im Labor eine
Identifizierung der Erreger erfolgen.
Ein weiterer Vorteil ist die Geschwindigkeit
der Messung selbst. Die Analyse einer
Einzelprobe dauert weniger als eine Minute,
abhängig davon, wie schnell die nötige
Anzahl Mess-Spektren mit den vorgegebenen
Qualitätskriterien aufgenommen
wird. Inklusive der Probenvorbereitung benötigt
die Identifizierung eines Isolats somit
nur wenige Minuten, was die Diagnosezeiten
im Labor erheblich verkürzt.
Abbildung 3 zeigt den Workflow bei der
Diagnostik mittels MALDI-TOF MS. Das
Zellmaterial wird in der Regel mit einer sterilen
Pipettenspitze von einer Kolonie auf
der Agarplatte entnommen und ohne weitere
Vorbehandlung auf einen Spot auf dem
Probenträger aufgebracht. Auch Extrakte
Abb. 3: Workflow der Routinediagnostik mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie.
von Pilzen oder schwer aufschließbaren
Bakterienzellen können innerhalb weniger
Minuten vorbereitet und auf das Target pipettiert
werden. Auf dem Target werden die
Zellen mit einer kleinen Menge (0,5–1 µl)
der Matrixlösung gemischt, wodurch sie
abgetötet und aufgebrochen werden, so
dass die Kokristallisation von Matrix und
Zellproteinen erfolgen kann. Diese Probenvorbereitung
kann an der Laborbank erfolgen
und ist damit bereits abgeschlossen.
Das Target wird in die Vakuum kammer des
Massenspektro meters eingeschleust und
dort gemessen, wobei ein Referenzstamm
mit bekanntem Massenspektrum zur Kalibrierung
des Systems und zur Qualitätskontrolle
dient. Die erhaltenen Massenspektren
der untersuchten Proben werden
von der Analyse software mit der Referenzdatenbank
abgeglichen und die Iden tifizierungs
ergebnisse ausgegeben.
Die beiden oben beschriebenen Software-Systeme
SARAMIS bzw. MALDI-
BioTyper erlauben die gleichzeitige Vorbereitung
und automatische Messung
größerer Probenmengen. Über entsprechende
Client-Server-Lösungen können
die Proben in großen Laboratorien an
mehreren Arbeitsplätzen dezentral präpariert
und die entsprechenden Probenlisten
zur Abarbeitung in das Massenspektrometer
geladen werden. So ist
gewährleistet, dass die Probendaten zu
jedem Messpunkt korrekt zugeordnet
werden. Bei den AXIMA-Massenspektrometern
der Firma Shimadzu wird der
Workflow im Labor zudem dadurch begünstigt,
dass bis zu vier Targets mit jeweils
48 Probenspots gleichzeitig präpa­
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Tabelle 1
Vergleichsstudien unseres MALDI-TOF MS Systems mit konventionellen biochemischen
Identifizierungssystemen
Studie 1: Enterobacteriaceae
(816 Stämme aus 41 Spezies)
Studie 2: Weitere Bakteriengruppen
(240 Stämme aus 31 Spezies)
worden waren. Um ein möglichst breites
Spektrum auch selten auftretender Spezies
erfassen zu können und eine zu große Redundanz
häufig auftretender Arten zu vermeiden,
wurde ein Schema zur Auswahl der
Stämme erarbeitet. Übereinstimmende Ergebnisse
beider Identifizierungssysteme
wurden bei 686 Stämmen (84,1 %) erzielt,
während die Ergebnisse bei 46 Stämmen
(5,6 %) differierten. Wiederholungsmessungen
und Sequenzierungen zeigten, dass die
biochemischen Methoden in 45 Fällen
(5,5 %) falsche Identifizierungen geliefert
hatten, während das MALDI-TOF-System
nur in einem einzigen Fall (0,12 %) ein falsches
Ergebnis brachte. Die Fehlerrate dieses
neuen Systems liegt also deutlich niedriger
als die der konventionellen Systeme.
Demgegenüber steht, dass wir mit dem
MALDI-TOF-System nur bei 732 Stämmen
ein Identifi zierungsergebnis erhielten, was
einer Identifizierungsrate von 89,7 % entspricht.
Hier zeigt sich ein genereller Unterschied
des MALDI-TOF-Systems im Vergleich
zu biochemischen Methoden.
Während letztere im Falle gemischter Kultu­
Übereinstimmende
ID beider
Systeme
Inkorrekte ID
der biochem.
Systeme
84,1 % 5,5 % 0,1 %
Inkorrekte
ID des MALDI-
Systems
89,2 % 9,6 % 0,0 % 0,0 %
Keine ID
der biochem.
Systeme
Entfällt
bei Studie 1
Keine ID
des MALDI-
Systems
10,3 % –
Entfällt
bei Studie 2
ID nicht
eindeutig
klärbar
1,2 %
riert und gemeinsam in das Gerät geladen
werden können, wo sie nacheinander gemessen
werden.
Die Analysesoftware der MALDI-
TOF MS Systeme gibt die Identifizierungsergebnisse
wie bei den konventionellen
biochemischen Systemen mit einem Konfidenzwert
aus, der die Qualität der Identifizierung
bewertet. Gemäß vom Anwender
festgelegter Kriterien wird entschieden,
welche Ergebnisse direkt an das Laborinformationssystem
(LIS) übermittelt werden
können und welche zunächst validiert
werden müssen. Über das LIS können die
MALDI-TOF-Ergebnisse auch an automatisierte
Systeme zur Resistenztestung weitergegeben
werden. Dort wird die Spezies-
ID benötigt, um über das jeweilige
Expertensystem eine Interpretation der
Resistenzbestimmung vornehmen zu können.
Um diese Anbindung zu erleichtern,
entwickeln verschiedene Hersteller integrative
Plattformen, bei denen die Ergebnisse
von MALDI-TOF MS und Resistenzbestimmung
direkt in einer
Software-Plattform zusammengeführt
werden, dort validiert werden können und
schließlich an das LIS übergeben werden.
Validierung und Akkreditierung:
Implementierung eines MALDI-
TOF MS Systems im Routinelabor
Neben Schnelligkeit und einfachem Handling
sind Verlässlichkeit, Robustheit und
Reproduzierbarkeit einer Identifizierungsmethode
entscheidende Voraussetzungen
für ihren Einsatz im Routinelabor. Viele
Studien bescheinigen den MALDI-TOF MS
Systemen inzwischen im Vergleich mit
konventionellen biochemischen Systemen
eine größere Genauigkeit bei ähnlich
hohen Identifizierungsraten.
In unserem medizinisch-mikrobiologischen
Routinelabor haben wir uns relativ
früh entschlossen, ein MALDI-TOF MS basiertes
Identifizierungssystem im Hinblick
auf Praxistauglichkeit, Robustheit und
Leistungsfähigkeit zu testen. Wichtig war
uns dabei nicht nur eine sinnvolle Integration
in den Workflow unseres Labors, um
eine zeit- und kostensparende Diagnostik
anbieten zu können, sondern auch die Akkreditierbarkeit
des Systems durch die
1DACH (Deutsche Akkreditierungsstelle
Chemie GmbH). Unsere Wahl fiel auf das
AXIMA@SARAMIS System der Anbieter
Shimadzu und AnagnosTec, so dass im
Herbst 2007 das erste Massenspektrometer
in unserem Labor aufgestellt werden
konnte. In einer anfänglichen Familiarisierungsphase
wurden Probenvorbereitung
und Umgang mit Gerät und Software erlernt.
Die Einarbeitungszeit neuer Mitarbeiter
in die Routinehandhabung ist relativ
kurz: Innerhalb von einer bis zwei Wochen
kann die Erstellung reproduzierbarer guter
Probenspots sowie die Bedienung von Gerät
und Software erlernt werden.
In einer längeren Validierungsphase
wurde das System dann in unserem Labor
evaluiert und auf die geplante Akkreditierung
vorbereitet. In Zusammenarbeit mit
der Firma AnagnosTec wurden zunächst
die Leistungsparameter festgelegt und die
Robustheit des Systems ermittelt. Dabei
konnte gezeigt werden, dass eine verlässliche
Identifizierung verschiedener Referenz-
und Ringversuchsstämme nahezu
unabhängig von den eingesetzten Nährmedien
und Wachstumsbedingungen erfolgt.
Somit ist es möglich, die zu identifizierenden
Mikroorganismen jeweils unter den für
sie idealen Wachstumsbedingungen anzuzüchten.
Auch die technischen Parameter
wie beispielsweise die aufgetragene Zellzahl,
die Lagerungsdauer der fertig präparierten
Proben und die Zahl der Laserpulse
pro Probe können innerhalb einer relativ
großen Spannbreite variiert werden. Positiv
fiel auf, dass außerhalb der idealen Messparameter
nahezu keine Fehlidentifizierungen,
sondern lediglich Identifizierungen
mit niedrigeren Wahrscheinlichkeitswerten
oder ohne Ergebnis auftraten.
Nach Festlegung der Messparameter
wurden Vergleichsstudien mit unseren etablierten
biochemischen Identifizierungssystemen
durchgeführt, um die diagnostische
Leistung des MALDI-TOF-Systems beurteilen
zu können. Hierzu nutzten wir klinische
Stämme, die in unserer Laborroutine aus
Patientenmaterial isoliert wurden. Tabelle 1
gibt einen Überblick über die Resultate.
In einer ersten Studie testeten wir 816
Isolate aus der Familie der Enterobacteriaceae,
die zunächst mittels konventioneller
biochemischer Methoden (Phoenix TM der
Firma Becton Dickinson bzw. Micronaut TM
der Firma Merlin Dia gnostika) identifiziert
Es konnte gezeigt werden, dass eine verlässliche Identifizierung
verschiedener Referenz- und Ringversuchsstämme
nahezu unabhängig von den eingesetzten Nährmedien und
Wachstumsbedingungen erfolgt.
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ren oder schlechter Probenvorbereitung oft
ein falsches biochemisches Muster und damit
ein falsches Ergebnis liefern, erhält man
für solche Fälle im MALDI-TOF-System in
der Regel keine Identifizierung, wodurch die
Fehlerrate entsprechend niedriger liegt.
In einer zweiten Studie führten wir Vergleichsmessungen
mit einem breiteren
Keimspektrum durch, das u. a. Staphylokokken,
Enterokokken, Nonfermenter,
Haemophili und Neisserien beinhaltete.
Anhand von 240 Stämmen aus 31 verschiedenen
Non-Enterobacteriaceae-Spezies
wurden die Ergebnisse unseres
MALDI-TOF-Systems durch Re-Identifizierung
mittels unserer etablierten biochemischen
Methoden überprüft.
89,2 Prozent der Ergebnisse stimmten
überein. Die Diskrepanzen waren in dieser
Studie auf 9,6 Prozent Falschidentifizierungen
der konventionellen Systeme
zurückzuführen, während das MALDI-
TOF-System keine falschen Ergebnisse
ausgab (1,2 % der Fälle waren auch nach
Sequenzierung nicht eindeutig klärbar).
Da unsere Studien dem MALDI-
TOF MS System eine sehr hohe Genauigkeit
und Reproduzierbarkeit der Identifizierungsergebnisse
bescheinigten,
entschieden wir nach der Validierungsphase,
dieses System als Haupt-Identifizierungssystem
in unsere Laborroutine zu
integrieren. Dort ersetzt es inzwischen die
meisten der konventionellen Identifizierungssysteme
für Bakterien und Pilze. Im
März 2009 erhielt unser AXIMA@SARA­
MIS-System als erstes MALDI-TOFSystem
die Akkreditierung nach DIN EN ISO 15189
durch die DACH GmbH, die uns damit die
hohe Kompetenz und Qualität dieser Analysetechnik
bescheinigte. Inzwischen ist
diese Akkreditierung in vielen weiteren
Laboratorien erfolgt.
In unserem Labor hat die Implementierung
des neuen Systems zu einer deutlichen
Vereinfachung und Straffung der
Arbeitsabläufe geführt, da die Vorbehandlung
und Präparation der Proben sehr
schnell durchführbar und zudem für alle
Keimgruppen gleich ist. Gleichzeitig konnten
wir die Analysezeiten bei der Keimidentifizierung
von 24 Stunden auf wenige
Stunden verkürzen, so dass eine Weitergabe
der Ergebnisse an die Einsender
noch am gleichen Tag erfolgen kann. Mit
der ständigen Erweiterung der Datenbank
sind unsere Identifizierungsraten inzwischen
deutlich über 90 Prozent gestiegen.
Ausblick: Weitere diagnostische
Anwendungen der Identifizierung
mittels MALDI-TOF MS
Neben der Analyse mikrobieller Kulturen
von festen Nährböden ist die direkte Identifizierung
von Keimen aus bewachsenen
Blutkulturen ein weiteres, zunehmend
wichtiges Einsatzgebiet der MALDI-TOF-
Technologie. Hierbei wird Zellmaterial
aus bewachsenen Blutkulturflaschen abzentrifugiert,
gereinigt und zur Analyse
1auf das MALDI-Target aufgetragen. Auch
wenn die Identifizierungsraten naturgemäß
niedriger liegen als bei Proben von
Kulturplatten und zudem durch geringe
Zelldichten oder Mischkulturen limitiert
werden, so ist es doch in ca. 80 Prozent der
Fälle möglich, bereits wenige Stunden
nach der Positivmeldung einer Blutkulturflasche
ein Resultat zu erhalten. Somit
kann das Identifizierungsergebnis bei
Sepsis-Patienten einen Tag früher als bei
konventioneller Anzucht der Bakterien
vorliegen, was eine schnellere und damit
möglicherweise entscheidende Anpassung
der antibiotischen Therapie ermöglicht.
Ähnliche Methoden werden zurzeit
für eine Bakterienidentifizierung direkt
aus Urinproben entwickelt.
In jedem Fall ist allerdings eine grundsätzliche
Limitierung der Methode zu bedenken:
Sie beschränkt sich auf die Speziesbestimmung.
Die Antibiotika-Resistenzbestimmung,
ein unverzichtbarer Bestandteil der
medizinisch-mikrobiologischen Diagnostik,
muss nach wie vor mit konventionellen Verfahren
durchgeführt werden. Hierbei können
Routinelabors jedoch von der oben beschriebenen
Anbindung des MALDI-TOF-Systems
an etablierte automatisierte Systeme zur Resistenztestung
profitieren. Interessant für Laboratorien
mit hohem Probendurchsatz ist
zudem die automatisierte MALDI-Probenvorbereitung,
die im Zuge des Trends zur mikrobiologischen
Laborautomatisierung realisiert
wurde.
Betrachtet man die rasante Entwicklung,
die von Manchen auch als „Revolution
der Keimidentifizierung“ bezeichnet
wird, so ist zu erwarten, dass sich das Einsatzspektrum
für die MALDI-TOF Massenspektrometrie
in der mikrobiologischen
Diagnostik noch deutlich erweitern wird.
Zukünftige Applikationen, die zurzeit bereits
etabliert werden, sind beispielsweise
die Analyse von Mischkulturen, die Identifizierung
von Subspezies, sowie die Typisierung
verschiedener MRSA-Stämme und
anderer Nosokomialkeime zur schnelleren
Analyse von Ausbruchssituationen.
Daneben gibt es zahlreiche weitere, teilweise
noch etwas exotisch anmutende Anwendungsmöglichkeiten:
In mehreren
Studien konnte die Identifizierung eukaryotischer
Einzeller wie Plasmodien, Cryptosporidien
und Giardien mittels MALDI-
TOF MS durchgeführt werden. Auch
Cyanobakterien und einige Algen können
identifiziert werden, ebenso Vielzeller wie
pflanzenschädigende Nematoden, bestimmte
Blattläuse und Bartmücken (Gnitzen).
Schließlich kann die Technik zur Untersuchung
bakterieller Biofilme oder zur
Identifizierung von Zelllinien im Zellkulturlabor
eingesetzt werden.
Fazit
Die Identifizierung von Mikroorganismen
mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
bietet dem medizinisch-mikrobiologischen
Labor eine Methode mit deutlich verkürzter
Analysezeit bei gleichzeitig höherer Genauigkeit
gegenüber den konventionellen
Systemen. Diese Technik hat daher das Potential,
die klassischen biochemischen
Identifizierungsverfahren in weiten Bereichen
abzulösen, wie das in einigen großen
Laboratorien bereits erfolgt ist. •
Literatur bei der Autorin
Korrespondenz:
Dr. Sonja Burak
Medizinische Laboratorien Düsseldorf/
Abteilung Bakteriologie und Hygiene
Nordstr. 44
D-40477 Düsseldorf/Deutschland
E-Mail: dr.burak@labor-duesseldorf.de
Internet: www.labor-duesseldorf.de
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