MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Identifzierung klinisch ...

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mikrobiologie Tabelle 1 Vergleichsstudien unseres MALDI-TOF MS Systems mit konventionellen biochemischen Identifizierungssystemen Studie 1: Enterobacteriaceae (816 Stämme aus 41 Spezies) Studie 2: Weitere Bakteriengruppen (240 Stämme aus 31 Spezies) worden waren. Um ein möglichst breites Spektrum auch selten auftretender Spezies erfassen zu können und eine zu große Redundanz häufig auftretender Arten zu vermeiden, wurde ein Schema zur Auswahl der Stämme erarbeitet. Übereinstimmende Ergebnisse beider Identifizierungssysteme wurden bei 686 Stämmen (84,1 %) erzielt, während die Ergebnisse bei 46 Stämmen (5,6 %) differierten. Wiederholungsmessungen und Sequenzierungen zeigten, dass die biochemischen Methoden in 45 Fällen (5,5 %) falsche Identifizierungen geliefert hatten, während das MALDI-TOF-System nur in einem einzigen Fall (0,12 %) ein falsches Ergebnis brachte. Die Fehlerrate dieses neuen Systems liegt also deutlich niedriger als die der konventionellen Systeme. Demgegenüber steht, dass wir mit dem MALDI-TOF-System nur bei 732 Stämmen ein Identifi zierungsergebnis erhielten, was einer Identifizierungsrate von 89,7 % entspricht. Hier zeigt sich ein genereller Unterschied des MALDI-TOF-Systems im Vergleich zu biochemischen Methoden. Während letztere im Falle gemischter Kultu Übereinstimmende ID beider Systeme Inkorrekte ID der biochem. Systeme 84,1 % 5,5 % 0,1 % Inkorrekte ID des MALDI- Systems 89,2 % 9,6 % 0,0 % 0,0 % Keine ID der biochem. Systeme Entfällt bei Studie 1 Keine ID des MALDI- Systems 10,3 % – Entfällt bei Studie 2 ID nicht eindeutig klärbar 1,2 % riert und gemeinsam in das Gerät geladen werden können, wo sie nacheinander gemessen werden. Die Analysesoftware der MALDI- TOF MS Systeme gibt die Identifizierungsergebnisse wie bei den konventionellen biochemischen Systemen mit einem Konfidenzwert aus, der die Qualität der Identifizierung bewertet. Gemäß vom Anwender festgelegter Kriterien wird entschieden, welche Ergebnisse direkt an das Laborinformationssystem (LIS) übermittelt werden können und welche zunächst validiert werden müssen. Über das LIS können die MALDI-TOF-Ergebnisse auch an automatisierte Systeme zur Resistenztestung weitergegeben werden. Dort wird die Spezies- ID benötigt, um über das jeweilige Expertensystem eine Interpretation der Resistenzbestimmung vornehmen zu können. Um diese Anbindung zu erleichtern, entwickeln verschiedene Hersteller integrative Plattformen, bei denen die Ergebnisse von MALDI-TOF MS und Resistenzbestimmung direkt in einer Software-Plattform zusammengeführt werden, dort validiert werden können und schließlich an das LIS übergeben werden. Validierung und Akkreditierung: Implementierung eines MALDI- TOF MS Systems im Routinelabor Neben Schnelligkeit und einfachem Handling sind Verlässlichkeit, Robustheit und Reproduzierbarkeit einer Identifizierungsmethode entscheidende Voraussetzungen für ihren Einsatz im Routinelabor. Viele Studien bescheinigen den MALDI-TOF MS Systemen inzwischen im Vergleich mit konventionellen biochemischen Systemen eine größere Genauigkeit bei ähnlich hohen Identifizierungsraten. In unserem medizinisch-mikrobiologischen Routinelabor haben wir uns relativ früh entschlossen, ein MALDI-TOF MS basiertes Identifizierungssystem im Hinblick auf Praxistauglichkeit, Robustheit und Leistungsfähigkeit zu testen. Wichtig war uns dabei nicht nur eine sinnvolle Integration in den Workflow unseres Labors, um eine zeit- und kostensparende Diagnostik anbieten zu können, sondern auch die Akkreditierbarkeit des Systems durch die 1DACH (Deutsche Akkreditierungsstelle Chemie GmbH). Unsere Wahl fiel auf das AXIMA@SARAMIS System der Anbieter Shimadzu und AnagnosTec, so dass im Herbst 2007 das erste Massenspektrometer in unserem Labor aufgestellt werden konnte. In einer anfänglichen Familiarisierungsphase wurden Probenvorbereitung und Umgang mit Gerät und Software erlernt. Die Einarbeitungszeit neuer Mitarbeiter in die Routinehandhabung ist relativ kurz: Innerhalb von einer bis zwei Wochen kann die Erstellung reproduzierbarer guter Probenspots sowie die Bedienung von Gerät und Software erlernt werden. In einer längeren Validierungsphase wurde das System dann in unserem Labor evaluiert und auf die geplante Akkreditierung vorbereitet. In Zusammenarbeit mit der Firma AnagnosTec wurden zunächst die Leistungsparameter festgelegt und die Robustheit des Systems ermittelt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine verlässliche Identifizierung verschiedener Referenz- und Ringversuchsstämme nahezu unabhängig von den eingesetzten Nährmedien und Wachstumsbedingungen erfolgt. Somit ist es möglich, die zu identifizierenden Mikroorganismen jeweils unter den für sie idealen Wachstumsbedingungen anzuzüchten. Auch die technischen Parameter wie beispielsweise die aufgetragene Zellzahl, die Lagerungsdauer der fertig präparierten Proben und die Zahl der Laserpulse pro Probe können innerhalb einer relativ großen Spannbreite variiert werden. Positiv fiel auf, dass außerhalb der idealen Messparameter nahezu keine Fehlidentifizierungen, sondern lediglich Identifizierungen mit niedrigeren Wahrscheinlichkeitswerten oder ohne Ergebnis auftraten. Nach Festlegung der Messparameter wurden Vergleichsstudien mit unseren etablierten biochemischen Identifizierungssystemen durchgeführt, um die diagnostische Leistung des MALDI-TOF-Systems beurteilen zu können. Hierzu nutzten wir klinische Stämme, die in unserer Laborroutine aus Patientenmaterial isoliert wurden. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Resultate. In einer ersten Studie testeten wir 816 Isolate aus der Familie der Enterobacteriaceae, die zunächst mittels konventioneller biochemischer Methoden (Phoenix TM der Firma Becton Dickinson bzw. Micronaut TM der Firma Merlin Dia gnostika) identifiziert Es konnte gezeigt werden, dass eine verlässliche Identifizierung verschiedener Referenz- und Ringversuchsstämme nahezu unabhängig von den eingesetzten Nährmedien und Wachstumsbedingungen erfolgt. wiener klinisches magazin © Springer-Verlag 6/2010 25
mikrobiologie ren oder schlechter Probenvorbereitung oft ein falsches biochemisches Muster und damit ein falsches Ergebnis liefern, erhält man für solche Fälle im MALDI-TOF-System in der Regel keine Identifizierung, wodurch die Fehlerrate entsprechend niedriger liegt. In einer zweiten Studie führten wir Vergleichsmessungen mit einem breiteren Keimspektrum durch, das u. a. Staphylokokken, Enterokokken, Nonfermenter, Haemophili und Neisserien beinhaltete. Anhand von 240 Stämmen aus 31 verschiedenen Non-Enterobacteriaceae-Spezies wurden die Ergebnisse unseres MALDI-TOF-Systems durch Re-Identifizierung mittels unserer etablierten biochemischen Methoden überprüft. 89,2 Prozent der Ergebnisse stimmten überein. Die Diskrepanzen waren in dieser Studie auf 9,6 Prozent Falschidentifizierungen der konventionellen Systeme zurückzuführen, während das MALDI- TOF-System keine falschen Ergebnisse ausgab (1,2 % der Fälle waren auch nach Sequenzierung nicht eindeutig klärbar). Da unsere Studien dem MALDI- TOF MS System eine sehr hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Identifizierungsergebnisse bescheinigten, entschieden wir nach der Validierungsphase, dieses System als Haupt-Identifizierungssystem in unsere Laborroutine zu integrieren. Dort ersetzt es inzwischen die meisten der konventionellen Identifizierungssysteme für Bakterien und Pilze. Im März 2009 erhielt unser AXIMA@SARA MIS-System als erstes MALDI-TOFSystem die Akkreditierung nach DIN EN ISO 15189 durch die DACH GmbH, die uns damit die hohe Kompetenz und Qualität dieser Analysetechnik bescheinigte. Inzwischen ist diese Akkreditierung in vielen weiteren Laboratorien erfolgt. In unserem Labor hat die Implementierung des neuen Systems zu einer deutlichen Vereinfachung und Straffung der Arbeitsabläufe geführt, da die Vorbehandlung und Präparation der Proben sehr schnell durchführbar und zudem für alle Keimgruppen gleich ist. Gleichzeitig konnten wir die Analysezeiten bei der Keimidentifizierung von 24 Stunden auf wenige Stunden verkürzen, so dass eine Weitergabe der Ergebnisse an die Einsender noch am gleichen Tag erfolgen kann. Mit der ständigen Erweiterung der Datenbank sind unsere Identifizierungsraten inzwischen deutlich über 90 Prozent gestiegen. Ausblick: Weitere diagnostische Anwendungen der Identifizierung mittels MALDI-TOF MS Neben der Analyse mikrobieller Kulturen von festen Nährböden ist die direkte Identifizierung von Keimen aus bewachsenen Blutkulturen ein weiteres, zunehmend wichtiges Einsatzgebiet der MALDI-TOF- Technologie. Hierbei wird Zellmaterial aus bewachsenen Blutkulturflaschen abzentrifugiert, gereinigt und zur Analyse 1auf das MALDI-Target aufgetragen. Auch wenn die Identifizierungsraten naturgemäß niedriger liegen als bei Proben von Kulturplatten und zudem durch geringe Zelldichten oder Mischkulturen limitiert werden, so ist es doch in ca. 80 Prozent der Fälle möglich, bereits wenige Stunden nach der Positivmeldung einer Blutkulturflasche ein Resultat zu erhalten. Somit kann das Identifizierungsergebnis bei Sepsis-Patienten einen Tag früher als bei konventioneller Anzucht der Bakterien vorliegen, was eine schnellere und damit möglicherweise entscheidende Anpassung der antibiotischen Therapie ermöglicht. Ähnliche Methoden werden zurzeit für eine Bakterienidentifizierung direkt aus Urinproben entwickelt. In jedem Fall ist allerdings eine grundsätzliche Limitierung der Methode zu bedenken: Sie beschränkt sich auf die Speziesbestimmung. Die Antibiotika-Resistenzbestimmung, ein unverzichtbarer Bestandteil der medizinisch-mikrobiologischen Diagnostik, muss nach wie vor mit konventionellen Verfahren durchgeführt werden. Hierbei können Routinelabors jedoch von der oben beschriebenen Anbindung des MALDI-TOF-Systems an etablierte automatisierte Systeme zur Resistenztestung profitieren. Interessant für Laboratorien mit hohem Probendurchsatz ist zudem die automatisierte MALDI-Probenvorbereitung, die im Zuge des Trends zur mikrobiologischen Laborautomatisierung realisiert wurde. Betrachtet man die rasante Entwicklung, die von Manchen auch als „Revolution der Keimidentifizierung“ bezeichnet wird, so ist zu erwarten, dass sich das Einsatzspektrum für die MALDI-TOF Massenspektrometrie in der mikrobiologischen Diagnostik noch deutlich erweitern wird. Zukünftige Applikationen, die zurzeit bereits etabliert werden, sind beispielsweise die Analyse von Mischkulturen, die Identifizierung von Subspezies, sowie die Typisierung verschiedener MRSA-Stämme und anderer Nosokomialkeime zur schnelleren Analyse von Ausbruchssituationen. Daneben gibt es zahlreiche weitere, teilweise noch etwas exotisch anmutende Anwendungsmöglichkeiten: In mehreren Studien konnte die Identifizierung eukaryotischer Einzeller wie Plasmodien, Cryptosporidien und Giardien mittels MALDI- TOF MS durchgeführt werden. Auch Cyanobakterien und einige Algen können identifiziert werden, ebenso Vielzeller wie pflanzenschädigende Nematoden, bestimmte Blattläuse und Bartmücken (Gnitzen). Schließlich kann die Technik zur Untersuchung bakterieller Biofilme oder zur Identifizierung von Zelllinien im Zellkulturlabor eingesetzt werden. Fazit Die Identifizierung von Mikroorganismen mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie bietet dem medizinisch-mikrobiologischen Labor eine Methode mit deutlich verkürzter Analysezeit bei gleichzeitig höherer Genauigkeit gegenüber den konventionellen Systemen. Diese Technik hat daher das Potential, die klassischen biochemischen Identifizierungsverfahren in weiten Bereichen abzulösen, wie das in einigen großen Laboratorien bereits erfolgt ist. • Literatur bei der Autorin Korrespondenz: Dr. Sonja Burak Medizinische Laboratorien Düsseldorf/ Abteilung Bakteriologie und Hygiene Nordstr. 44 D-40477 Düsseldorf/Deutschland E-Mail: dr.burak@labor-duesseldorf.de Internet: www.labor-duesseldorf.de SpringerMedizin.at Weitere Informationen unter: www.SpringerMedizin.at 26 6/2010 © Springer-Verlag wiener klinisches magazin
Seite 1 und 2: mikrobiologie S. Burak, A. Gehrt 1
Seite 3: mikrobiologie phyten und Schimmelpi

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