Elektrophorese - Unics.uni-hannover.de - Leibniz Universität ...

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Elektrophorese

Teil 1

Skript zur Vorlesung „Grundlagen der Analytik I“

im MSc-Studiengang Analytik

Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 11.1.2007


Literatur

„Analytical Isotachophoresis“

P. Bocek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, VCH, Weinheim, 1988

„Gelelektrophorese“

R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin

„Isoelektrische Fokussierung“

R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin

„Capillary Electrophoresis: Principle and Practice“

R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn, Springer Laboratory, Berlin, 1993

„Handbook of Capillary Electrophoresis“

Ed. J. P. Landers, CRC Press, Boca Raton, 1997

“Advances in Electrophoresis”, Serie, Band 1, 2 und 6

Eds. A. Chrambach, M. J. Dunn, B. J. Radola, VCH, Weinheim, 1987-1993


Gliederung

Grundlagen

geschichtlicher Überblick

wichtige Größen

Trennprinzipien

Zonenelektrophorese (ZE)

Isotachophorese (ITP)

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

technische Realisierungen

Kapillarelektrophorese

Aufbau, apparative Komponenten

Puffersysteme und Additive

Mizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)

Gelelektrophorese


Historische Entwicklung

1791 Faraday Elektrolysegesetze

1853 Hittorf Überführungszahlen

1877 Helmholtz Elektroosmose

1887 Arrhenius Dissoziationstheorie

1897 Kohlrausch Regulierungsfunktion

1930 Tiselius Versuche zur Elektrophorese der wandernden

Grenzflächen / erste reproduzierbar arbeitende

Apparatur durch Kühleinheit / 1948 Nobelpreis

1960 Hjerten Elektrophorese der wandernden Grenzflächen

erstmals in Kapillaren (i.D. 0,3 cm)

1967 Hjerten Theorie der trägerfreien Zonenelektrophorese

1968 Everaerts erste kommerzielle Isotachophoreseapparatur

1979 Mikkers Kapillarzonenelektrophorese

1987 Fa. Beckman erste kommerzielle Kapillarzonenelektrophoreseapparatur


Elektrophoretische Trennverfahren

Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld

Mobilität eines Teilchens hängt von Ladung und Radius ab

Analyten mit unterschiedlichen Mobilitäten im Feld wandern

unterschiedlich schnell und werden dadurch getrennt

Trenneffekte sind vom Medium (Trennpuffer) abhängig

Möglichkeit der Analyse neutraler Verbindungen durch WW

mit geladenen Pufferzusätzen


Einteilung elektrophoretischer Verfahren

Einteilungskriterium

Getrennte Stoffmenge

Trennprozess

Stabilisierungsmethoden

Trennprinzip

Potentialgradient

Trenntechnik

analytisch, mikropreparativ, preparativ

kontinuierlich, Stufenweise

tragerfrei, mit Trägermedium, Kapillare,

Gele

nur Migration

Migration und WW mit Trägermedium

Migration, WW mit Trägermedium und

Diffusion

Migration und Verteilung

Hochspannung, Niederspannung

Zonen

wandernde Grenzflächen

Isotachophorese

Fokussierung


Einteilung elektrophoretischer Verfahren

Zonenelektrophorese

Methode der wandernden Grenzflächen / Isotachophorese

Isoelektrische Fokussierung

Kombinationen mit weiteren Trenneffekten

Mizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie

Gelelektrophorese


Trennprinzipien

Zonenelektrophorese

(C)ZE

Isoelektrische

Fokussierung

IEF

Puffer homogene ZSS Gemisch von

Ampholyten

E / pH homogen Kontinuierlicher

Gradient

Isotachophorese

ITP

Zwei Elektrolyte

Stufenförmiger

Gradient

Probe

Keine Begrenzung

Für Molekulargewicht

Kationen, Anionen,

Neutralverbindungen

Ampholyte, pI

µ T

< µ S

< µ L

nur eine Ionenart

Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen:

Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC),

Kapillargelelektrophorese (CGE)


Zonenelektrophorese

Trägermaterial → Papier oder Dünnschicht

Celluloseacetat (Filterpapier)

Nitrocellulose

Ionenaustauscher

Aluminiumoxid, Titaniumoxid

Trägerfrei → Kapillare

eindimensional / zweidimensional

vom Trägermaterial verursachte Effekte

Joul´sche Wärme

Elektroosmose

Adsorption

Diffusion


Trägermaterialien für die Zonenelektrophorese

Papier

Filme

Gele

Papier- und Dünnschichtelektrophorese

heute kaum noch gebräuchlich (bessere Trennung und höhere Beladbarkeit

von Agarose- und PAA-Gelen)

Silikagel-Platten in Puffertanks

Celluloseacetatmembran (große Poren, daher schlechte Auftrennung für

Proteine) – Trenneffekt basiert vollständig auf Ladungsdichte; aber

einfaches Handling

Ideal – einstellbare, regelmäßige Porengröße, chemische Inertheit, keine

Elektroosmose

Stärke (seit 1955) – 5-10 mm dick, geringe Reproduzierbarkeit,

unpraktisches Handling der Gele

Agarose – charakterisiert durch Schmelzpunkt und Ausmaß der

auftretenden Elektroosmose, Porengröße abhängig von Konzentration (150-

500 nm)

Polyacrylamid – seit 1959, chemisch inert, mechanisch stabil, wenig

Elektroosmose

Kontrolle der Porengröße bei Synthese möglich


Zonenelektrophorese

Trennprinzip für Trägersysteme (schematisch)

v

i

=

u

i

⋅E


Zonenelektrophorese

Trennprinzip für trägerfreie Systeme (Kapillare)

v

i

=

u

i

⋅E


Isotachophorese

zwei Puffer - Leitelektrolyt (L) / Terminator (T)

µ L,eff

> µ i,eff

> µ T,eff

L

Gesetz von Kohlrausch

c x

= c L


µ

x

µ

x

− µ

G


µ

L

− µ

µ

G

X … Probeion, G … Gegenion, L … Leition

je geringer die Mobilität von x, desto geringer ist auch seine

Konzentration in der entsprechenden Zone

die Konzentration des Probeions in seiner Zone richtet sich nach der

Konzentration des Leitions

das Gegenion G ist in jeder Zone in entsprechender Menge vorhanden

⎛ µ

G,L

⎞ ⎛ µ

G, X

⎞ ⎛ µ

G,T


c

G ,L

⋅⎜1−

⎟ = c

G, X

⋅⎜1−

⎟ = c ⎜

G,T

⋅ 1−

⎟ =

⎝ µ

L,L ⎠ ⎝ µ

X, X ⎠ ⎝ µ

T,T ⎠

konst.


Isotachophorese

Auswahl der Elektrolytlösungen


Löslichkeit und Stabilität

1-10 mM (wasserlöslich), alternativ Zugabe organischer LM

Auswahl Gegenion – Redoxprozesse, Fällung vermeiden


Ionisierung und Pufferung

Dissoziationsgrad ≥ 10 % notwendig für ausreichenden µ eff

-Effekt

sinnvolle Grenze pH LE

≈ pK A

±1 und pK B

±1


Isotachophorese

v

i

=

u

i

⋅E


Isotachophorese

Trennung der Lanthaniden

Elektrolytsystem:

Leitelektrolyt: 2.7 mM KOH + 1.5 mM α-Hydroxyisobuttersäure + Essigsäure (pH 4.92) +

0.0025 % PVA

Terminator: β-Alanin

Detektion: Potentialgradient

Probe: 5 nmol je Element

L

4

3

1 2

5

6

7

8

9

10

Methode des komplexierenden

Gegenions

L K +

11

12

13

14

15

E

T

t /min

1 Na +

2 La 3+

3 Ce 3+

4 Pr 3+

5 Nd 3+

6 Sm 3+

7 Eu 3+

8 Gd 3+

9 Tb 3+

10 Dy 3+

11 Ho 3+

12 Er 3+

13 Tm 3+

14 Yb 3+

15 Lu 3+

T β-Alanin


Elektrolytsysteme

Kontinuierlich

Diskontinuierlich

E 2

T

E 1

L

v = µ . E


Isoelektrische Fokussierung

Ampholyte mit Isoelektrischem Punkt

Immobilisiert oder frei

1

pH = ⋅ pK S + pK B

2

( )

Trägermaterial : Polyacrylamid (PAGE), Sephadex

Kovalente Bindung der Ampholyte an die Gelmatrix

pH bleibt über gesamte Trennung konstant

Gradient vorausberechenbar - damit anpassbar an Analysenproblem

extrem hohe Auflösung erreichbar (bis 0,01 pH/cm)

Trägerfrei :

Dichtegradienten (Sucrose), Freie Lösung


Isoelektrische Fokussierung

bei niedrigem pH

R-COO - + H + → R-COOH

R-NH 2 + H + → R-NH 3

+

bei hohem pH R-COOH → R-COO - + H+

R-NH 3+ → R-NH 2 + H +

pH = pI B

pH = pI A


Isoelektrische Fokussierung

Entwicklung des pH-Gradienten für die IEF


Isoelektrische Fokussierung

Grundstrukturen von Trägerampholyten

Polyamino-Polycarbonsäuren

N N

x

freie Trägerampholyte

R = H

COOH

NR 2

COOH

x = 2 oder 3

Acrylamid-Derivate H 2

C

NH immobilisierte Ampholyte

CH 3 O R

R = R =

N

CH 3

O

SO H

3

COOH

H 5 C 2

N + C 2H 5

C 2 H 5

sauer

basisch


Isoelektrische Fokussierung

Agarose-IEF mit Elektroden- und Probeaufgabe-Streifen

Struktur der Agarose

und des bei der

Polymerisation

gebildeten Gels


Isoelektrische Fokussierung

IEF von Isoformen des

α-Antitrypsin (Protease-Inhibitor)

in immobilisiertem pH-Gradient

pH 4.0 – 5.0

IEF von Kartoffelsaft

unterschiedlicher

Kartoffelarten in einem

Polyacrylamidgel

(angefärbt mit Coomassie

Brilliant Blue)


Kombinierte Prinzipien - 2D

Erste Dimension → IEF mit

immobilisiertem pH-Gradienten

pH 3-12 in 24 cm langem

Gelstreifen

Zweite Dimension →

SDS-PAGE

In 13%igem Gel

Detektion durch

Silberfärbung

Erste Dimension

Zweite Dimension


SDS-PAGE

Sodium docecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach SDS-Zusatz

SDS überdeckt Eigenladung des Proteins

je Gramm Protein binden ca. 1.4 g SDS → Proteine im Gemisch mit

konstanter Ladungsverteilung

Sekundär- und Tertiärstrukturen werden in Vorbehandlung durch Brechen der

Wasserstoffbrücken und Streckung des Moleküls aufgebrochen

Disulfidbrücken werden durch Reduktion gespalten

In anschließender Trennung spielt nur noch Größe eine Rolle


Trennprinzipien

Zonenelektrophorese

(C)ZE

Isoelektrische

Fokussierung

IEF

Puffer homogene ZSS Gemisch von

Ampholyten

E / pH homogen Kontinuierlicher

Gradient

Isotachophorese

ITP

Zwei Elektrolyte

Stufenförmiger

Gradient

Probe

Keine Begrenzung

Für Molekulargewicht

Kationen, Anionen,

Neutralverbindungen

Ampholyte, pI

µ T

< µ S

< µ L

nur eine Ionenart

Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen:

Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC),

Kapillargelelektrophorese (CGE)

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