Isotachophorese

Institut für Chemische Technologien 

und Analytik - © E. Rosenberg 



VO „Analytische Chemie“ 

H. Puxbaum und E. Rosenberg 


und Analytik 

164.053 

2.0 h, WS 

Teil 8 

Elektrophorese 

Prinzip: 

Trennung von elektrisch geladenen Teilchen (Ionen) 

aufgrund von unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten 

im elektrischen Feld. 

Durchführung: 

zahlreiche verschiedene Formen der Realisierung, z.B.: 

� absteigend auf einem Filterpapier oder Gel, oder als 

� Flachbett-Anordnung (Gel oder Papier) 

� oder in einer Kapillare 

8-1 

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� eine der wichtigsten Trennmethoden 

allerdings: keine chromatographische Trennmethode ! 

� Grundlagen seit 1899 bekannt (Versuche von 

Kohlrausch) 

� Separation von Ionen aufgrund ihrer unterschiedlichen 

Beweglichkeit im elektrischen Feld 

� Bedeutung in analytischer Chemie: erst seit 1981 mit 

der Kapillarelektrophorese (CE) 

� CE: hohe Trennleistung unter Einsatz von 

Hochspannung (ca. 30 kV) 


� Prinzip: Probe wird 

� auf Trägermaterial aufgebracht: Papier-, Gelelektrophorese 

� in eine Kapillare injiziert Kapillarelektrophorese (CE) 

� Anlegen einer hohen Spannung (20 bis 50 kV in der CE) 

� Kationen wandern zur Kathode, Anionen zur Anode 

� Je nach ihrer Mobilität bewegen sich Ionen 

unterschiedlich schnell 

� Auftrennung 

� Neutralteilchen nicht aufgetrennt 

� Verwendung von Pufferlösungen 

� konstanter pH-Wert, Elektrolyt 

Schema der Ionenauftrennung: 

8-3 

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Prinzip der Elektrophorese 

Animation zum Prinzip der Elektrophorese 


(Papier-)Elektrophorese-Apparatur zur Trennung von Proteinen 

8-5 

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Detektion: 

meist über UV-Scanner (= Densitometer) 

Apparatur zur Durchführung 

der Flachbett-Elektrophorese. 

Die Trennung erfolgt in einem 

Celluloseacetatstreifen. 

Einsatzbereich: 

vorwiegend in der biochemischen und klinischen 

Analytik 


Querschnitte verschiedener Elektrophorese-Anordnungen: 

(A) gefülltes Rohr, (B) vertikales Bett, (C) untergetauchtes 

horizontales Bett, (D) horizontales Bett mit Pufferbehältern. 

8-7 

Schema einer vertikalen Elektrophorese- 

Anordnung (“sandwich”). Die Seiten und 

der Boden müssen beim Gießen des 

Gels dicht versiegelt werden. 

8-8





Fraktion % (rel.) 

Albumine 60 (55-70) 

α1-Globuline 5 (2-5) 

α2-Globuline 8 (5-10) 

β-Globuline 10 (10-15) 

γ-Globuline 17 (12-20) 


Beispiele elektrophoretischer Bestimmungen: 

Isotachophorese 

Oben: Elektropherogram der Trennung 

von DNA-Fragmenten. 

Links oben: Denistogramme von Serumproteinelektrophoresen 

bei pH 8,6 in 

(a) Phosphatpuffer, 1/15 molar und 

(b) Barbituratpuffer, 0,1 molar, sonst 

identische Trennbedingungen. 

Links: Ergebnisse eines typischen 8-10 

Pherogrammes. 

Prinzip: 

Trennung von elektrisch geladenen Teilchen (Ionen) 

im elektrischen Feld, in diesem Fall aufgrund der 

experimentellen Randbedingungen jedoch mit gleicher 

(= iso) Wanderungsgeschwindigkeiten (→ tacho, 

phoresis) 

8-11





Prinzip der Isotachophorese 

Animation zum Prinzip der Isotachophorese 


8-12 

Experimenteller Aufbau: 

• Durchführung in Kapillarsäule (0,5-1 mm ID, bis 1 m Länge) 

• Säule zu Beginn mit zwei Elektrolyten gefüllt: 

a) vorne mit dem Elektrolyten mit der größeren Ionenbeweglichkeit 

(leading electrolyte, z.B. OH- ) 

b) hinten mit dem Elektrolyten mit der geringeren Ionenbeweglichkeit 

(terminating electrolyte, z.B. Tartrat- ) 

• Grenzschicht befindet sich an der Injektorposition 

• Probelösung (typisch 0,1-50 µl) wird an der Phasengrenzfläche 

aufgegeben 

• Anlegen der Spannung, dadurch: 

• Anordnung der Ionen gemäß ihrer Ionenbeweglichkeit in scharfe 

Zonen zwischen L- und T- • Wanderung aller Ionen durch die Trennstrecke mit gleicher 

Wanderungsgeschwindigkeit 

• Detektion z.B. über Potentialgradienten-Detektor 

8-13






Schematische Darstellung einer isotachophoretischen Trennung mit Detektion durch 

Potentialgradienten-Detektor und qualitativer und quantitativer Auswertung (1) 8-14 


Schematische Darstellung einer isotachophoretischen Trennung mit Detektion durch 

Potentialgradienten-Detektor und qualitativer und quantitativer Auswertung (2) 

8-15





Detektion: 

a) Potentialgradienten-Detektor: 

Anbringen zweier Pt-Elektroden 

nahe des Endes der 

Trennsäule. Übergang 

zwischen zwei Elektrolyten 

wird jeweils durch 

Potentialsprung angezeigt. 


b) UV-Absorptions-Detektor: 

Alternative für UV-absorbierende 

Substanzen 


Charakteristika: 

• Probenvolumina: 0,1-100 µl, Lösungen von Ionen 

bei pH 2-12 

• Erfassungsgrenze: ~10 -9 ...10 -10 mol/l 

• Reproduzierbarkeit: ~2% RSD 

8-16 

Anwendungen: 

für organische und anorganische Ionen in der 

• Biochemie (Proteine, Aminosäuren, Nucleotide, ...) 

• Pharmaindustrie (Antibiotika, Amine...) 

• Lebensmittelindustrie (Zitronensäure, Milchsäure, ...) 

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Tachogramm der isotachophoretischen Auftrennung einer Urinprobe eines Patienten mit 

Vitamin C-reicher Diät, detektiert mit einem Potentialgradienten-Detektor (oben) und einem 

UV-Detektor (unten). 

Vergleich wichtiger Trennverfahren (1) 

Analysierbare 

Proben 

Gaschromatographie Hochleistungs- 

Flüssigkeitschroma 

bis ca. 450°C 

unzersetzt oder nach 

Derivatisierung 

verdampfbare 

Substanzen 

-tographie 

in der mobilen Phase 

lösliche Substanzen 

8-18 

Dünnschicht- 

chromatographie 

in der mobilen Phase 


Molekulargewicht 

der Proben 

bis ca. 1000 ~100 bis ~10.000 ~100 bis ~10.000 

Empfindlichkeit 10 -12 - 10 -15 mol 10 -11 - 10 -14 mol bis 10 -12 mol 

Reproduzierbarkeit ~1% ~1% ~10% 

Typische 

Analysendauer 

10-45 min 10-45 min 5-15 min 

Probenmenge 0,1-1 µl (Kapillar-GC) 0,1-100 µl 0,1-10 µl 

Stationäre Phase Kapillar-GC: Quarz- Silika-Partikel,





Vergleich wichtiger Trennverfahren (2) 

Analysierbare 

Proben 

Gelchromatographie Ionenchromatographie Elektrophorese 

Hochmolekulare, 


Anorganische und Anorganische und 

(kleine) organische Ionen organische Ionen 

ohne Größenlimit 

(Proteine !) 

bis einige 1.000 ~50 bis ~50.000 

Molekulargewicht 10.000 bis ca. 

der Proben 10.000.000 

Empfindlichkeit bis ca. 10 -10 mol 10 -7 - 10 -10 mol bis 10 -12 mol 

Reproduzierbarkeit ~3% ~3-5% ~5% 

Typische 

Analysendauer 

1-10 h 5-30 min 5-15 min 

Probenmenge ~250 µl 0,1-100 µl (25 Punkten positiv) 

� Fragenkatalog liegt in der FS Chemie auf 

8-20 

8-21

Isotachophorese

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