GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN

GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
1. KURZBESCHREIBUNG DER ÜBUNG
1.1 ZIEL DER ÜBUNG
Bestimmung des Molekulargewichts eines Proteins unter Verwendung einer Kalibrierfunktion,
welche mittels Markerproteinen erstellt wird.
1.2 EINGESETZTE ANALYSENTECHNIK
SDS-Gelelektrophorese (SDS = sodium dodecylsulfate) mit selbst angefertigten, isokratischen
Polyacrylamid-Gelen (PAG). (Entwicklung auf einer Hoefer SE 250 Mini-Vertikal-
Gelelektrophoreseeinheit zur raschen Elektrophorese von Protein- oder Nukleinsäure-Proben
geringen Volumens)
1.3 ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN IN DER PRAXIS
Die eingesetzte Technik (diskontinuierliches System unter denaturierenden Bedingungen) ist
ein Standardverfahren zur Auftrennung von Proteinen, zur Charakterisierung der Reinheit von
Proteinen und zur näherungsweisen Bestimmung ihrer Molekulargewichte.
2. PRINZIP DER POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE VON
PROTEIN-SDS KOMPLEXEN (SDS-PAGE)
In freier Lösung wandern ionische Verbindungen elektrophoretisch (im elektrischen Feld)
entsprechend ihrer Ionenbeweglichkeit, welche von ihrer Größe, Ladung und Form abhängt.
Biopolymere wie Proteine werden demnach in freier Lösung ebenfalls nach Größe und
Ladung getrennt, wobei letztere vom pH des Trennpuffers (relativ zum pI des Proteins)
bestimmt wird. Um Proteine nach ihrer Größe zu trennen, verwendet man eine Matrix (mit
einer permanenten oder temporären Porenstruktur), welche die Analyte entsprechend ihrer
Größe retardieren soll. Als solche wird in der Gelelektrophorese, wie der Name sagt, ein Gel,
z.B. aus Polyacrylamid verwendet 1 . Die Verwendung einer solchen „siebenden“ Matrix reicht
aber offensichtlich nicht aus, um die Analyte allein entsprechend ihrer Größe zu retardieren,
da große Moleküle mit hoher Ladungszahl schneller wandern können als kleine Moleküle mit
geringer Ladung. Um eine Trennung ausschließlich entsprechend der Größe zu erhalten,
müssen die Ladungsdifferenzen der nativen Proteine eliminiert werden, besser gesagt ihre
unterschiedlichen Verhältnisse von Ladung zu Größe. Alle Proteine sollten daher dieselbe
Mobilität (in freier Lösung) besitzen.
Dazu lässt man die Proteine mit Na-dodecylsulfat (SDS) reagieren. SDS ist ein
Tensid, und besitzt eine lipophile Alkylgruppe (C12) und einen hydrophilen, anionischen
Sulfatrest. Man belegt nun die Proteinoberfläche mit den lipophilen C12-Ketten (dies
geschieht vorwiegend bei erhöhter Temperatur). Umso größer das Protein ist, desto mehr
SDS-Moleküle binden an seiner Oberfläche. Die ursprüngliche Proteinladung wird dabei
maskiert. Da jedes bindende SDS-Molekül mit seiner Sulfat-Gruppe jeweils eine negative
1
Man beachte, daß dieser Matrix eine Elektrolytlösung beigefügt ist, welche den pH-Wert vorgibt und im wesentlichen für den elektrischen
Stromtransport verantwortlich ist.
1

Ladung beisteuert, sind die entstehenden Protein-SDS-Komplexe umso stärker negativ
geladen, je mehr SDS am Protein angelagert ist. Da die Anzahl der angelagerten SDS-Ketten
hauptsächlich (wenn auch nicht ausschließlich) von der Proteingröße abhängt, entstehen
Komplexe mit demselben Ladung-zu-Masse-Verhältnis, d.h. mit derselben Mobilität (in freier
Lösung). Ohne Siebmedium würden die Komplexe tatsächlich mit derselben Geschwindigkeit
im elektrischen Feld wandern. In der Siebmatrix hingegen wandern sie entsprechend ihrer
Größe, und nicht beeinflusst durch die native Ladung der Proteine. Darauf beruht das Prinzip
der größenspezifischen Trennung in der SDS-PAGE.
Experimentell wurde gefunden, dass ein weitgehend linearer Zusammenhang besteht
zwischen dem Logarithmus der molekularen Masse (log Mw) und der relativen
Wanderungsstrecke (Rf) der Separanden 2 . Dieser Zusammenhang lässt sich als einfache
Kalibrierfunktion nutzen. Die Ermittlung der Molekülmasse eines Proteins mittels SDS­
PAGE erfolgt also durch Bestimmung der Wanderungsstrecke des betreffenden Proteins in
einem Gel und dem Vergleich dieser Strecke mit den Wanderungsstrecken von
Referenzproteinen bekannter Molekülmasse.
3. ARBEITSANLEITUNG
3.1 GIEßEN VON ZWEI ISOKRATISCHEN GELEN IN EINER GELGIEßKAMMER
Plastikblock
Anpressschiene
Abb 1: Gelgießkammer
Gummidichtung
Gelsandwichhalterung
Castingbehälter
Feststell-
Schrauben
2
Der Rf-Wert ist wie in der Dünnschichtchromatographie definiert: als Wanderungsstrecke des Analyten relativ zur Wanderungsstrecke
einer nicht-retardierten Substanz (Frontmarker-Farbstoff).
2

1. Zerlegen Sie die Gelgießkammer und reinigen Sie diese gründlich mit Leitungswasser.
Entfernen Sie dafür zunächst die schwarzen Feststellschrauben an der Seite des
Castingbehälters und ziehen danach vorsichtig die Gelsandwichhalterungen heraus.
ACHTUNG:
Keine organischen Lösungsmittel, Säuren oder Basen zum Reinigen der
Kammerteile verwenden!
2. Lockern Sie die Schrauben der Anpressschienen an der Gelsandwichhalterung und stellen
Sie diese auf eine waagrechte, ebene Oberfläche. Schieben Sie die Anpressschienen weg
vom Plastikblock.
3. Ein Gelsandwich besteht aus einer Aluminiumoxidplatte, zwei Abstandhaltern und einer
Glasplatte (Abb. 2). Nachdem Sie die Aluminiumplatte auf die Arbeitsoberfläche gelegt
haben, positionieren Sie die Abstandhalter links und rechts an der Platte und passen die
Glasplatten oben darauf an. Die lange flache Seite des T-förmigen Abstandhalters passt
genau zwischen die Glasplatte und die Aluminiumplatte.
Um einen geraden Abschluss an der Unterkante des Gelsandwiches zu erhalten, stellen Sie
diesen vertikal auf die gerade Oberfläche des Arbeitsplatzes.
Kamm
Abstandhalter
Glasplatte
Aluminiumoxidplatte
Abb 2: Gelsandwich mit Kamm
4. Schieben Sie den Gelsandwich nun vorsichtig zwischen dem Plastikblock und der
Anpressschiene in die aufrecht stehende Gelsandwichhalterung. Dabei soll die
Aluminiumoxidplatte zum Plastikblock weisen und der Gelsandwich bündig mit der
Arbeitsoberfläche abschließen.
5. Während Sie den Gelsandwich in der Gelsandwichhalterung festhalten, ziehen Sie die
Anpressschrauben fest.
ACHTUNG:
NICHT ZU FEST, DA SONST DIE ALUMINIUMPLATTEN BRECHEN ! MAXIMAL FINGERFEST
ZUDREHEN !
3

6. Kontrollieren Sie Ihren Aufbau, um Undichtheiten zu vermeiden. Die Platten und die
Abstandhalter müssen gerade abschließen.
7. Setzen Sie nun die Gelsandwichhalterungen der Reihe nach in den Castingbehälter ein.
Die Aluminiumplatte soll dabei hinten sein.
8. Setzen Sie die Feststellschrauben am Castingbehälter so ein, dass das kurze Ende nach
oben weist. Zurren Sie die Gelsandwichhalterungen fest, in dem Sie die Feststellschrauben
180° verdrehen, sodass das kurze Ende nach unten weist.
9. Stellen Sie nun die Lösungen nach dem in Tabelle 1 aufgelisteten Pipettierschema her.
Zuerst ist das Trenngel herzustellen. Die kleinen Volumina sind mit der Hamilton-Spritze
zu dosieren. (Die Mengenangaben sind für 2 Gele!)
ACHTUNG: HANDSCHUHE TRAGEN ! ACRYLAMID IST NEUROTOXISCH !
Schritte Trenngel
(10% T )
Sammelgel
(4% T)
1 Acrylamid-/Bisacrylamidmonomerlösung
(30% T, 2,7% C) 1
6,65 ml 0,67 ml
2 Trenngelpuffer (1,5M Tris-Cl, pH=8,8) 5,00 ml -
3 Sammelgelpuffer (0,5M Tris-Cl, pH=6,8) - 1,25 ml
4 10% SDS (Sodiumdodecylsulfat) 0,20 ml 50 µl
5 deionisiertes Wasser 8,05 ml 3,0 ml
6 Lösung im Ultraschallbad 5 min entgasen 4
7 10%ige Ammoniumpersulfat-Lösung 2
8 TEMED (N,N,N',N'-Tetramethyl-
ethylendiamin) 3
100 µl 25 µl
6,65 µl 2,5 µl
Endvolumen 20 ml 5ml
Lösung im Ultraschallbad 1 min entgasen 4
1 Acrylamid
Tab. 1: Pipettierschema für Sammelgel und Trenngel.
g ( + Bisacrylam id)
g ( Bisacrylam id)
%T = . 100 %C =
. 100
100 ml g ( Acrylamid + Bisacrylam id)
2 Die Ammoniumpersulfat-Lösung dient als Radikalstarter für die radikalische Polymerisation.
Die Lösung muß frisch hergestellt werden: Dazu werden die im Eppendorfgefäß eingewogenen
20 mg in 200 µl Wasser gelöst.
3 TEMED dient als Katalysator.
4
Die Lösungen für das Trenngel und das Sammelgel sind zu entgasen, da Sauerstoff die
Polymerisation stört.
10. Die nach dem Pipettierschema hergestellte Trenngellösung wird mit einer Pasteurpipette
bis zur Markierung auf der Frontplatte (etwa 6-7 cm hoch) in die Sandwiches gefüllt. Die
Lösung wird am besten von einem Eck des Gelsandwiches ausgehend eingefüllt.
4

ACHTUNG:
Keine Luftblasen einschließen! Zügig arbeiten, da die Lösung relativ rasch
polymerisiert!
Beide Sandwiches werden mit je 100 µl wassergesättigtem 1-Butanol überschichtet, damit
sich kein Meniskus bildet (l-Butanol mit Wasser schütteln, nach der Phasentrennung ist
der Überstand wassergesättigt). Die Polymerisation dauert ca. 30 Minuten. Durch leichtes
Neigen der Gelgießkammer kann man feststellen, ob das Gel auspolymerisiert ist. Die
restliche Trenngellösung lässt man im Becherglas auspolymerisieren.
11. Wenn das Trenngel auspolymerisiert ist, wird das Butanol durch Umdrehen der Gelgießkammer
und Spülen mit deionisiertem Wasser entfernt.
Danach wird das Sammelgel nach dem obigen Pipettierschema zubereitet. Die Sammelgellösung
wird mit einer Pasteurpipette in die beiden Sandwiches pipettiert, bis diese vollständig
gefüllt sind. Danach wird sofort ein Kamm in jedes Sandwich eingeführt, wodurch
die Auftragetaschen im Gel geformt werden.
12. Nach ca. 30 Minuten ist die Polymerisation des Sammelgels beendet. Durch vorsichtiges
Herausziehen des Kammes läßt sich feststellen, ob das Gel auspolymerisiert ist. Nun
können die Gelsandwiches aus der Gelgießkammer durch lösen der Feststellschrauben
entfernt werden. Die Sandwiches werden vorsichtig mit deionisiertem Wasser von
Gelresten befreit. Mit einem Glasschreiber werden auf der Glasplatte die Auftragetaschen
markiert. Die übrigen Teile der Gelgießkammer werden mit Wasser gereinigt.
ACHTUNG: Keine organischen Lösungsmittel, Säuren oder Basen zum Reinigen der
Kammerteile verwenden!
Nicht sofort benötigte Gele können als Sandwich in Folie eingewickelt im Kühlschrank
aufbewahrt werden.
3.2 PROBENVORBEREITUNG
In leeren Mikroeppendorfgefäßen werden mittels einer Hamilton-Spritze jeweils 5 µl der
Standardproteine, des Standardprotein-Mixes bzw. der Probe (c = jeweils 1 mg/mL) mit 5 µl
Denaturierungsmix gemischt und 5 Minuten am kochenden Wasserbad erhitzt.
Die Proben sollten ehebaldigst für die Elektrophorese verwendet werden.
Zusammensetzung des Denaturierungsmixes unter reduzierenden Bedingungen:
0.125M Tris-Cl, pH=6.8, 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol, 1% Bromphenolblau.
Bromphenolblau dient als Frontmarker, Mercaptoethanol reduziert die Disulfidbrücken der
Proteine.
5

3.3 VORBEREITUNG DER ELEKTROPHORESE
1. Die Sandwiches sind an der Elektrophoreseeinheit mit je 1 Klammer so anzubringen, dass
die Glasplatten nach vorne weisen.
2. Nun werden die Kühlschläuche angeschlossen und der Wasserhahn aufgedreht.
3. 125 mL des vorbereitete doppeltkonzentrierte Laufpuffer werden mit 125 mL destilliertem
Wasser verdünnt und gut durchmischt.
4. Die unteren Pufferkammern werden mit Laufpuffer (0.025M Tris, 0.192M Glycin,
0.1% SDS, pH=8.3) so hoch gefüllt, dass die Sandwiches ca. 1 cm eintauchen. Die
Kämme werden entfernt und soviel Laufpuffer in die oberen Pufferkammern (hinter den
Sandwiches) gegossen, dass auch die Auftragetaschen gefüllt sind.
5. Mit der 10 µL Hamiltonspritze werden jeweils 3-4 µl der denaturierten Standardproteine,
des Standardprotein-Mixes bzw. der Probe vorsichtig in die Auftragetaschen eingebracht
(Beispiel für ein Auftrageschema siehe Abb. 3).
Standardprotein-Mix
Probe
Enolase
Myoglobin
BSA
Probe
Conalbumin
Carbonic Anhydrase
Probe
Standardprotein-Mix
Abb. 3: Mögliches Auftrageschema für Standardproteine und Probe.
6. Der Deckel wird nun auf die Elektrophoreseeinheit aufgesetzt (er muss einrasten) und die
Kabel werden an das Netzgerät angeschlossen (ACHTUNG: Farben beachten!).
3.4 ELEKTROPHORESE
1. Den Netzstrom des Power Supply an der Rückseite des Gerätes aufdrehen. Das Programm
geht in den End-Modus.
2. Um die Spannungswerte und Stromwerte einzugeben drücken Sie die SET/ENTER Taste
am Gerät, um in den Programm-Modus zu gelangen. Das Spannungssymbol V leuchtet
auf und der Wert für die Spannung blinkt. Durch drücken der Taste ↓/↑ stellen Sie die
gewünschten Spannungen von 220 V ein. SET/ENTER drücken, um die Wahl zu
bestätigen. Wenn der Spannungswert vom Anfang in Ordnung ist, einfach SET/ENTER
drücken, um die Wahl zu bestätigen.
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3. Auf der Anzeige blinkt nun der zuletzt programmierte Stromwert. Durch drücken der
Taste ↓/↑ stellen Sie den gewünschten Stromwert von 40 mA ein. SET/ENTER drücken,
um die Wahl zu bestätigen. Wenn der Stromwert vom Anfang in Ordnung ist, einfach
SET/ENTER drücken, um die Wahl zu bestätigen.
4. Nun blinkt der Wert für die Zeit. Da Sie selbst entschieden werden wann das Gel fertig
gelaufen ist, sollte dieser Wert auf jeden Fall größer als 20 Stunden gewählt werden.
Durch drücken der Taste ↓/↑ stellen Sie den gewünschten Wert von 20 Stunden ein.
SET/ENTER drücken, um die Wahl zu bestätigen. Wenn die Zeitangabe vom Anfang in
Ordnung ist, einfach SET/ENTER drücken, um die Wahl zu bestätigen.
5. Nach dem Programmieren drücken Sie RUN und starten die Elektrophorese. VIEW
drücken um die aktuellen Spannungen, Stromwerte und die abgelaufene Zeit anzuzeigen.
6. Bevor der Frontmarker das Niveau des Puffers in der unteren Pufferkammer erreicht, wird
der Lauf durch drücken der STOP Taste beendet. Der Lauf kann 30 min – 60 min dauern.
Durch drücken der VIEW Taste werden die Endparameter angezeigt. Die Kabel werden
abgesteckt, die Wasserkühlung abgedreht und der Deckel geöffnet.
7. Nach Entfernen der Klammern werden die Sandwiches aus der Elektrophoresekammer
herausgenommen und mit Wasser abgespült und die Glasplatten vorsichtig mit einem
Messer oder einer Rasierklinge von den Gelen abgehoben. Die Sammelgele werden
abgetrennt und verworfen. Zur Markierung der beiden Trenngele wird vom ersten Gel ein
kleines Stück des oberen rechten Ecks und vom zweiten Gel das untere rechte Eck
abgeschnitten.
3.5 FÄRBUNG UND DETEKTION
ACHTUNG: Färbe- und Entfärbelösung sparsam verwenden! Es genügt, wenn die Gele
gerade mit Lösung bedeckt sind!
1. Die beiden Trenngele werden in ein mit Färbelösung (0.025% Coomassie Blau R-250,
40% Methanol, 7% Essigsäure) gefülltes Plastikgefäß transferiert. (ACHTUNG: Die Gele
nur mit nassen Handschuhen angreifen, da sie sonst leicht zerreissen!)
2. Die Färbung dauert etwa 30-40 min und die Plastikschale sollte manchmal leicht
geschwenkt werden.
3. Nach Abspülen mit Wasser werden die Gele im Entfärbebad I (40% Methanol, 7%
Essigsäure ) entfärbt bis der Hintergrund nur noch schwach blau ist. Danach werden die
Gele im Entfärbebad II (7% Essigsäure, 5% Methanol) so lange entfärbt, bis der
Hintergrund beinahe ungefärbt ist und die Gele mit dem Assistenen fotokopiert/eingescanned
werden können (Fotokopie vergrößern).
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3.6 AUSWERTUNG
Nach Entfärbung der Gele werden diese zwischen zwei Kunststoffolien gelegt und
fotokopiert. Die Auswertung erfolgt auf folgende Weise:
(i) Bestimmung der Rf-Werte der einzelnen Proteine durch Ausmessen derer
Wanderungsweiten im Trenngel relativ zu der des zugefügten Frontmarkers.
(ii) Erstellung der Kalibrationskurve log Mw gegen Rf-Wert
(iii) Ermittlung des Molekulargewichts des Probeproteins aus seinem Rf-Wert mit
Hilfe der Kalibrierfunktion.
Für die Erstellung der Kalibrierfunktion werden folgende Proteine verwendet:
Standardprotein
Conalbumin
Rinderserumalbumin (BSA)
Enolase
Carbonic Anhydrase
Myoglobin
4. PROTOKOLLIERUNG
(i) Aufgabenstellung
(ii) Elektrophoreseparameter:
Gelkonzentration, Geldicke, Trenngelhöhe, Dauer der Separation,
Stromstärke und Spannung Verlauf , ...
Standardproteine und deren Konzentrationen, absolute Proteinmenge der
einzelnen Proteine am Gel, Detektion
(iii) Kalibrierfunktion (log Mw gegen Rf)
(iv) Mw des Probeproteins
5. REFERENZEN
Mw in kDa
78
66
44
23,3
16,9
• Andrews, A. T. Electrophoresis: Theory, Techniques and Biochemical and Clinical
Applications, Oxford University Press, New York (1986).
• Ausubel, F. M., et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-
Interscience, New York (1995).
• Hames, B. D., ed., Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, 3rd ed.,
Oxford University Press, New York (1998).
• Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by
gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503–517 (1975).
8

1. Geräte
PLATZINVENTAR
1 Netzgerät EPS 301
1 Hoefer SE 250 Elektrophorese-Apparatur
1 Hoefer Mighty Small SE 245 Dual Gel Caster
1 Ultraschallbad
1 Heizplatte
2. Zubehör
2 Aluminiumoxidplatten
4 Abstandhalter
2 Glasplatten
4 Klammern
2 Kämme
1 Meßpipetten 10 ml
1 Meßpipette 5 ml
1 Hamilton-Spritze 10 µl
1 Hamilton-Spritze 100 µl
Pasteurpipetten und Saugball
Gummihandschuhe
Peleus-Ball
1 Rasierklinge
2 Wasserschläuche
1 Porzellanschale
Plastikfolie zum Fotokopieren der Gele
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