Skriptum F1 Praktikum, Block B Titel: Extrazelluläre pathogene ...

Skriptum
F1 Praktikum, Block B
Titel: Extrazelluläre pathogene Bakterien
Praktikumsleiter: Dr. Tobias Ölschläger
(3182150, t.oelschlaeger@mail.uni-wuerzburg.de)
unterstützt durch
A. Troge
M. Bartrow
Praktikumsort: Institut für Molekulare Infektionsbiologie,
Josef-Schneider-Str. 2, Bau D15
Beginn am 18.01.2009, um 9:15 Uhr
(Treffpunkt: Im Foyer, erreichbar durch den Haupteingang an der Nordfassade)
(bis 22.01.09; ca. 12:00 Uhr)
Praktikumsdurchführung im Raum 15.02.236
1

Thema:
Wichtige Unterschiede zwischen kommensalen/probiotischen E. coli Stämmen
und pathogenen E. coli Stämmen
Experimente
1) Nachweis verschiedener Virulenzgene (z.B. für Adhäsine, Toxine,
Eisenaufnahmesysteme) mittels PCR
2) Nachweis der Expression dieser Virulenzgene durch Demonstration der
entsprechenden biologischen Aktivität:
Mikroskopischer Nachweis der bakteriellen Adhäsion an Wirtszellen
Quantifizierung der bakteriellen Adhäsion
Nachweis der Hämolyse
Nachweis von Eisen-III-Chelatoren
3) Nachweis von probiotischen Eigenschaften eines probiotischen E. coli
Stammes:
Verdrängung bzw. Abtötung von Salmonellen durch EcN
Antiinvasiver Effekt des EcN
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1. Verhalten im Labor
Die Laboratorien am Institut für Molekulare Infektionsbiologie fallen unter die
Sicherheitsstufe 2 (GenTSV, BiostoffV).
Folgende Sicherheitsmaßnahmen sind zu beachten und strikt einzuhalten:
1.1 Zutrittsregelung:
Die den S2-Bereich begrenzenden Türen müssen geschlossen gehalten werden.
Personen unter 18 Jahren dürfen in den Laboratorien nicht arbeiten
1.2 Belehrung:
Nur Personen, die belehrt wurden, dürfen im Labor arbeiten. Die Belehrung ist zu
dokumentieren.
1.3 Sicherheitsanweisungen:
Im Laborbereich sind Laborkittel zu tragen. Diese werden vom Institut gestellt.
Laborkittel müssen im Laborbereich verbleiben.
Informieren Sie sich über die Lage der nächstgelegenen Sicherheitseinrichtungen wie
Feuerlöscher, Notdusche, Augendusche, Verbandskasten.
Verletzungen sind dem Betreuer umgehend zu melden.
Es ist verboten mit dem Mund zu pipettieren.
Es ist verboten im Laborbereich zu essen, zu trinken, zu rauchen oder zu schnupfen,
Kosmetika anzuwenden.
Verboten ist die Lagerung von Lebensmitteln, Getränken, Rauchwaren oder
Kosmetika im Laborbereich.
Türen und Fenster müssen während der Arbeiten geschlossen sein.
Arbeitsflächen vor und nach der Arbeit desinfizieren (70 % EtOH).
Die „Eppendorf“-Zentrifugen sind täglich zu desinfizieren (70% EtOH).
Offene Gefäße dürfen nicht zentrifugiert werden (Aerosolgefahr).
Vor dem Verlassen des Labors sind die Hände zuerst zu desinfizieren, dann zu
waschen und können anschließend mit einer Handcreme rückgefettet werden.
3

2. Theorie
2.1 Pathogene Bakterien
Nur eine verschwindend geringe Zahl an Bakterien ist humanpathogen. Die überwiegende
Mehrheit der Bakterien ist harmlos oder sogar nützlich für die Gesundheit(serhaltung) des
Menschen.
Pathogene Bakterien zeigen gegenüber den harmlosen oder für den Menschen positiven
(Kommensalen, Probiotika) Bakterien charakteristische Merkmale. Dazu gehören
zusätzliche Gene, die für Virulenz-/Pathogenitätsfaktoren kodieren. Daher ist
beispielsweise das Genom von pathogenen E. coli Stämmen größer als jenes der
apathogenen E. coli K-12 Stämme. Diese Gene können als komplette Sets /funktionale
Einheiten durch horizontalen Gentransfer erworben werden. Dies bedeutet im Extremfall,
dass aus einem harmlosen Bakterium durch die Übertragung eines Sets von
Pathogenitätsgenen ein pathogenes Bakterium entsteht. Daher werden solche Ereignisse
auch als Quantensprünge in der Evolution bezeichnet.
Die horizontale Genübertragung kann mittels Plasmiden (Konjugation), Phagen
(Transduktion) oder nackter DNA (Transformation) erfolgen.
Die Virulenzgene kodieren z.B. für:
Adhäsine
Invasine
Toxine
Eisenaufnahmesysteme
Die Präsenz von Virulenzgenen kann u.a. mittels PCR (Polymerase-Chain-Reaction)
nachgewiesen werden.
Die Expression von Virulenzgenen kann durch Nachweis der spezifischen Funktion der
entsprechenden Genprodukte geführt werden.
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2.2 Probiotische Bakterien
Probiotische Bakterien sind solche, deren Einnahme als lebende Mikroorganismen der
Gesundheit des Menschen förderlich ist, indem Erkrankungen verhindert (Prävention)
oder therapiert werden. Beispiele probiotischer Mikroorganismen sind Saccharomyces
boulardii, verschiede Lactobacillus Stämme und probiotische E. coli Stämme. Die
zugrunde liegenden Mechanismen der probiotischen Wirksamkeit sind jedoch noch
weitgehend unverstanden. Für einige probiotische Bakterien konnte gezeigt werden, dass
sie eine unspezifische Immunstimulation induzieren, die Adhäsion von Pathogenen
inhibieren, Pathogene verdrängen oder abtöten können und/oder eine hohe kompetitive
Potenz besitzen.
Für den in unserer Arbeitgruppe untersuchten probiotischen E. coli Stamm Nissle 1917
(EcN) konnten wir zeigen, dass er nicht nur Microcine produziert, die pathogene
Bakterien (z.B. Salmonella enterica Serovar Typhimurium) abzutöten vermögen, sondern
dass EcN auch die Invasivität von pathogenen Bakterien zu inhibieren vermag. Zu den
pathogenen Bakterien, die in der Lage sind ihre Aufnahme in Wirtszellen (Invasion) zu
induzieren gehören Salmonella enterica Serovar Typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia
enterocolitica und Listeria monocytogenes.
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3. Wochenplan für Block B; Extrazelluläre pathogene Bakterien
Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag Freitag
9: 15 Uhr:
Sicherheitsbelehrung
9:15: Start des
Verdrängungsexperiments
10:00 Uhr Theorie Jeweils zu vollen Stunde:
OD-Bestimmung ;
Verdünnungen
ausplattieren
11:00 Uhr Agar-Platten Nachweis von
gießen
Virulenzfaktoren
9:15:
Start Invasionsassay
Ansetzen der 2 h Kulturen
11:15 OD-Bestimmung
der 2h Kulturen und
verdünnen
11:45 Start des
Invasionsassays
12: 00 Uhr Mittagspause 12:30 Mittagspause 12:15 Bestimmung des
Inokulums
13:00 Uhr Vorbereitung
PCR zum Nachweis von
Virulenzgenen
14:00 Uhr Start der PCR
Test auf Hämolyse und
Eisenchelatoren
9:15 – 11:00 Vorlesung 9:30 Kolloquium Gruppe 1
Auswertung Invasions
Assay (parallel zu den
Tagesexperimenten)
10:00 Kolloquium Gruppe 2
10:30 Kolloquium Gruppe 3
12:30 Start der
Adhäsionsexperimente
13:30 Fortsetzung 13:00 Mittagspause 13:30 Hefeagglutination 11:30 Auswertung des
quantitativen
Adhäsionsassays
Verdrängungsexperiment
14:00 Auftragen der PCR-
Proben vom Vortag auf
das Gel
15:00 Uhr Agarosegel
gießen
14:30 Start der
Elektrophorese
16:00 Ende der PCR 15:00 Zugabe von
Gentamycin
Ca. 17:00 Ende Ca. 17:00 Ende 16:00 Ende des
Invasionsassay: Lyse der
EZ und Bestimmung der
CFU
16:30 Ende der
Elektrophorese, EtBr-
Färbung und
Dokumentation
Ca. 17:30 Ende
14:30 Giemsafärbung und
Epithelzelllyse zur
Freisetzung der
adhärierenden Bakterien
15:00 CFU-Bestimmung
der adh. Bakterien
15:30 Mikroskopie der
Giemsapräparate
11:00 Kolloquium Gruppe 4
12:00
Abschlussbesprechung,
Aufräumen und Auffüllen
der Vorräte
6

4. Material und Methoden
4.1. Material
4.1.1 Bakterienstämme
Tabelle 1: Im Praktikum verwendete Bakterienstämme und wichtige Merkmale derselben.
Spezies Stammbezeichnung Wichtige Merkmale Referenz
Salmonella SL1344 Klinisches Isolat, Smr 1
typhimurium
Citrobacter 3009 klinisches Harnwegsisolat 8
freundii
E. coli AAEC189 K-12 Laborsicherheitsstamm 2
fim-Deletionsmutante
E. coli CFT073 uropathogenes, klinisches Isolat, 3
nahe verwandt mit EcN, Genom sequenziert
E. coli 536 uropathogenes, klinisches Isolat, Genom 4
sequenziert
E. coli NU14 uropathogenes, klinisches Isolat, 5
E. coli Nissle1917 (EcN) probiotisches Fäkalisolat, nahe verwandt 6
mit CFT073
E. coli SK22D isogene, Mikrocin-negative Mutante 6
des EcN
E. coli MG1655 K-12 Sicherheitslaborstamm, 7
Genom sequenziert
___________________________________________________________________________
Referenzen
1.) Ehrbar K, Mirold S, Friebel A, Stender S, Hardt WD.
Characterization of effector proteins translocated via the SPI1 type III secretion system of Salmonella
typhimurium.
Int J Med Microbiol. 2002 Feb;291(6-7):479-85. Review.
2.) Schwan WR, Lee JL, Lenard FA, Matthews BT, Beck MT.
Osmolarity and pH growth conditions regulate fim gene transcription and type 1 pilus expression in
uropathogenic Escherichia coli.
Infect Immun. 2002 Mar;70(3):1391-402.
7

3.) Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko D, Buckles EL, Liou SR, Boutin A,
Hackett J, Stroud D, Mayhew GF, Rose DJ, Zhou S, Schwartz DC, Perna NT, Mobley HL, Donnenberg MS,
Blattner FR.
Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 24;99(26):17020-4.
4.) Brzuszkiewicz E, Bruggemann H, Liesegang H, Emmerth M, Olschlager T, Nagy G, Albermann K, Wagner
C, Buchrieser C, Emody L, Gottschalk G, Hacker J, Dobrindt U.
How to become a uropathogen: comparative genomic analysis of extraintestinal pathogenic Escherichia coli
strains.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Aug 22;103(34):12879-84.
5.) Johnson JR, Weissman SJ, Stell AL, Trintchina E, Dykhuizen DE, Sokurenko EV.
Clonal and pathotypic analysis of archetypal Escherichia coli cystitis isolate NU14.
J Infect Dis. 2001 Dec 15;184(12):1556-65.
6.) Altenhoefer A, Oswald S, Sonnenborn U, Enders C, Schulze J, Hacker J, Oelschlaeger TA.
The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 interferes with invasion of human intestinal epithelial cells by
different enteroinvasive bacterial pathogens.
FEMS Immunol Med Microbiol. 2004 Apr 9;40(3):223-9.
7.) Blattner FR, Plunkett G 3rd, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode
CK, Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B, Shao Y.
The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.
Science. 1997 Sep 5;277(5331):1453-74.
8.) Hess, P., A. Altenhöfer, A.S. Khan, N. Daryab, K.S. Kim, J. Hacker, and Oelschlaeger, T.A. (2004) A
Salmonella fim-homologue in Citrobacter freundii mediates invasion in vitro and crossing of the blood brain
barrier in the rat pub model. Infect. Immun. 72: 5298-5307.
8

4.2 Methoden
Ausgangsmaterial (Template)
Genom-DNA, Plasmide, DNA-Fragmente …
5‘
3‘
Synthesebereich z.B. Gen
3‘
5‘
Zyklus 1
1.Schritt: Denaturierung (30 sec, 95 o C)
2. Schritt: Annealing (30 sec, 40 – 60 o C)
5‘ 3‘
3‘-Primer
Synthesebereich z.B. Gen
5‘-Primer
3‘
5‘
3. Schritt: Elongation (1 min pro kb, 68 – 75 o C)
5‘ 3‘
3‘-Primer
Synthesebereich z.B. Gen
5‘-Primer
3‘
5‘
Zyklus 2
1. Schritt: Denaturierung (30 sec, 95 o C)
2. Schritt: Annealing (30 sec, 40 – 60 o C)
5‘ 3‘
5‘-Primer
3‘-Primer
3‘-Primer
5‘-Primer
3‘
5‘
3. Schritt: Elongation (1 min pro kb, 68 – 75 o C)
5‘ 3‘
3‘
5‘
Abbildung 1: Prinzip der Polymerase-
Kettenreaktion.
4.2.1 PCR
Die Polymerasekettenreaktion basiert auf
dem Einsatz von Oligonukleotidpaaren
(Primer), die komplementär sind zu
Sequenzen des nachzuweisenden Gens.
Ein Primer hat die komplementäre
Sequenz zu einem Abschnitt auf dem
kodierenden und der andere Primer jene
zu einem Abschnitt auf dem nichtkodierenden
DNA-Strang. Der von den
Primern begrenzte Bereich wird
amplifiziert durch eine temperaturstabile
DNA-Polymerase (z.B. Taq
Polymerase).
Der Reaktionsansatz für die PCR enthält
neben den Primern und der
temperaturstabilen DNA-Polymerase
natürlich DNA (Template) aus jenem
Organismus, der auf die Präsenz eines
bestimmten Gens geprüft werden soll.
Für die Amplifikation sind auch noch
alle vier Triphosphate notwendig sowie
ein Puffer der auch Magnesiumionen
enthält.
Die PCR wird in sogenannte Zyklen
eingeteilt. Jeder Zyklus besteht aus
einer Denaturierungsphase –
aufschmelzen der dsDNA in
Einzelstränge
einer Annealingphase - Primer binden an
die komplementäre Sequenz auf den
Einzelsträngen der DNA
einer Elongationsphase – die
Polymerase synthetisiert den
komplementären Strang ausgehend vom
gebundenen
Primer
Ab dem 3. Zyklus entstehen Fragmente,
die genau der Länge des zu
amplifizierenden Bereichs entsprechen
(siehe Abbildung 1). Diese Fragmente
werden in den darauf folgenden PCR-
Zyklen exponentiell vermehrt.
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4.2.1 Die PCR-Primer
Virulenzgen fimH (Nachweis des Typ 1 Pili-Adhäsins);
Primer fimH f+r Produkt 508 bp
Virulenzgene papEF (Nachweis dieser Gene des P Pili-Genclusters);
Primer papEF f+r Produkt 336 bp
Virulenzgene sfa/focDE (Nachweis dieser Gene des S Pili-Genclusters);
Primer sfa 1+2 Produkt 410 bp
Virulenzgen hlyA (Nachweis dieses Gens als Teil des α-Hämolysingenclusters);
Primer hly f+r Produkt 1177 bp
Virulenzgen fyuA (Nachweis des Gens für den OM-Rezeptor des Yersiniabaktin-
Eisenaufnahme-Systems);
Primer fyuA f+r Produkt 880 bp
4.2.2 Bakterienstämme zur Prüfung auf die Präsenz von Virulenzgenen:
E. coli Stämme: AAEC189, Nissle1917, 536, CFT073, NU14
S. typhimurium Stamm SL1344
4.2.3 Bedingungen für den Nachweis der Virulenzgene sind wie folgt:
Die PCR wird in einem 25µl-Ansatz mit einer Primer-Konzentration von 0,6µM/25µl
durchgeführt. Es wird der „REDTaqReadyMixPCR Reaction Mix With MgCl 2 “ von
SIGMA (www.sigmaaldrich.com) verwendet. In diesem Mix sind die dNTPs (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP), die Taq DNA Polymerase, der Reaktionspuffer (Tris-HCl, KCl, MgCl 2 ) und
ein 2x konzentrierter Ladepuffer enthalten. Es wird also ein „MasterMix“ aus Wasser,
Primern und der REDTaq-Mix hergestellt und die Templates (je 2µl der 100µl aufgekochten
Übernachtkulturen der Kontrollstämme) zugegeben.
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So kann die Vorbereitungszeit verkürzt und das Kontaminationsrisiko mehrerer
Pipettierschritte minimiert werden.
Protokoll für die PCR-Reaktion:
-Aufheizen der Proben auf 95°C für 10 Min (Initiale Denaturierung).
-30 Zyklen: Denaturierung 95°C 30 Sek., Annealing 63°C 30 Sek, Elongation 72°C 90 Sek.
-Fertigstellen der begonnenen Amplifikate 72°C 5 Min (Finale Elongation).
-Kühlen der Proben bei 8°C
Vor der Elektrophorese: Kühlen der Proben im Kühlschrank oder Lagerung bei -20°C.
Nach der PCR-Reaktion können für die Elektrophorese jeweils 10µl des Produktes direkt auf
ein 2%iges Agarose-Gel aufgetragen werden. Für dieses Gel werden 3g Agarose in 150ml 1x
TAE-Puffer (Tris-Acetat, EDTA) aufgekocht und in einer Gießvorrichtung, mit zwei
Kämmen für jeweils 20 Taschen, gegossen. Um die Größe der Produkte bestimmen zu können
wird ein 100bp-DNA-Marker (Fa.Biolabs; siehe Anhang) mit aufgetragen.
Die Elektrophorese wird für ca. eine Stunde bei 130V durchgeführt. Als Elektrophoresepuffer
dient wieder 1xTAE-Puffer. Danach wird das Gel in einem Ethidiumbromid-Bad (0,1 %) für
ca. eine halbe Stunde gefärbt und danach überschüssiges EtBr im Wasserbad entfernt. Mit
Hilfe einer UV-Lampe kann nun das EtBr, das zwischen die Basen der amplifizierten DNA
interkaliert, sichtbar gemacht werden.
4.3 Funktionaler Nachweis von Virulenzfaktoren
4.3.1 Nachweis der Adhärenz an humane Harnblasenepithelzellen
4.3.1.1 Lichtmikroskopischer Nachweis der Adhärenz nach Giemsa-Färbung
In „Chamber Slides“ werden T24 Zellen ausgesät und über Nacht (=24h) inkubiert (wird vom
Assistenten ausgeführt).
Zur Durchführung des Experiments erhält jede Gruppe einen Objektträger mit 8
Inkubationskammern („Chamber Slides“).
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Abbildung 2: Fotos von
„Chamber Slides“ mit
zwei bzw. acht
„Chambers“.
Die Bakterienstämme (Citrobacter freundii Stamm 3009, Escherichia coli K-12 Stamm
MG1655) werden in LB über Nacht kultiviert (wird von den Assistenten durchgeführt). Am
nächsten Morgen werden je 2ml LB-Medium mit 20µl 3009 bzw. 20µl MG1655
Übernachtkultur angeimpft und für 2h unter Schütteln bei 37 o C inkubiert. Danach sollten die
Bakterienkulturen eine OD 600 = 0,4 bis 0,6 erreicht haben. Dies entspricht dem Beginn der
logarithmischen Wachstumsphase. Von den Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase
wird je 1ml einer Verdünnung angelegt, die einer OD 600 = 0,1 entspricht. Von der 3009- und
der MG1655-Verdünnung werden je 8µl in die entsprechend beschrifteten
Inkubationskammern (Gruppen-Nr. mit Bleistift auf angerautem Teil des Objektträgers; im
Protokoll Schemazeichnung zur Identifizierung wo welcher Bakterienstamm zugesetzt wurde)
mit den T24 Zellen gegeben. Eine homogene Durchmischung wird durch mehrmaliges aufund
ab-pipettieren erreicht. Bitte dabei nicht den Boden der Kavität berühren. Dort befindet
sich der empfindliche einschichtige Epithelzellrasen. Anschließend wird für mindestens 2h im
CO 2 -Inkubator inkubiert.
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Die infizierten Epithelzellen werden 3x mit je 200µl EBSS durch mehrmaliges auf- und abpipettieren
gewaschen. Nach Entfernen des „Chamber“-Aufbaues wird das Präparat durch
Eintauchen in Methanol (Küvette) bei RT für 20 Min. fixiert.
Vom fixierten Präparat wird das Methanol durch Aufsetzen des Objekträgers mit der
Längskante auf ein Fliespapier weitestgehend entfernt.
Sobald die Objektträger trocken sind, erfolgt die Färbung mit Giemsa. Dazu werden die
gekennzeichneten Objektträger in Küvetten überführt, die 80ml Giemsa-Lösung enthalten.
Die Objektträger verbleiben für 5 min. in der Färbelösung.
Anschließend werden die Objektträger unter fließendem H 2 O abgespült und luftgetrocknet.
Die gefärbten und getrockneten Präparate können mit dem 40x- oder 100x-Objektiv und unter
Zuhilfenahme von Immersionsöl mikroskopiert werden.
Charakteristische Bereiche des Präparats mit C.f. 3009 und jenem mit E. coli MG1655 werden
fotografiert und für die Dokumentation der Ergebnisse verwendet. Protokollieren Sie das
Ergebnis. Welcher Stamm ist wohl der pathogene und welcher der apathogene Stamm?
4.3.1.2 Quantitative Bestimmung der bakteriellen Adhärenz
1) 2ml Medium werden mit der geeigneten Menge (20µl C.f. 3009 bzw. 50 µl E. coli
MG1655) ÜNK angeimpft, sodass die Kultur nach 2h eine A 600 = 0,4 bis 0,6 erreicht hat
2) Bestimmung der OD 600
3) Verdünnen der Kultur auf OD 600 = 0,1
4) Pro Kavität einer 24-Kavitätenplatte werden 25µl der verdünnten 2h -Bakterienkultur
zugesetzt, gemischt und für 2 h im CO 2 Inkubator bebrütet
5) 5 x waschen der infizierten Zellrasen mit EBSS (jeweils 1 ml)
8) Lyse der Epithelzellen mit 0,1 % Triton X-100 durch Schütteln für 10 min.
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9) Bestimmung der Anzahl Epithelzell-assoziierter Bakterien durch Ausplattieren geeigneter
Verdünnungen (je 2 x 100 µl einer 1:100 Verdünnung von C.f . 3009 bzw. 2 x 100 µl
unverdünntes Zelllysat vom Ansatz mit E. coli MG1655)
4.3.2 Nachweis der Typ 1 Pili
Fimbrien/Pili, die Mannosereste binden gehören zu den Typ 1 Pili. Dieser Adhäsintyp ist bei
nahezu allen Spezies der Enterobakterienfamilie vorhanden. Der Nachweis der Expression
von Typ 1 Pili erfolgt mittels der Mannose-sensitiven Hefeagglutination. Zellen von
Saccharomyces cerevisiae tragen sehr viele Mannosereste an ihrer Oberfläche. Typ 1 Pili
exprimierende Bakterienzellen agglutinieren daher Hefezellen in Suspension sehr effizient.
Werden jedoch Bakterien- und Hefe-Zellen in Gegenwart von 100mM Mannose (Stamm-
Lösung 300 mM) gemischt erfolgt keine Agglutination, da die in Lösung befindlichen
Mannosemoleküle an FimH (das adhäsive Molekül der Typ 1 Pili) binden und damit eine
Bindung an die Mannosereste auf den Hefezellen blockiert wird.
Die Hefeagglutination zur Prüfung auf Typ 1 Pili wird durchgeführt indem (Ansatz A) 7µl
einer Hefesuspension (0,2g Bäckerhefe in 10ml 0,9 % NaCl suspendiert) und 7µl Wasser mit
7µl einer Übernachtkultur der zu testenden Bakterien (ÜNK) auf einem Objektträger gemischt
werden. Parallel dazu werden (Ansatz B) 7µl Hefesuspension mit 7µl 100 mM
Mannoselösung und 7µl derselben Bakterienkultur gemischt. Erfolgt eine Agglutination der
Hefezellen nur im Ansatz ohne Mannose wurde der Nachweis der Typ 1 Piliexpression im
Bakterienteststamm geführt.
Dieser Test wird für die Bakterienstämme E. coli AAEC189, EcN, 536, CFT073, NU14 und
S. typhimurium SL1344 durchgeführt.
Schema zur Durchführung der Mannose-sensitiven Hefeagglutination
Ansatz A
Ansatz B
7µl ÜNK 7µl ÜNK
7µl Wasser 7µl 100mM Mannoselösung in Wasser
7µl Hefesuspension 7µl Hefesuspension
14

4.3.3 Nachweis von Hämolysin durch Hämolyse
Proteintoxine, die Erythozyten lysieren werden als Hämolysine bezeichnet. Der Nachweis der
hämolytischen Aktivität kann durch Kultivierung der Testbakterien auf Blutagarplatten
erbracht werden. Bakterien die Hämolysin sekretieren sind durch klare Lysehöfe
ausgezeichnet, die die Bakterienkolonie umgeben.
Zur Prüfung der Bakterienstämme E. coli AAEC189, EcN, 536, CFT073, NU14 und S.
typhimurium SL1344 auf Hämolysinproduktion werden jeweils 5µl einer Übernachtkultur auf
die Blutagarplatte transferiert und zwar in einen von jeweils 6 Sektoren. Zuvor wird die
Blutagarplatte in 6 gleichgroße Sektoren („Tortenstücke“) eingeteilt, die mit den Kürzeln für
die Testbakterien markiert werden.
Nach Inkubation über Nacht bei 37 o C im Brutschrank können die Hämolysinproduzenten
identifiziert werden.
4.3.4 Nachweis der Cytotoxizität von Hämolysin für humane Harnblasenepithelzellen
Konfluente T24-Zellrasen wurden durch Aussäen von T24-Zellen 24h vor Versuchsbeginn
erhalten (wird von den Assistenten vorgenommen).
Die Bakterienstämme (E. coli 536 und die isogene nicht-hämolytische Mutante 536dh, E. coli
K-12 MG1655 und E. coli Nissle 1917 = EcN) werden über Nacht in LB kultiviert. Am
nächsten Morgen werden je 2 ml LB-Medium mit 20 µl 536, 20 µl 536dh, 15 µl EcN bzw. 20
µl MG1655 Übernachtkultur angeimpft und für 2h unter Schütteln bei 37 o C inkubiert.
Danach sollten die Bakterienkulturen eine OD 600 = 0,4 bis 0,6 erreicht haben. Dies entspricht
dem Beginn der logarithmischen Wachstumsphase. Von den Kulturen in der logarithmischen
Wachstumsphase wird je 1ml einer Verdünnung angelegt, die einer OD 600 = 0,1 entspricht.
Davon werden anschließend in jede Kavität des Objektträgers mit T24-Zellen 8µl gegeben
und 1,5 h im CO 2 -Inkubator bebrütet.
Nach 1,5h Inkubation der infizierten Epithelzellen wird der Überstand entfernt, der Zellrasen
mit je 200µl EBSS pro Kavität dreimal gewaschen und der Kammeraufbau abgenommen. Die
Objektträger mit den Zellrasen werden dann für 20 Minuten in Methanol getaucht und somit
fixiert. Nach 20 Minuten werden die Objektträger aus dem Methanol genommen, übriges
Methanol vorsichtig durch Tupfen entfernt und für fünf Minuten in Giemsa-Lösung getaucht.
Nach diesen fünf Minuten werden die Objektträger aus der Giemsa-Lösung genommen und
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unter fließendem Wasser von der restlichen Giemsa-Lösung befreit. Anschließend lässt man
die Objektträger an der Luft trocknen.
Wenn die Objektträger getrocknet sind, kann man die Präparate unter dem Mikroskop
betrachten. Hierzu eignet sich am besten eine 20-fache Vergrößerung.
4.3.5 Nachweis der Cytotoxizität mittels Propidium-Iodid-Färbung
Alternativ kann die Cytotoxizität wie folgt nachgewiesen werden. Dazu werden
Epithelzellrasen wie zuvor beschrieben mit Bakterien infiziert. Dann wird nach der 1,5h
Inkubation der infizierten Epithelzellen der Überstand entfernt und der Zellrasen mit je 200µl
EBSS pro Kavität dreimal gewaschen. Nach restlosem Absaugen des EBSS werden die
Kavitäten der Objektträger mit 250µl Propidiumiodid-Lösung (2µg/ml Propidiumiodid gelöst
in dest. H 2 O) gefüllt (Vorsicht: Propidiumiodid ist giftig und erbgutschädigend! Handschuhe
tragen und Abzug benutzen!). Diese lässt man dann für mindestens 20 Minuten einwirken.
Hierzu werden die Objektträger mit einem Tuch abgedeckt. Nach diesen 20 Minuten werden
die Objektträger mit destilliertem Wasser von überschüssiger Propidiumiodid-Lösung befreit.
Wenn die Objektträger getrocknet sind, kann man die Präparate unter dem Mikroskop
betrachten. Hierzu eignet sich am besten eine 10-fache Vergrößerung. Propidiumiodid färbt
nur die Kerne toter Zellen an. Die Färbung erfolgt durch Interkalation in DNA und zwar von
einem Molekül Propidiumiodid pro 4-5 Basen. Propidiumiodid bindet aber auch an RNA.
16

4.3.6 Nachweis von Siderophoren (Fe 3+ -Chelatoren)
Eine schnelle Möglichkeit, um generell die Expression von Siderophoren nachweisen zu
können, ist die Inkubation von Bakterienstämmen auf CAS-Indikatorplatten. Das Prinzip
dieser Indikator-Agarplatten beruht auf der Komplexierung von freien Fe(III)-Ionen im Agar.
Der ternäre Komplex aus Chromazurol S/Fe(III)/Hexadecyltrimethylammoniumbromid hat
eine tiefblaue Farbe. Wird eine CAS-Indikator-Agarplatte mit Bakterien beimpft, die in der
Lage sind, Siderophore zu produzieren und in das umgebende Medium zu sezernieren,
können diese Siderophore die Fe(III)-Ionen aus dem Chromazurol S-/HDTMA-Komplex
herauslösen. Dadurch verändert sich die Farbe des Farbstoffes Chromazurol S von tiefblau
nach gelb. Bakterienkolonien, die Siderophore sezernieren, weisen dadurch einen gelblichen
Hof auf, der einfach vom blauen Agar mit noch immer komplexiertem Eisen unterschieden
werden kann.
4.4 Wirkungsweisen des probiotischen E. coli Stammes EcN
4.4.1 Verdrängung pathogener Bakterien während Kokultivierung
Wie bei allen Probiotika so ist auch beim EcN die Wirkungsweise noch nahezu ungeklärt.
Erklärungsmöglichkeiten für den Schutz des Wirtes durch EcN vor bakteriellen Infektionen,
z.B. einer Salmonella-Infektion, könnte die Produktion von bakteriziden Substanzen durch
EcN sein. Es konnte gezeigt werden, dass EcN tatsächlich zwei Microcine synthetisiert und
sekretiert. Diese sind auch in der Lage Salmonella abzutöten. Der Nachweis dazu kann in
einem Cokultivierungsexperiment geführt werden.
Durchführung des Experiments
Die Bakterienstämme (S. typhimurium SL1344, E. coli Nissle 1917 = EcN, SK22D = isogene,
microzin-negative EcN-Mutante) werden über Nacht in DMEM kultiviert. Am nächsten
Morgen werden 3ml DMEM-Medium in Röhrchen mit 25µl SL1344, 25µl SL1344 und 15µl
EcN, 25 µl SL1344 und 15µl SK22D, 15µl EcN bzw. 15µl SK22D angeimpft und unter
Schütteln bei 37°C inkubiert.
Jeweils nach einer Stunde wird von den jeweiligen Kulturen die OD 600 bestimmt und eine
geeignete Verdünnung zur CFU-Bestimmung ausplattiert. SL1344 als Einzelkultur wird auf
LB-Streptomycin-Agar-Platten ausplattiert. Die Cokultivierung von SL1344 und EcN bzw.
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SL1344 und SK22D werden auf LB-Agar-Platten mit 50µg/ml Streptomycin ausplattiert, um
die Anzahl der Salmonellen in der Cokultur zu erhalten. Außerdem werden die Cokulturen
noch auf MacConkey-Platten ausplattiert, da man auf diesen Platten leicht zwischen E. coli
(rote Kolonien) und Salmonellen (weiße Kolonien) unterscheiden kann. Die Kontrollen EcN
als Einzelkultur bzw. SK22D als Einzelkultur werden auf LB-Agar-Platten ausplattiert.
4.4.2 Antiinvasiver Effekt
Der probiotische E. coli Stamm Nissle 1917 kann gnotobiotische Ferkel vor einer Salmonella-
Infektion schützen. Ein wesentlicher Virulenzfaktor von pathogenen Salmonellen ist deren
Fähigkeit in Wirts(epithel)zellen einzudringen (Invasivität). Die Invasivität ist auf der
Pathogenitätsinsel 1 (SPI1) von mehr als 30 Genen kodiert. Die für die Invasivität
verantwortlichen Effektoren werden mittels eines Typ 3 Sekretionssystems (TTSS) in die
Wirtzellen injiziert.
Eine mögliche Erklärung für die genannte protektive Wirkung des EcN könnte die Fähigkeit
des EcN sein, die Invasivität der Salmonellen zu inhibieren. Dies konnte von uns in vitro
gezeigt werden (Altenhoefer et al., 2004).
Zusammenfassung des Experiments zur Quantifizierung der bakteriellen Invasivität
Zu einschichtigen, konfluenten Zellrasen aus humanen Epithelzellen werden ~30 Bakterien
aus dem Anfang der logarithmischen Wachstumsphase pro Epithelzelle gegeben. Während
der folgenden Inkubation können die Bakterien in die Epithelzellen eindringen. Danach
werden die Zellrasen gewaschen und frisches, vorgewärmtes Zellkulturmedium zugesetzt, das
100µg/ml Gentamycin enthält. Dieses Antibiotikum dringt nicht in die Epithelzellen ein und
tötet daher während der folgenden Inkubation nur die extrazellulär verbliebenen Bakterien ab.
Die intrazellulären Bakterien werden durch Lyse der Epithelzellen freigesetzt und ihre Zahl
durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen bestimmt. Mit der eingesetzten Bakterienzahl
zu Beginn des Experiments lässt sich der Prozentsatz des Inokulums berechnen, der in die
Epithelzellen internalisiert wurde. Ebenso kann die Anzahl der intrazellulären Bakterien pro
Epithelzelle ermittelt werden, wenn die Zahl der Epithelzellen pro Kavität bestimmt wurde.
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Durchführung des Experiments
Konfluente T24-Zellrasen wurden erhalten durch Aussäen von T24-Zellen 24h vor
Versuchsbeginn in 24-Kavitäten-Platten (wird von den Assistenten vorgenommen).
Das Prinzip des Invasionsassys
Gentamicin-Protektions-Assay
1. Zugabe der Bakterien zum konfluenten Epithelzellrasen
2. Inkubation für 2-4h
3. Abtöten der extrazellulären Bakterien mit 100µg/ml
Gentamicin während 1 h
4. Freisetzen der intrazellulären Bakterien durch Lyse der
eukaryotischen Zellen
5. Bestimmung der Anzahl der intrazellulären Bakterien durch
Ausplattieren
Schema zur Beimpfung der 24 Kavitätenplatte
SL1344
(12,5 µl)
SL1344
(12,5 µl)
SL (12,5 µl)
+ MG (100
µl)
SL (12,5 µl)
+ MG (100
µl)
EcN
(100 µl)
EcN
(100 µl)
SK22D
(100 µl)
SK22D
(100 µl)
MG1655
(100 µl)
MG1655
(100 µl)
SL (12,5 µl)
+ EcN (100
µl)
SL (12,5
µl)+ EcN
(100 µl)
SL (12,5 µl)
+ SK (100
µl)
SL (12,5 µl)
+ SK (100
µl)
Nur T24
Nur T24
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Die Bakterienstämme (Salmonella enterica serovar Typhimurium Stamm SL1344, E. coli K-
12 Stamm MG1655, EcN, SK22D) werden in DMEM über Nacht kultiviert (d.h. müssen am
Tag zuvor angesetzt werden). Am nächsten Morgen werden je 2ml DMEM-Medium mit 25µl
SL1344, 15 µl EcN und SK22D bzw. 20 µl MG1655 Übernachtkultur angeimpft und für 2 h
unter Schütteln bei 37 o C inkubiert. Danach sollten die Bakterienkulturen eine OD 600 = 0,4
bis 0,6 errreicht haben. Dies entspricht dem Beginn der logarithmischen Wachstumsphase.
Von den Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase wird je 1ml einer Verdünnung
angelegt, die einer OD 600 = 0,1 entspricht.
Davon werden 12,5µl SL1344, 100 µl EcN, SK22D oder MG1655 in jeweils zwei Kavitäten
mit T24-Zellen pipettiert (siehe Schema zur Beimpfung der 24 Kavitätenplatte). Zudem
werden je 2 Kavitäten entweder mit SL1344 + EcN, SL1344 + SK22D oder SL1344 +
MG1655 beimpft (siehe Schema zur Beimpfung der 24 Kavitätenplatte). Die 24-
Kavitätenplatten mit den infizierten Epithelzellen werden dann kurz auf dem Schütteltisch
gemischt und für mindestens 2h im CO 2 -Inkubator bebrütet.
Während der Inkubationszeit werden von den verdünnten Bakterienkulturen (eingestellt auf
eine OD 600 = 0,1) jeweils 2x100µl einer 1:10 5 Verdünnung ausplattiert, um die im
Experiment eingesetzte Bakterienzahl (= Inokulumsgröße) berechnen zu können (Markieren
Sie diese Platten mit CFU). Außerdem wird das Gentamycin-haltige Medium auf 37 o C
vorgewärmt.
Nach der Inkubation der infizierten Epithelzellen wird der Überstand entfernt, mit 1ml EBSS
pro Kavität der Zellrasen gewaschen und je 1ml frisches, auf 37 o C vorgewärmtes Medium,
das 100µg/ml Gentamycin enthält, zupipettiert. Gentamycin tötet während der anschließenden
1-stündigen Inkubation nur die extrazellulären Bakterien ab.
Um das Gentamycin zu entfernen wird der Überstand abgenommen und die Zellrasen 2x mit
je 1ml EBSS pro Kavität gewaschen. Die Freisetzung der intrazellulären Bakterien erfolgt
durch Schütteln mit je 1ml 0,1 % Triton X-100 für 10 min. bei RT.
Die Bakteriensuspension in den Kavitäten mit SL1344 werden jeweils 1:10 verdünnt und
davon 100µl auf eine LB-Platte mit Streptomycin ausplattiert. Von den übrigen
Bakteriensuspensionen werden je 100µl unverdünnt ausplattiert. Nach Inkubation der Platten
über Nacht können die Kolonien ausgezählt und die Invasionsrate bestimmt werden.
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