Skriptum F1 Praktikum, Block B Titel: Extrazelluläre pathogene ...
Skriptum F1 Praktikum, Block B Titel: Extrazelluläre pathogene ...
Skriptum F1 Praktikum, Block B Titel: Extrazelluläre pathogene ...
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<strong>Skriptum</strong><br />
<strong>F1</strong> <strong>Praktikum</strong>, <strong>Block</strong> B<br />
<strong>Titel</strong>: Extrazelluläre <strong>pathogene</strong> Bakterien<br />
<strong>Praktikum</strong>sleiter: Dr. Tobias Ölschläger<br />
(312150, t.oelschlaeger@mail.uni-wuerzburg.de)<br />
unterstützt durch Frau M. Bartrow und A. Troge<br />
<strong>Praktikum</strong>sort: Institut für Molekulare Infektionsbiologie,<br />
Beginn am 07.01.2008, um 9:15<br />
(Treffpunkt: Vor dem Sekretariat des Institutes)<br />
(bis 11.01.08; ca. 12:00 Uhr)<br />
<strong>Praktikum</strong>sdurchführung im Raum A047<br />
1
Thema:<br />
Wichtige Unterschiede zwischen kommensalen/probiotischen E. coli Stämmen<br />
und <strong>pathogene</strong>n E. coli Stämmen<br />
Experimente<br />
1) Nachweis verschiedener Virulenzgene (z.B. für Adhäsine, Toxine,<br />
Eisenaufnahmesysteme) mittels PCR<br />
2) Nachweis der Expression dieser Virulenzgene durch Demonstration der<br />
entsprechenden biologischen Aktivität<br />
Dazu gehört der mikroskopische Nachweis der bakteriellen Adhäsion an<br />
Wirtszellen, die Quantifizierung der bakteriellen Adhäsion<br />
Nachweis der Hämolyse<br />
Nachweis von Eisen-III-Chlatoren<br />
3) Nachweis von probiotischen Eigenschaften eines probiotischen E. coli<br />
Stammes:<br />
Verdrängung bzw. Abtötung von Salmonellen durch EcN<br />
Antiinvasiver Effekt des EcN<br />
2
1. Verhalten im Labor<br />
Die Laboratorien am Institut für Molekulare Infektionsbiologie fallen unter die<br />
Sicherheitsstufe 2 (GenTSV, BiostoffV).<br />
Folgende Sicherheitsmaßnahmen sind zu beachten und strikt einzuhalten:<br />
1.1 Zutrittsregelung:<br />
Die den S2-Bereich begrenzenden Türen müssen geschlossen gehalten werden<br />
Personen unter 18 Jahren dürfen in den Laboratorien nicht arbeiten<br />
1.2 Belehrung:<br />
Nur Personen, die belehrt wurden, dürfen im Labor arbeiten. Die Belehrung ist zu<br />
dokumentieren.<br />
1.3 Sicherheitsanweisungen:<br />
Im Laborbereich sind Laborkittel zu tragen. Diese werden vom Institut gestellt.<br />
Laborkittel müssen im Laborbereich verbleiben.<br />
Informieren Sie sich über die Lage der nächstgelegenen Sicherheitseinrichtungen wie<br />
Feuerlöscher, Notdusche, Augendusche, Verbandskasten.<br />
Verletzungen sind dem Betreuer umgehend zu melden.<br />
Es ist verboten mit dem Mund zu pipettieren.<br />
Es ist verboten im Laborbereich zu essen, zu trinken, zu rauchen oder zu schnupfen,<br />
Kosmetika anzuwenden.<br />
Verboten ist die Lagerung von Lebensmitteln, Getränken, Rauchwaren oder<br />
Kosmetika im Laborbereich.<br />
Türen und Fenster müssen während der Arbeiten geschlossen sein.<br />
Arbeitsflächen vor und nach der Arbeit desinfizieren (70 % EtOH).<br />
Die „Eppendorf“-Zentrifugen sind täglich zu desinfizieren (70% EtOH).<br />
Offene Gefäße dürfen nicht zentrifugiert werden (Aerosolgefahr).<br />
Vor dem Verlassen des Labors sind die Hände zuerst zu desinfizieren, dann zu<br />
waschen und können anschließend mit einer Handcreme rückgefettet werden.<br />
3
2. Theorie<br />
2.1 Pathogene Bakterien<br />
Nur eine verschwindend geringe Zahl an Bakterien ist humanpathogen. Die überwiegende<br />
Mehrheit der Bakterien ist harmlos oder sogar nützlich für die Gesundheit(serhaltung) des<br />
Menschen.<br />
Pathogene Bakterien zeigen gegenüber den harmlosen oder für den Menschen positiven<br />
(Kommensalen, Probiotika) Bakterien charakteristische Merkmale. Dazu gehören<br />
zusätzliche Gene, die für Virulenz-/Pathogenitätsfaktoren kodieren. Daher ist<br />
beispielsweise das Genom von <strong>pathogene</strong>n E. coli Stämmen größer als jenes der<br />
a<strong>pathogene</strong>n E. coli K-12 Stämme. Diese Gene können als komplette Sets /funktionale<br />
Einheiten durch horizontalen Gentransfer erworben werden. Dies bedeutet im Extremfall,<br />
dass aus einem harmlosen Bakterium durch die Übertragung eines Sets von<br />
Pathogenitätsgenen ein <strong>pathogene</strong>s Bakterium entsteht. Daher werden solche Ereignisse<br />
auch als Quantensprünge in der Evolution bezeichnet.<br />
Die horizontale Genübertragung kann mittels Plasmiden (Konjugation), Phagen<br />
(Transduktion) oder nackter DNA (Transformation) erfolgen.<br />
Die Virulenzgene kodieren z.B. für:<br />
Adhäsine<br />
Invasine<br />
Toxine<br />
Eisenaufnahmesysteme<br />
Die Präsenz von Virulenzgenen kann u.a. mittels PCR (Polymerase-Chain-Reaction)<br />
nachgewiesen werden.<br />
Die Expression von Virulenzgenen kann durch Nachweis der spezifischen Funktion der<br />
entsprechenden Genprodukte geführt werden.<br />
4
2.2 Probiotische Bakterien<br />
Probiotische Bakterien sind solche, deren Einnahme als lebende Mikroorganismen der<br />
Gesundheit des Menschen förderlich ist, indem Erkrankungen verhindert (Prävention)<br />
oder therapiert werden. Beispiele probiotischer Mikroorganismen sind Saccharomyces<br />
boulardii, verschiede Lactobacillus Stämme und probiotische E. coli Stämme. Die<br />
zugrunde liegenden Mechanismen der probiotischen Wirksamkeit sind jedoch noch<br />
weitgehend unverstanden. Für einige probiotische Bakterien konnte gezeigt werden, dass<br />
sie eine unspezifische Immunstimulation induzieren, die Adhäsion von Pathogenen<br />
inhibieren, Pathogene verdrängen oder abtöten können und/oder eine hohe kompetitive<br />
Potenz besitzen.<br />
Für den in unserer Arbeitgruppe untersuchten probiotischen E. coli Stamm Nissle 1917<br />
(EcN) konnten wir zeigen, dass er nicht nur Microcine produziert, die <strong>pathogene</strong><br />
Bakterien (z.B. Salmonella enterica Serovar Typhimurium) abzutöten vermögen, sondern<br />
dass EcN auch die Invasivität von <strong>pathogene</strong>n Bakterien zu inhibieren vermag. Zu den<br />
<strong>pathogene</strong>n Bakterien, die in der Lage sind ihre Aufnahme in Wirtszellen (Invasion) zu<br />
induzieren gehören Salmonella enterica Serovar Typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia<br />
enterocolitica und Listeria monocytogenes.<br />
5
3. Wochenplan für <strong>Block</strong> B; Extrazelluläre <strong>pathogene</strong> Bakterien<br />
Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag Freitag<br />
9: 15 Uhr:<br />
Sicherheitsbelehrung<br />
9:15: Start des<br />
Verdrängungsexperiments<br />
10:00 Uhr Theorie Jeweils zu vollen Stunde:<br />
OD-Bestimmung<br />
Verdünnungen ausplattiere<br />
11:00 Uhr Agar-Platten Nachweis von<br />
gießen<br />
Virulenzfaktoren<br />
9:15:<br />
Start Invasionsassay<br />
Ansetzen der 2 h Kulturen<br />
11:15 OD-Bestimmung<br />
der 2h Kulturen und<br />
verdünnen<br />
11:45 Start des<br />
Invasionsassays<br />
12: 00 Uhr Mittagspause 12:30 Mittagspause 12:15 Bestimmung des<br />
Inokulums<br />
13:00 Uhr Vorbereitung<br />
PCR zum Nachweis von<br />
Virulenzgenen<br />
14:00 Uhr Start der PCR<br />
Test auf Hämolyse und<br />
Eisenchelatoren<br />
9:15 – 11:00 Vorlesung 9:30 Kolloquium Gruppe 1<br />
Auswertung Invasions<br />
Assay (parallel zu den<br />
Tagesexperimenten)<br />
10:00 Kolloquium Gruppe 2<br />
10:30 Kolloquium Gruppe 3<br />
12:30 Start der<br />
Adhäsionsexperimente<br />
13:30 Fortsetzung 13:00 Mittagspause 13:30 Hefeagglutination 11:30 Auswertung des<br />
quantitativen<br />
Adhäsionsassays<br />
Verdrängunsgexperiment<br />
14:00 Auftragen der PCR-<br />
Proben vom Vortag auf<br />
das Gel<br />
15:00 Uhr Agarosegel<br />
gießen<br />
14:30 Start der<br />
Elektrophorese<br />
16:00 Ende der PCR 15:00 Zugabe von<br />
Gentamycin<br />
Ca. 17:00 Ende Ca. 17:00 Ende 16:00 Ende des<br />
Invasionsassay: Lyse der<br />
EZ und Bestimmung der<br />
CFU<br />
16:30 Ende der<br />
Elektrophorese, EtBr-<br />
Färbung und<br />
Dokumentation<br />
Ca. 17:30 Ende<br />
14:30 Giemsafärbung und<br />
Epithelzelllyse zur<br />
Freisetzung der<br />
adhärierenden Bakterien<br />
15:00 CFU-Bestimmung<br />
der adh. Bakterien<br />
15:30 Mikroskopie der<br />
Giemsapräparate<br />
11:00 Kolloquium Gruppe 4<br />
12:00<br />
Abschlußbesprechung,<br />
Aufräumen und Auffüllen<br />
der Vorräte<br />
6
4. Material und Methoden<br />
4.1. Material<br />
4.1.1 Bakterienstämme<br />
Tabelle 1: Im <strong>Praktikum</strong> verwendete Bakterienstämme und wichtige Merkmale derselben.<br />
Spezies Stammbezeichnung Wichtige Merkmale Referenz<br />
Salmonella SL1344 Klinisches Isolat, Smr 1<br />
typhimurium<br />
Citrobacter 3009 klinisches Harnwegsisolat 8<br />
freundii<br />
E. coli AAEC189 K-12 Laborsicherheitsstamm 2<br />
fim-Deletionsmutante<br />
E. coli CFT073 uro<strong>pathogene</strong>s, klinisches Isolat, 3<br />
nahe verwandt mit EcN, Genom sequenziert<br />
E. coli 536 uro<strong>pathogene</strong>s, klinisches Isolat, Genom 4<br />
sequenziert<br />
E. coli NU14 uro<strong>pathogene</strong>s, klinisches Isolat, 5<br />
E. coli Nissle1917 (EcN) probiotisches Fäkalisolat, nahe verwandt 6<br />
mit CFT073<br />
E. coli SK22D isogene, Mikrocin-negative Mutante 6<br />
des EcN<br />
E. coli MG1655 K-12 Sicherheitslaborstamm, 7<br />
Genom sequenziert<br />
___________________________________________________________________________<br />
Referenzen<br />
1.) Ehrbar K, Mirold S, Friebel A, Stender S, Hardt WD.<br />
Characterization of effector proteins translocated via the SPI1 type III secretion system of Salmonella<br />
typhimurium.<br />
Int J Med Microbiol. 2002 Feb;291(6-7):479-85. Review.<br />
2.) Schwan WR, Lee JL, Lenard FA, Matthews BT, Beck MT.<br />
Osmolarity and pH growth conditions regulate fim gene transcription and type 1 pilus expression in<br />
uropathogenic Escherichia coli.<br />
Infect Immun. 2002 Mar;70(3):1391-402.<br />
7
3.) Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko D, Buckles EL, Liou SR, Boutin A,<br />
Hackett J, Stroud D, Mayhew GF, Rose DJ, Zhou S, Schwartz DC, Perna NT, Mobley HL, Donnenberg MS,<br />
Blattner FR.<br />
Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 24;99(26):17020-4.<br />
4.) Brzuszkiewicz E, Bruggemann H, Liesegang H, Emmerth M, Olschlager T, Nagy G, Albermann K, Wagner<br />
C, Buchrieser C, Emody L, Gottschalk G, Hacker J, Dobrindt U.<br />
How to become a uropathogen: comparative genomic analysis of extraintestinal pathogenic Escherichia coli<br />
strains.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Aug 22;103(34):12879-84.<br />
5.) Johnson JR, Weissman SJ, Stell AL, Trintchina E, Dykhuizen DE, Sokurenko EV.<br />
Clonal and pathotypic analysis of archetypal Escherichia coli cystitis isolate NU14.<br />
J Infect Dis. 2001 Dec 15;184(12):1556-65.<br />
6.) Altenhoefer A, Oswald S, Sonnenborn U, Enders C, Schulze J, Hacker J, Oelschlaeger TA.<br />
The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 interferes with invasion of human intestinal epithelial cells by<br />
different enteroinvasive bacterial pathogens.<br />
FEMS Immunol Med Microbiol. 2004 Apr 9;40(3):223-9.<br />
7.) Blattner FR, Plunkett G 3rd, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode<br />
CK, Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B, Shao Y.<br />
The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.<br />
Science. 1997 Sep 5;277(5331):1453-74.<br />
8.) Hess, P., A. Altenhöfer, A.S. Khan, N. Daryab, K.S. Kim, J. Hacker, and Oelschlaeger, T.A. (2004) A<br />
Salmonella fim-homologue in Citrobacter freundii mediates invasion in vitro and crossing of the blood brain<br />
barrier in the rat pub model. Infect. Immun. 72: 5298-5307.<br />
8
4.2 Methoden<br />
Ausgangsmaterial (Template)<br />
Genom-DNA, Plasmide, DNA-Fragmente …<br />
5‘<br />
3‘<br />
Synthesebereich z.B. Gen<br />
3‘<br />
5‘<br />
Zyklus 1<br />
1.Schritt: Denaturierung (30 sec, 95 o C)<br />
2. Schritt: Annealing (30 sec, 40 – 60 o C)<br />
5‘ 3‘<br />
3‘-Primer<br />
Synthesebereich z.B. Gen<br />
5‘-Primer<br />
3‘<br />
5‘<br />
3. Schritt: Elongation (1 min pro kb, 68 – 75 o C)<br />
5‘ 3‘<br />
3‘-Primer<br />
Synthesebereich z.B. Gen<br />
5‘-Primer<br />
3‘<br />
5‘<br />
Zyklus 2<br />
1. Schritt: Denaturierung (30 sec, 95 o C)<br />
2. Schritt: Annealing (30 sec, 40 – 60 o C)<br />
5‘ 3‘<br />
5‘-Primer<br />
3‘-Primer<br />
3‘-Primer<br />
5‘-Primer<br />
3‘<br />
5‘<br />
3. Schritt: Elongation (1 min pro kb, 68 – 75 o C)<br />
5‘ 3‘<br />
3‘<br />
5‘<br />
Abbildung 1: Prinzip der Polymerase-<br />
Kettenreaktion.<br />
4.2.1 PCR<br />
Die Polymerasekettenreaktion basiert auf<br />
dem Einsatz von Oligonukleotidpaaren<br />
(Primer), die komplementär sind zu<br />
Sequenzen des nachzuweisenden Gens.<br />
Ein Primer hat die komplementäre<br />
Sequenz zu einem Abschnitt auf dem<br />
kodierenden und der andere Primer jene<br />
zu einem Abschnitt auf dem nichtkodierenden<br />
DNA-Strang. Der von den<br />
Primern begrenzte Bereich wird<br />
amplifiziert durch eine temperaturstabile<br />
DNA-Polymerase (z.B. Taq<br />
Polymerase).<br />
Der Reaktionsansatz für die PCR enthält<br />
neben den Primern und der<br />
temperaturstabilen DNA-Polymerase<br />
natürlich DNA (Template) aus jenem<br />
Organismus, der auf die Präsenz eines<br />
bestimmten Gens geprüft werden soll.<br />
Für die Amplifikation sind auch noch<br />
alle vier Triphosphate notwendig sowie<br />
ein Puffer der auch Magnesiumionen<br />
enthält.<br />
Die PCR wird in sogenannte Zyklen<br />
eingeteilt. Jeder Zyklus besteht aus<br />
einer Denaturierungsphase –<br />
aufschmelzen der dsDNA in<br />
Einzelstränge<br />
einer Annealingphase - Primer binden an<br />
die komplementäre Sequenz auf den<br />
Einzelsträngen der DNA<br />
einer Elongationsphase – die<br />
Polymerase synthetisiert den<br />
komplementären Strang ausgehend vom<br />
gebundenen<br />
Primer<br />
Ab dem 3. Zyklus entstehen Fragmente,<br />
die genau der Länge des zu<br />
amplifizierenden Bereichs entsprechen<br />
(siehe Abbildung 1). Diese Fragmente<br />
werden in den darauf folgenden PCR-<br />
Zyklen exponentiell vermehrt.<br />
9
4.2.1 Die PCR-Primer<br />
Virulenzgen fimH (Nachweis des Type 1 Pili-Adhesins);<br />
Primer fimH f+r Produkt 508 bp<br />
Virulenzgene papEF (Nachweis dieser Gene des P Pili-Genclusters);<br />
Primer papEF f+r Produkt 336 bp<br />
Virulenzgene sfa/focDE (Nachweis dieser Gene des S Pili-Genclusters);<br />
Primer sfa 1+2 Produkt 410 bp<br />
Virulenzgen hlyA (Nachweis dieses Gens als Teil des α-Hämolysinsgenclusters);<br />
Primer hly f+r Produkt 1177 bp<br />
Virulenzgen fyuA (Nachweis des Gens für den OM-Rezeptor des Yersiniabaktin-<br />
Eisenaufnahme-Systems);<br />
Primer fyuA f+r Produkt 880 bp<br />
4.2.2 Bakterienstämme zur Prüfung auf die Präsenz von Virulenzgenen:<br />
E. coli Stämme: AAEC189, Nissle1917, 536, CFT073, NU14<br />
S. typhimurium Stamm SL1344<br />
4.2.3 Bedingungen für den Nachweis der Virulenzgene sind wie folgt:<br />
Die PCR wird in einem 25µl-Ansatz mit einer Primer-Konzentration von 0,6µM/25µl<br />
durchgeführt. Es wird der „REDTaqReadyMixPCR Reaction Mix With MgCl 2 “ von<br />
SIGMA (www.sigmaaldrich.com) verwendet. In diesem Mix sind die dNTPs (dATP, dCTP,<br />
dGTP, dTTP), die Taq DNA Polymerase, der Reaktionspuffer (Tris-HCl, KCl, MgCl 2 ) und<br />
ein 2x konzentrierter Ladepuffer enthalten. Es wird also ein „MasterMix“ aus Wasser,<br />
Primern und der REDTaq-Mix hergestellt und die Templates (je 2µl der in 100µl<br />
aufgekochten Kolonien der Kontrollstämme) zugegeben.<br />
10
So können die Vorbereitungszeit verkürzt und das Kontaminationsrisiko mehrerer<br />
Pipettierschritte minimiert werden.<br />
Protokoll für die PCR-Reaktion:<br />
-Aufheizen der Proben auf 95°C für 10 Min.<br />
-30 Zyklen: Denaturierung 95°C 30 Sek., Annealing 63°C 30 Sek, Elongation 72°C 90 Sek.<br />
-Fertigstellen der begonnenen Amplifikate 72°C 5 Min.<br />
-Kühlen der Proben bei 8°C<br />
Vor der Elektrophorese: kühlen der Proben im Kühlschrank oder Lagerung bei -20°C.<br />
Nach der PCR-Reaktion können für die Elektrophorese jeweils 10µl des Produktes direkt auf<br />
ein 2%iges Agarose-Gel aufgetragen werden. Für dieses Gel werden 3g Agarose in 150ml 1x<br />
TAE-Puffer (Tris-Acetat, EDTA) aufgekocht und in einer Gießvorrichtung, mit zwei<br />
Kämmen für jeweils 20 Taschen, gegossen. Um die Größe der Produkte bestimmen zu können<br />
wird ein 100bp-DNA-Marker (Fa.Biolabs; siehe Anhang) mit aufgetragen.<br />
Die Elektrophorese wird für ca. eine Stunde bei 160V durchgeführt. Als Elektrophoresepuffer<br />
dient wieder 1xTAE-Puffer. Danach wird das Gel in einem Ethidiumbromid-Bad (0,1 %) für<br />
ca. eine halbe Stunde gefärbt und danach überschüssiges EtBr im Wasserbad entfernt. Mit<br />
Hilfe einer UV-Lampe kann nun das EtBr, das zwischen die Basen der amplifizierten DNA<br />
interkaliert, sichtbar gemacht werden.<br />
4.3 Funktionaler Nachweis von Virulenzfaktoren<br />
4.3.1 Nachweis der Adhärenz an humane Harnblasenepithelzellen<br />
4.3.1.1 Lichtmikroskopischer Nachweis der Adhärenz nach Giemsa-Färbung<br />
In „Chamber Slides“ werden T24 Zellen ausgesät und über Nacht (=24h) inkubiert (wird vom<br />
Assistenten ausgeführt).<br />
Zur Durchführung des Experiments erhält jede Gruppe einen Objektträger mit 4<br />
Inkubationskammern („Chamber Slides“).<br />
11
Abbildung 2: Fotos von<br />
„Chamber Slides“ mit<br />
zwei bzw. acht<br />
„Chambers“.<br />
Die Bakterienstämme (Citrobacter freundii Stamm 3009, Escherichia coli K-12 Stamm<br />
MG1655) werden in LB über Nacht kultiviert (Wird vom Assistenten durchgeführt). Am<br />
nächsten Morgen werden je 2ml LB-Medium mit 20µl 3009 bzw. 20 µl MG1655<br />
Übernachtkultur angeimpft und für 2h unter Schütteln bei 37 o C inkubiert. Danach sollten die<br />
Bakterienkulturen eine A 600 = 0,4 bis 0,6 erreicht haben. Dies entspricht dem Beginn der<br />
logarithmischen Wachstumsphase. Von den Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase<br />
wird je 1ml einer Verdünnung angelegt, die einer A 600 = 0,1 entspricht. Von der 3009 und der<br />
MG1655 Verdünnung werden je 8µl in die entsprechend beschrifteten Inkubationskammern<br />
(Gruppen-Nr. mit Bleistift auf angerautem Teil des Objektträgers; im Protokoll<br />
Schemazeichnung zur Identifizierung wo welcher Bakterienstamm zugesetzt wurde) mit den<br />
T24 Zellen gegeben. Eine homogene Durchmischung wird durch mehrmaliges auf- und abpipettieren<br />
erreicht. Bitte dabei nicht den Boden der Kavität berühren. Dort befindet sich der<br />
empfindliche einschichtige Epithelzellrasen. Anschließend wird für mindestens 2h im CO 2 -<br />
Inkubator inkubiert.<br />
12
Die infizierten Epithelzellen werden 3x mit je 200 µl durch mehrmaliges auf- und abpipettieren<br />
gewaschen. Nach entfernen des „Chamber“-Aufbaues wird das Präparat durch<br />
eintauchen in Methanol (Küvette) bei RT für 20 Min. fixiert.<br />
Vom fixierten Präparat wird das Methanol durch Aufsetzen des Objekträgers mit der<br />
Längskante auf ein Fliespapier weitestgehend entfernt.<br />
Jetzt erfolgt die Färbung nach Überführen der gekenzeichneten Objektträger in die Küvetten,<br />
die 80ml Giemsa-Lösung enthalten. Die Objektträger verbleiben in der Färbelösung für 5<br />
Min..<br />
Anschließend werden die Objektträger unter fließendem H 2 O abgespült und luftgetrocknet.<br />
Die gefärbten und getrockneten Präparate können mit dem 40x- oder 100x-Objektiv und unter<br />
Zuhilfenahme von Immersionsöl inspiziert werden.<br />
Charakteristische Bereiche des Präparats mit 3009 und jenem mit MG1655 werden<br />
fotografiert und für die Dokumentation der Ergebnisse verwendet. Protokollieren sie das<br />
Ergebnis. Welcher Stamm ist wohl der <strong>pathogene</strong> und welcher der a<strong>pathogene</strong> Stamm?<br />
4.3.1.2 Quantitative Bestimmung der bakteriellen Adhärenz<br />
1) 2ml Medium werden mit der geeigneten Menge (20µl 3009 bzw. 50 µl MG1655) ÜNK<br />
angeimpft, sodass die Kultur nach 2h eine A 600 = 0,4 bis 0,6 erreicht hat<br />
2) Bestimmung der A 600<br />
3) Verdünnen der Kultur auf A 600 = 0,1<br />
4) Pro Kavität einer 24-Kavitätenplatte werden 25µl der verdünnten 2h -Bakterienkultur<br />
zugesetzt, gemischt und für 2 h im CO 2 Inkubator bebrütet<br />
5) 5 x waschen der infizierten Zellrasen mit EBSS<br />
8) Lyse der Epithelzellen mit 0,1 % Triton X-100 durch schütteln für 10 min.<br />
13
9) Bestimmung der Anzahl Epithelzell-assoziierter Bakterien durch ausplattieren geeigneter<br />
Verdünnungen (je 2 x 100 µl einer 1:100 Verdünnung von C. freundii 3009 bzw. 2 x 100 µl<br />
unverdünntes Zelllysat vom Ansatz mit E. coli MG1655)<br />
4.3.2 Nachweis der Typ 1 Pili<br />
Fimbrien/Pili die Mannosereste binden gehören zu den Typ 1 Pili. Dieser Adhäsintyp ist bei<br />
nahezu allen Spezies der Enterobakterienfamilie vorhanden. Der Nachweis der Expression<br />
von Typ 1 Pili erfolgt mittels der Mannose-sensitiven Hefeagglutination. Zellen von<br />
Saccharomyces cerevisiae tragen sehr viele Mannosereste an ihrer Oberfläche. Typ 1 Pili<br />
exprimierende Bakterienzellen agglutinieren daher Hefezellen in Suspension sehr effizient.<br />
Werden jedoch Bakterien- und Hefe-Zellen in Gegenwart von 100mM Mannose (Stamm-<br />
Lösung 300 mM) gemischt erfolgt keine Agglutination, da die in Lösung befindlichen<br />
Mannosemoleküle an FimH (das adhäsive Molekül der Typ 1 Pili) binden und damit eine<br />
Bindung an die Mannosereste auf den Hefezellen blockiert wird.<br />
Die Hefeagglutination zur Prüfung auf Typ 1 Pili wird durchgeführt indem (Ansatz A) 7 µl<br />
einer Hefesuspenion (0,2 g Bäckerhefe in 10 ml 0,9 % NaCl suspendiert) und 7 µl Wasser mit<br />
7 µl einer Übernachtkultur der zu testenden Bakterien (ÜNK) auf einem Objektträger<br />
gemischt werden. Parallel dazu werden (Ansatz B) 10 µl Hefesuspension mit 10 µl 100 mM<br />
Mannoselösung und 7 µl derselben Bakterienkultur gemischt. Erfolgt eine Agglutination der<br />
Hefezellen nur im Ansatz ohne Mannose wurde der Nachweis der Typ 1 Piliexpression im<br />
Bakterienteststamm geführt.<br />
Dieser Test wird für die Bakterienstämme E. coli AAEC189, EcN, 536, CFT073, NU14 und<br />
S. typhimurium SL1344 durchgeführt.<br />
Schema zur Durchführung der Mannose-sensitiven Hefeagglutination<br />
Ansatz A<br />
Ansatz B<br />
7 µl ÜNK 7 µl ÜNK<br />
7µl Wasser 7 µl 100 mM Mannoselösung in Wasser<br />
7 µl Hefesuspension 7 µl Hefesuspension<br />
14
4.3.3 Nachweis von Hämolysin durch Hämolyse<br />
Proteintoxine, die Erythozyten lysieren werden als Hämolysine bezeichnet. Der Nachweis der<br />
hämolytischen Aktivität kann durch Kultivierung der Testbakterien auf Blutagarplatten<br />
erbracht werden. Bakterien die Hämolysin sekretieren sind durch klare Lysehöfe<br />
ausgezeichnet, die die Bakterienkolonie umgeben.<br />
Zur Prüfung der Bakerienstämme E. coli AAEC189, EcN, 536, CFT073, NU14 und S.<br />
typhimurium SL1344 auf Hämolysinproduktion werden jeweils 5 µl einer Übernachtkultur auf<br />
die Blutagarplatte transferiert und zwar in einen von jeweils 6 Sektoren. Zuvor wird die<br />
Blutagarplatte in 6 gleichgroße Sektoren („Tortenstücke“) eingeteilt, die mit den Kürzeln für<br />
die Testbakterien markiert wurden.<br />
Nach Inkubation über Nacht bei 37 o C im Brutschrank können die Hämolysinsproduzenten<br />
identifiziert werden.<br />
4.3.4 Nachweis der Cytotoxizität von Hämolysin für humane Harnblasenepithelzellen<br />
Konfluente T24-Zellrasen wurden erhalten durch Aussäen von T24-Zellen 24h vor<br />
Versuchsbeginn (Wird von dem Assistenten vorgenommen).<br />
Die Bakterienstämme (E. coli 536 und die isogene nicht-hämolytische Mutante 536dh, E. coli<br />
K-12 MG1655 und E. coli Nissle 1917 = EcN) werden über Nacht in LB kultiviert. Am<br />
nächsten Morgen werden je 2 ml LB-Medium mit 20 µl 536, 15 µl EcN bzw. 20 µl MG1655<br />
Übernachtkultur angeimpft und für 2 h unter Schütteln bei 37 o C inkubiert. Danach sollten die<br />
Bakterienkulturen eine A 600 = 0,4 bis 0,6 erreicht haben. Dies entspricht dem Beginn der<br />
logarithmischen Wachstumsphase. Von den Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase<br />
wird je 1ml einer Verdünnung angelegt, die einer A 600 = 0,1 entspricht.<br />
Davon werden anschließend in jede auf den Objektträgern aufgebrachte Kavität mit T24-<br />
Zellen 8 µl gegeben und 1,5 h im CO 2 -Inkubator bebrütet.<br />
Nach der 2 h Inkubation der infizierten Epithelzellen wird der Überstand über den Zellrasen<br />
entfernt, mit je 200µl EBSS pro Kavität der Zellrasen mindestens dreimal gewaschen und der<br />
Kammeraufbau abgenommen. Die Objektträger mit den Zellrasen werden dann für 20<br />
Minuten in Methanol getaucht und somit fixiert. Nach 20 Minuten werden die Objektträger<br />
aus dem Methanol genommen, übriges Methanol vorsichtig durch Tupfen entfernt und für<br />
fünf Minuten in Giemsa-Lösung getaucht. Nach diesen fünf Minuten werden die Objektträger<br />
15
aus der Giemsa-Lösung genommen und unter fließendem Wasser von der restlichen Giemsa-<br />
Lösung befreit. Anschließend lässt man die Objektträger an der Luft trocknen.<br />
Wenn die Objektträger getrocknet sind, kann man die Präparate unter dem Mikroskop<br />
betrachten. Hierzu eignet sich am besten eine 20-fache Vergrößerung.<br />
4.3.5 Nachweis der Cytotoxizität mittels Propidium-Iodid-Färbung<br />
Alternativ kann die Cytotoxizität wie folgt nachgewiesen werden. Dazu werden<br />
Epithelzellrasen wie zuvor beschrieben mit Bakterien infiziert. Dann wird nach der 1,5 h<br />
Inkubation der infizierten Epithelzellen der Überstand über den Zellrasen entfernt, mit je<br />
200µl EBSS pro Kavität der Zellrasen mindestens dreimal gewaschen. Nach restlosem<br />
Absaugen des EBSS werden die Kavitäten der Objektträger mit Propidiumiodid-Lösung<br />
(2µg/ml Propidiumiodid gelöst in dest. H 2 O) gefüllt (Vorsicht: Propidiumiodid ist giftig und<br />
erbgutschädigend! Handschuhe tragen und Abzug benutzen!). Diese lässt man dann für<br />
mindestens 20 Minuten einwirken. Hierzu werden die Objektträger mit einem Tuch<br />
abgedeckt. Nach diesen 20 Minuten werden die Objektträger mit destilliertem Wasser von<br />
überschüssiger Propidiumiodid-Lösung befreit.<br />
Wenn die Objektträger getrocknet sind, kann man die Präparate unter dem Mikroskop<br />
betrachten. Hierzu eignet sich am besten eine 10-fache Vergrößerung ohne Öl.<br />
Propidiumiodid färbt nur die Kerne jener Zellen an, die tot sind. Die Färbung erfolgt durch<br />
Interkalation in DNA und zwar von einem Molekül Propidiumiodid pro 4-5 Basen.<br />
Propidiumiodid bindet aber auch an RNA.<br />
16
4.3.6 Nachweis von Siderophoren (Fe 3+ -Chelatoren)<br />
Eine schnelle Möglichkeit, um generell Siderophorexpression nachweisen zu können, ist die<br />
Inkubation von Bakterienstämmen auf CAS-Indikatorplatten. Das Prinzip dieser Indikator-<br />
Agarplatten beruht auf der Komplexierung von freien Fe(III)-Ionen im Agar. Der ternäre<br />
Komplex aus Chromazurol S/Fe(III)/Hexadecyltrimethylammoniumbromid hat eine tiefblaue<br />
Farbe. Wird eine CAS-Indikator-Agarplatte mit Bakterien beimpft, die in der Lage sind,<br />
Siderophore zu produzieren und in das umgebende Medium zu sezernieren, können diese<br />
Siderophore die Fe(III)-Ionen aus dem Chromazurol S-/HDTMA-Komplex herauslösen.<br />
Dadurch verändert sich die Farbe des Farbstoffes Chromazurol S von tiefblau nach gelb.<br />
Bakterienkolonien, die Siderophore sezernieren, weisen dadurch einen gelblichen Hof auf, der<br />
einfach vom blauen Agar mit noch immer komplexiertem Eisen unterschieden werden kann.<br />
4.4 Wirkungsweisen des probiotischen E. coli Stammes EcN<br />
4.4.1 Verdrängung <strong>pathogene</strong>r Bakterien während Kokultivierung<br />
Wie bei allen Probiotika so ist auch beim EcN die Wirkungsweise noch nahezu ungeklärt.<br />
Erklärungsmöglichkeiten für den Schutz des Wirtes durch EcN vor bakteriellen Infektionen,<br />
z.B. einer Salmonella-Infektion, könnte die Produktion von bakteriziden Substanzen durch<br />
EcN sein. Es konnte gezeigt werden, dass EcN tatsächlich zwei Microcine synthetisiert und<br />
sekretiert. Diese sind auch in der Lage Salmonella abzutöten. Der Nachweis dazu kann in<br />
einem Cokultivierungsexperiment geführt werden.<br />
Durchführung des Experiments<br />
Die Bakterienstämme (S. typhimurium SL1344, E. coli Nissle 1917 = EcN, SK22D = isogene,<br />
micorzin-negative EcN-Mutante) werden über Nacht in DMEM kultiviert. Am nächsten<br />
Morgen werden 3ml DMEM-Medium in Röhrchen mit 25µl SL1344, 25µl SL1344 und 15µl<br />
EcN, 25 µl SL1344 und 15µl SK22D, 15µl EcN bzw. 15µl SK22D angeimpft und unter<br />
Schütteln bei 37°C inkubiert.<br />
Jeweils nach einer Stunde wird von den jeweiligen Kulturen die OD 600 bestimmt und eine<br />
geeignete Verdünnung zur CFU-Bestimmung ausplattiert. SL1344 als Einzelkultur wird auf<br />
LB-Streptomycin-Agar-Platten ausplattiert. Die Cokultivierung von SL1344 und EcN bzw.<br />
17
SL1344 und SK22D werden auf LB-Agar-Platten mit 50µg/ml Streptomycin ausplattiert, um<br />
die Anzahl der Salmonellen in der Cokultur zu erhalten. Außerdem werden die Cokulturen<br />
noch auf MacConkey-Platten ausplattiert, da man auf diesen Platten leicht zwischen E. coli<br />
(rote Kolonien) und Salmonellen (weiße Kolonien) unterscheiden kann. Die Kontrollen EcN<br />
als Einzelkultur bzw. SK22D als Einzelkultur werden auf LB-Agar-Platten ausplattiert.<br />
4.4.2 Antiinvasiver Effekt<br />
Der probiotische E. coli Stamm Nissle 1917 kann gnotobiotische Ferkel vor einer Salmonella-<br />
Infektion schützen. Ein wesentlicher Virulenzfaktor von <strong>pathogene</strong>n Salmonellen ist deren<br />
Fähigkeit in Wirts(epithel)zellen einzudringen (Invasivität). Die Invasivität ist auf der<br />
Pathogenitätsinsel 1 (SPI1) von mehr als 30 Genen kodiert. Die für die Invasivität<br />
verantwortlichen Effektoren werden mittels eines Typ 3 Sekretionssystems (TTSS) in die<br />
Wirtzellen injiziert.<br />
Eine mögliche Erklärung für die genannte protektive Wirkung des EcN könnte die Fähigkeit<br />
des EcN sein, die Invasivität der Salmonellen zu inhibieren. Dies konnte von uns tatsächlich<br />
in vitro gezeigt werden (Altenhoefer et al., 2004).<br />
Zusammenfassung des Experiments zur Quantifizierung der bakteriellen Invasivität<br />
Zu einschichtigen, konfluenten Zellrasen aus humanen Epithelzellen werden ~30 Bakterien<br />
aus dem Anfang der logarithmischen Wachstumsphase pro Epithelzelle gegeben. Während<br />
der folgenden Inkubation können die Bakterien in die Epithelzellen eindringen. Danach<br />
werden die Zellrasen gewaschen und frisches, vorgewärmtes Zellkulturmedium zugesetzt, das<br />
100µg/ml Gentamycin enthält. Dieses Antibiotikum dringt nicht in die Epithelzellen ein und<br />
tötet daher während der folgenden Inkubation nur die extrazellulär verbliebenen Bakterien ab.<br />
Die intrazellulären Bakterien werden durch Lyse der Epithelzellen freigesetzt und durch<br />
Ausplattieren geeigneter Verdünnungen ihre Zahl bestimmt. Mit der eingesetzten<br />
Bakterienzahl zu Beginn des Experiments läßt sich der Prozentsatz des Inokulums berechnen,<br />
der in die Epithelzellen internalisiert wurde. Ebenso kann die Anzahl der intrazellulären<br />
Bakterien pro Epithelzelle ermittelt werden, wenn die Zahl der Epithelzellen pro Kavität<br />
bestimmt wurde.<br />
18
Durchführung des Experiments<br />
Konfluente T84-Zellrasen wurden erhalten durch Aussäen von T84-Zellen 24h vor<br />
Versuchsbeginn in 24-Kavitäten-Platten (Wird von dem Assistenten vorgenommen).<br />
Das Prinzip des Invasionsassys<br />
Gentamicin-Protektions-Assay<br />
1. Zugabe der Bakterien zum konfluenten Epithelzellrasen<br />
2. Inkubation für 2-4h<br />
3. Abtöten der extrazellulären Bakterien mit 100µg/ml<br />
Gentamicin während 1 h<br />
4. Freisetzen der intrazellulären Bakterien durch Lyse der<br />
eukaryotischen Zellen<br />
5. Bestimmung der Anzahl der intrazellulären Bakterien durch<br />
Ausplattieren<br />
Schema zur Beimpfung der 24 Kavitätenplatte<br />
SL1344<br />
(12,5 µl)<br />
SL1344<br />
(12,5 µl)<br />
SL (12,5 µl)<br />
+ MG (100<br />
µl)<br />
SL (12,5 µl)<br />
+ MG (100<br />
µl)<br />
EcN<br />
(100 µl)<br />
EcN<br />
(100 µl)<br />
SK22D<br />
(100 µl)<br />
SK22D<br />
(100 µl)<br />
MG1655<br />
(100 µl)<br />
MG1655<br />
(100 µl)<br />
SL (12,5 µl)<br />
+ EcN (100<br />
µl)<br />
SL (12,5<br />
µl)+ EcN<br />
(100 µl)<br />
SL (12,5 µl)<br />
+ SK (100<br />
µl)<br />
SL (12,5 µl)<br />
+ SK (100<br />
µl)<br />
20
Die Bakterienstämme (Salmonella enterica serovar Typhimurium Stamm SL1344, E. coli K-<br />
12 Stamm MG1655, EcN, SK22D) werden in DMEM über Nacht kultiviert (d.h. müssen am<br />
Tag zuvor angesetzt werden). Am nächsten Morgen werden je 2ml DMEM-Medium mit 25µl<br />
SL1344, 15 µl EcN und SK22D bzw. 20 µl MG1655 Übernachtkultur angeimpft und für 2 h<br />
unter Schütteln bei 37 o C inkubiert. Danach sollten die Bakterienkulturen eine A 600 = 0,4 bis<br />
0,6 errreicht haben. Dies entspricht dem Beginn der logarithmischen Wachstumsphase. Von<br />
den Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase wird je 1ml einer Verdünnung<br />
angelegt, die einer A 600 = 0,1 entspricht.<br />
Davon werden anschließend in jeweils zwei Kavitäten mit T84-Zellen nur 12,5µl SL1344, nur<br />
100 µl EcN, nur SK22D oder nur MG1655 gegeben (Siehe Schema zur Beimpfung der 24<br />
Kavitätenplatte). Zudem werden je 2 Kavitäten entweder mit SL1344 + EcN, SL1344 +<br />
SK22D oder SL1344 + MG1655 beimpft (Siehe Schema zur Beimpfung der 24<br />
Kavitätenplatte). Die 24-Kavitätenplatten mit den infizierten Epithelzellen werden dann für 3<br />
min auf dem Schütteltisch gemischt und für mindestens 2 h im CO 2 -Inkubator bebrütet.<br />
Während dieser Inkubationsperiode werden von den verdünnten Bakterienkulturen<br />
(eingestellt auf eine A 600 = 0,1) jeweils 2x100µl einer 1:10 5 Verdünnung ausplattiert, um die<br />
im Experiment eingesetzte Bakterienzahl (= Inokulumsgröße) berechnen zu können<br />
(Markieren Sie diese Platten mit CFU). Außerdem wird das Gentamycin-haltige Medium auf<br />
37 o C vorgewärmt.<br />
Nach der Inkubation der infizierten Epithelzellen wird der Überstand über den Zellrasen<br />
entfernt, mit 1ml EBSS pro Kavität der Zellrasen gewaschen und je 1ml frisches, auf 37 o C<br />
vorgewärmtes Medium, das 100µg/ml Gentamycin enthält, zupipettiert. Gentamycin tötet<br />
während der anschließenden 1-stündigen Inkubationsperiode nur die extrazellulären Bakterien<br />
ab.<br />
Um das Gentamycin zu entfernen wird der Überstand abgesaugt und die Zellrasen 2x mit je<br />
1ml EBSS pro Kavität gewaschen. Die Freisetzung der intrazellulären Bakterien erfolgt durch<br />
Schütteln mit je 1ml 0,1 % Triton X-100 in entionisiertem, sterilem Wasser für 15 Min. bei<br />
RT.<br />
Die Bakteriensuspension in den Kavitäten mit SL1344 werden jeweils 1:10 verdünnt und<br />
davon 100µl auf eine LB-Platte mit Streptomycin oder einer MacConkey-Agarplatte<br />
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ausplattiert. Von den übrigen Bakteriensuspensionen werden je 100µl unverdünnt ausplattiert.<br />
Nach Inkubation der Platten über Nacht können die Kolonien ausgezählt und die<br />
Invasionsrate bestimmt werden.<br />
22