F1- Praktikum Mikrobiologie Block N: Molekulare mikrobielle Ökologie

F1- Praktikum Mikrobiologie
Block N: Molekulare mikrobielle Ökologie
12.03 - 16.03.2007
Beginn: 9:00 Uhr
Röntgenring 11
PD Dr. Ute Hentschel
ute.hentschel@mail.uni-wuerzburg.de
wissenschaftl. Assistenz:
Christine Gernert
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Verhalten im Labor
Die Laboratorien am Institut für Molekulare Infektionsbiologie fallen unter die
Sicherheitsstufe 2 (GenTSV, BiostoffV).
Folgende Sicherheitsmaßnahmen sind zu beachten und strikt einzuhalten:
1.1 Zutrittsregelung:
Die den S2-Bereich begrenzenden Türen müssen geschlossen gehalten werden
Personen unter 18 Jahren dürfen in den Laboratorien nicht arbeiten
1.2 Belehrung:
Nur Personen, die belehrt wurden, dürfen im Labor arbeiten. Die Belehrung ist zu
dokumentieren.
1.3 Sicherheitsanweisungen:
Im Laborbereich sind Laborkittel zu tragen. Laborkittel müssen im Laborbereich
verbleiben.
Informieren Sie sich über die Lage der nächstgelegenen Sicherheitseinrichtungen
wie Feuerlöscher, Notdusche, Augendusche, Verbandskasten.
Verletzungen sind dem Betreuer umgehend zu melden.
Es ist verboten mit dem Mund zu pipettieren.
Es ist verboten im Laborbereich zu essen, zu trinken, zu rauchen oder zu schnupfen,
Kosmetika anzuwenden.
Verboten ist die Lagerung von Lebensmitteln, Getränken, Rauchwaren oder
Kosmetika im Laborbereich.
Türen und Fenster müssen während der Arbeiten geschlossen sein.
Arbeitsflächen vor und nach der Arbeit desinfizieren (70 % EtOH).
Die „Eppendorf“-Zentrifugen sind täglich zu desinfizieren (70% EtOH).
Offene Gefäße dürfen nicht zentrifugiert werden (Aerosolgefahr).
Vor dem Verlassen des Labors sind die Hände zuerst zu desinfizieren, dann zu
waschen und können anschließend mit einer Handcreme rückgefettet werden.
Im Zweifelsfall wenden Sie sich bitte an die Laborbetreuer oder Tischassistenten.
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Molekulare Methoden zur Untersuchung der mikrobiellen Ökologie und
Biodiversität
In diesem Praktikum werden moderne Methoden der mikrobiellen Ökologie
anhand von zwei Modellsystemen eingeführt. Zum Einen handelt es sich um das
Süsswasserbakterium Legionella pneumophila, welches als humanpathogener
Erreger die ‚Legionärs-Krankheit‘ auslösen kann. Zum Anderen werden wir uns mit
marinen Bakterien befassen, die in Biozönose mit tropischen Schwämmen leben.
Das Methodenspektrum umfasst den klassischen Ansatz der Kultivierung/ Isolierung
von Mikroorganismen, sowie molekulare Methoden, die auf der 16S rDNA Gen
Sequenzanalyse basieren und die speziell für die Erfassung von nicht-kultivierbaren
Mikroorganismen konzipiert sind. Das folgende Schema fasst die gängigsten
Methoden zusammen:
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Im Rahmen dieses F1 Praktikums werden Sie sich mit folgenden Methoden vertraut
machen:
1. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
Mit dieser grundlegenden Methode werden bestimmte Sequenzabschnitte der DNA,
wie z.B. das 16S rDNA Gen, vervielfältigt und somit für weiterführende Experimente
(Klonierung, Sequenzierung, phylogenetische Bestimmung) nutzbar gemacht.
2. Kultivierung und Isolierung von Mikroorganismen aus der Umwelt
Mikroorganismen, insbesondere Legionellen, sollen aus Umweltproben isoliert und
kultiviert werden. Antibiotikaresistenzprofile von ausgewählten Bakterien werden
mittels des Plättchenassays und des MHK-Assays bestimmt. Antimikrobielle
Aktivitäten von Umweltbakterien werden mittels des Softagar-Overlay Assays
identifiziert.
3. Quantifizierung von Bakterien in einer Umweltprobe und Mikroskopie
Nach Anfärbung einer Umweltprobe mit dem Nukleinsäurefarbstoff DAPI werden
Bakterien unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ausgezählt. Nach Abgleich mit den
entsprechenden cfu-Werten wird der prozentuale Anteil der kultivierbaren Fraktion
bestimmt.
4. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) (kultivierungsunabhängig!)
Unter Einsatz von fluoreszenz- markierten Oligonukleotid Sonden, die gegen die 16S
rRNA gerichtet sind, lassen sich einzelne Bakterien oder Bakteriengruppen in einer
Originalprobe visuell nachweisen.
5. Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese (kultivierungsunabhängig!)
Ein Gel, welches einen denaturierenden Gradienten enthält, ermöglicht die
Auftrennung von verschiedenen 16S rDNA Gen Fragmenten basierend auf dem
Schmelzverhalten, welches wiederum sequenzabhängig ist. Ein Gemisch an 16S
rDNA Genen kann somit aufgetrennt werden.
6. Erstellung von 16S rDNA Genbanken (kultivierungsunabhängig!)
Mittels Klonierung wird ein Gemisch von 16S rDNA Genen von unkultivierbaren
Bakterien in einen kultivierbaren Organismus (z.B., E.coli) eingeschleust. Eine
Genbank repräsentiert im Idealfall die mikrobielle Vielfalt der respektiven
Umweltprobe.
7. RFLP-Analyse
Die RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism) ermöglicht eine
schnelle Abschätzung der Diversität innerhalb der positiven Klone. Sie wird
eingesetzt, um eine Redundanz in der sich anschliessenden Sequenzierung zu
reduzieren.
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Warum die 16S rRNA (bzw., das 16S rDNA Gen)?
Abbildung: 16S rRNA von E. coli
Der Vorteil der 16S rRNA für phylogenetische Analysen:
- ubiquitär vorkommend
- hohe Kopienzahl
- konservierte Bereiche und variable Bereiche
- sehr große Datenbank verfügbar (>70,000 Sequenzen in Genbank)
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Versuch 1: Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Ziel: Das Ziel der PCR besteht in der Vervielfältigung und Verfügbarmachung eines
ausgewählten DNA Sequenzabschnittes aus einem mikrobiellen Genom
Einleitung:
Die PCR (polymerase chain reaction) ist eine Methode zur Amplifikation einer
DNA- oder RNA-Sequenz, sodaß anschließend genügend Material zur Identifizierung
vorhanden ist. Sie ist eine einfache, schnelle, spezifische und empfindliche Methode,
die zum Nachweis bestimmter Organismen in Umweltproben oder Patientenmaterial
herangezogen werden kann. Sie ermöglicht 1.) den Nachweis von Organismen, die
nur in geringer Menge vorliegen; eine Zwischenzüchtung der Keime ist daher nicht
notwendig, 2.) den direkten Nachweis von pathogenen und nicht -pathogenen
Organismen, die sich nicht kultivieren lassen und 3.) den Nachweis von infektiösen
Erregern unabhängig von der serologischen Wirtsantwort.
Für die PCR wird ein spezifisches Oligonukleotid-Paar (Primer) eingesetzt, das zu
den 3´ bzw. 5´-Enden der zu amplifizierenden Sequenz (Template) komplementär ist.
Als Template kann einzel- oder doppelsträngige DNA verwendet werden. Wenn RNA
benutzt wird, muß diese zuvor in DNA revers transkribiert werden. Wenn ganze
Zellen benutzt werden, muß die genomische DNA durch Aufkochen erst freigesetzt
werden. Mit Hilfe einer hitzestabilen DNA-Polymerase (z. B. Taq-Polymerase aus
Thermophilus aquaticus, ein Bakterium, das in heißen Quellen bei 70 bis 75°C
wächst) werden komplementäre Nukleotide zunächst an die Primer und dann an die
wachsenden DNA-Stränge angehängt.
Jede PCR benötigt pro Zyklus 3 Schritte:
1. Hitzedenaturierung, wobei der Template-DNA-Doppelstrang getrennt wird.
Jeder DNA-Einzelstrang steht nun zur Hybridisierung mit komplementären
Sequenzen zur Verfügung.
2. Annealing des Primer-Paars: Anheften der Primer an die DNA-Einzelstränge.
3. Primer extension: Während dieses Schrittes dienen die Primer als
Startpunkte für die DNA-Polymerase, die mit Hilfe der zugegebenen Nukleotide
komplementäre DNA- Stränge synthetisiert.
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In der Regel werden 30 PCR-Zyklen durchgeführt. In jedem neuen Zyklus stehen
mehr Templates zur Verfügung, sodaß ein potentieller Anstieg der DNA-Kopien
erfolgt. Nach erfolgter PCR wird die Amplifikation der betreffenden Sequenz durch
Gelelektrophorese nachgewiesen.
Versuchsbeschreibung:
- DNA-Extraktion
- Jede Gruppe führt 12 PCR-Reaktionen durch (Dauer: 3 h Programmdurchlauf;
Einfrieren der Proben bei -20°C)
- Agarose-Gelelektrophorese
1. Chromosomale DNA- Extraktion
- 2ml ÜN- Kultur zentrifugieren, 4’, 8000rpm
- Überstand abkippen
- Pellet mit 1ml TNE waschen, zentrifugieren: 4’, 8000rpm
- Überstand abkippen
- Pellet sorgfältig in 270µl TNEX resuspendieren, dann 25µl Lysozym
(c=10mg/ml) dazugeben und vorsichtig mischen
- für 30 Minuten bei 37°C inkubieren
- 50µl Proteinase K (c=20mg/ml) dazugeben, vorsichtig mischen
- ca. 2h, bzw. bis die Lösung klar ist, bei 55°C inkubieren
- + 15µl 5M NaCl
- + 500µl eiskaltes 100%iges Ethanol
- vorsichtig durch Kippen mischen => DNA fällt aus
- 15’ bei 13000rpm zentrifugieren
- Überstand abkippen, vorsichtig!
- DNA- Pellet mit 70%igem Ethanol waschen, zentrifugieren, 10’, 13000rpm
- Überstand abkippen
- DNA- Pellet lufttrocknen lassen
- in 200µl H 2 0 aufnehmen
TNE- Puffer:
1ml Tris, 1M, pH 8.0
0,2ml NaCl, 5M
2ml EDTA, 0,5M, pH 8.0
ad. 100ml Millipore- H 2 0
TNEX- Puffer:
99ml TNE- Puffer
1ml Triton X-100
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2. Lysat-PCR Probenvorbereitung
a) Destilliertes, sterilfiltriertes Wasser (30 μl)
b) E. coli HB101-Suspension (30 μl)
c) E. coli HB101-Suspension (30 μl; 1: 10 verdünnt)
d) E. coli HB101-Suspension (30 μl; 1: 100 verdünnt)
e) E. coli HB101-Suspension (30 μl; 1: 1.000 verdünnt)
f) E. coli HB101-Suspension (30 μl; 1: 10.000 verdünnt)
Proben a) - f) in Eppendorfgefäß geben
10 min 100°C aufkochen, 5 min Eis (um die Zellen aufzubrechen)
dann das Zellysat in Eppendorfzentrifuge bei 5000 rpm 2 min zentrifugieren.
2. PCR-Reaktionen
In ein PCR-Cap (vorher beschriften) wird jeweils folgender Reaktionsansatz auf Eis
gegeben.
Lysat- PCR (Gesamtvolumen 6 x 50 μl):
5 μl Probe (a-f, siehe oben)
5 μl Reaktionspuffer (10x)
1 μl Primer 27f
1 μl Primer 1492r
1 μl dNTP´s
0.25 μl Taq-Polymerase
auf 50µl mit sterilem Wasser
DGGE-PCR (Vorbereitung für Experiment 6)
(Gesamtvolumen 3 x 50 μl, +Ko, -Ko, Schwamm):
1 μl Schwamm DNA
5 μl Reaktionspuffer (10x)
1 μl Primer DGGE primer 341f+GCclamp
1 μl Primer DGGE primer 534r
1 μl dNTP´s
0.25 μl Taq-Polymerase
auf 50µl mit sterilem Wasser
Klonier-PCR (Vorbereitung für Experiment 7)
(Gesamtvolumen 3 x 50 μl, +Ko, -Ko, Schwamm):
1 μl Schwamm DNA
5 μl Reaktionspuffer (10x)
1 μl Primer 27f
1 μl Primer 1492r
1 μl dNTP´s
0.25 μl Taq-Polymerase
auf 50µl mit sterilem Wasser
PCR-Programm in Biometra PCR-Maschine eingeben:
Initiale Denaturierung 2 min 95°C
30 Zyklen:
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1 min 95°C (Denaturieren)
1 min 54°C (Annealing)
1,5 min 72°C (Extension)
Finaler Elongationsschritt: 10 min 72°C
Nach Beendigung des Programms, Proben bei -20°C bis zur Gelelektrophorese
aufbewahren
3. Gelelektrophorese
Lysat PCR und Klonier PCR
Proben aus -20°C herausnehmen, 2 sec zentrifugieren
1 % Agarosegel in 1 x TAE gießen
Von jeder Probe 5 μl + 3 μl Probenpuffer in je 1 Tasche pipettieren.
1kb Marker DNA Leiter 10µl
Elektrophorese bei 150V für ca. 1h
Gel in EtBr-Bad färben (Handschuhe!!!), entfärben, unter UV-Licht auswerten,
photographieren.
Fragmente auswerten
DGGE PCR
Proben aus -20°C herausnehmen, 2 sec zentrifugieren
2 % (!) Agarosegel in 1 x TAE gießen
Von beiden Proben je 5 μl + 3 μl Probenpuffer in je 1 Tasche pipettieren.
1kb Marker DNA Leiter 10 µl
Elektrophorese bei 150V für ca. 1h
Gel in EtBr-Bad färben (Handschuhe!!!), entfärben, unter UV-Licht auswerten,
photographieren.
Fragmente auswerten
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Verbrauchsmaterial:
Proben (s.o.)
E. coli HB101-Kultur auf LB
Schwamm DNA
Reaktionspuffer
Nukleotide
Polymerase
Universelle bakterielle Primer 27f und 1492r
DGGE primer:
341f+ GCclamp (5´-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC
ACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 3´)
534r
(5´-ATTACCGCGGCTGCTGG-3´)
PCR-Cap (500 µl Volumen)
PCR-Gerät
Agarose Gel
1xTAE
1kb DNA Leiter (Grössenstandard)
Probenpuffer (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol, 15% Ficoll)
Elektrophoresekammern, Netzgeräte
EtBr-Bad (200 ml Wasser + 100ul EtBr 10 mg/ml), Schale, Handschuhe
Transilluminator, Photoeinrichtung
Literatur:
1. Jaulhac, B., M. Nowick, N. Bornstein, O. Meunier, G. Prevost, Y. Piemont, J.
Fleurett, H. Monteil. 1992. Detection of Legionella spp. in bronchoalveolar
lavage fluids by DNA amplification. J. Clin. Microbiol. 30:920-924.
2. Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S Stoffel, S. T. Schar, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B.
Mullis, H. A. Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with
a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491.
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Versuch 2: Isolierung von Bakterien aus Umweltproben
Ziel: Die gezielte Anreicherung von einem Organismus (Legionellen), von dem die
physiologischen Eigenschaften bekannt sind.
Einleitung:
Legionellen gehören zur Gruppe der nicht-fermentierenden, aeroben, Gramnegativen,
fakultativ intrazellulären Bakterien. Sie zeichnen sich durch ein duales
Wirtssystem aus und sind somit nicht nur als Umweltkeim sondern auch als
humanpathogene Erreger der Legionärs-Krankheit von Bedeutung. Die Legionellen-
Infektion erfolgt nicht von Mensch zu Mensch, sondern durch Inhalation von
keimhaltigen Aerosolen. Sie ist gekennzeichnet durch Fieber, trockenen Husten und
Entzündungsreaktionen in der Lunge. Untersuchungen zur Verbreitung von
Legionellen haben gezeigt, daß diese Bakterien in natürlichen See- oder
Flußstandorten in geringer Konzentration vorkommen. In technischen
Wassersystemen wie z.B. in Klimaanlagen, Luftbefeuchtern, Duschen und
Kühltürmen kann es jedoch unter bestimmten Bedingungen zu gefährlichen
Massenvermehrungen mit bis zu 10 6 Keimen pro Liter kommen. Die Assoziation mit
im Wasser lebenden Protozoen spielt bei der Vermehrung der Legionellen eine
entscheidende Rolle. Die Legionellen sind in der Lage verschiedene
Protozoenspezies zu infizieren und sich intrazellulär zu vermehren. Die Einzellerwirte
mit der häufigsten Verbreitung sind Acanthamoeben und Hartmannellen. Die
Legionellen werden je nach Wirt durch verschiedene Mechanismen (Phagozytose,
Rezeptor-vermittelte Endozytose) aufgenommen. Innerhalb der Wirtszelle wird ein
Endosom gebildet, das in seiner Reifung von den Legionellen beeinflußt wird. Neben
der Inhibierung der Lysosomenfusion und der reduzierten Endosomenansäuerung
werden Wirtsorganellen (Vesikel, Ribosomen und ER) an das Legionellen-haltige
Endosom angelagert. Diese in Amöben „gelernten“ Mechanismen ermöglichen es
den Legionellen auch menschliche Alveolarmakrophagen zu infizieren.
Die Kultivierung von Legionellen erfolgt auf einem Spezialnährboden, der neben
Aktivkohle und Hefeextrakt auch L-Cystein, Fe-Salze und α-Ketoglutarat beinhaltet.
Zur Gewinnung von Legionella-Reinkulturen aus dem Wasser muß jedoch die
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Begleitflora eliminiert werden. Durch Zusatz von Antibiotika zu den Nährböden z.B.
Vancomycin und Polymyxin B können die meisten Gram-positiven Bakterien
(Staphylokokken, Enterokokken) und Gram-negativen Bakterien (Polymyxin B,
insbesondere Pseudomonas) in ihrem Wachstum gehemmt werden. Als einen
weiteren Selektionsmechanismus macht man sich die Toleranz der Legionellen
gegen niedrige pH-Werte zu Nutze (pH 2.2).
Das Wachstumsoptimum der Legionellen liegt bei 37°C mit 5% CO 2 -Begasung. Die
Legionellen erscheinen nach 2-3 tägiger Bebrütung als weiß-bläulich gefärbte
Kolonien auf den BCYE-Agarplatten. Mikroskopisch erscheinen die Legionellen als
nicht filamentöse, monopolar begeißelte, Stäbchen. Einige Legionella-Spezies sind in
der Lage, hämolytisch aktive Proteine zu synthetisieren, die humane Erythrozyten
lysieren. Ein weiteres Erkennungsmerkmal ist die Sekretion eines braunen Pigments
in der stationären Wachstumsphase.
Versuchsbeschreibung:
- Isolierung von Legionellen aus Mainwasser durch Filtration und
Säurewaschung
- Auswertung der kultivierbaren mikrobiellen Diversität
- Antibiotikaresistenzassay zur Überprüfung des Resistenzprofils
- Hemmhofassays zur Identifizierung von Keimen mit antimikrobieller Aktivität
2.1 Isolierung von Legionellen aus der Umwelt
Filtration (am Montag)
Es werden verschiedene Wasserproben verwendet. Von jeder Probe (+ eine
Positivkontrolle) werden 100 ml durch einen vorgeweichten Bakterienfilter
(Porengröße 0,2 um) unter Vakuum filtriert. Die Bakterien werden aufgrund der
Porengröße der Membran auf dem Filter zurückgehalten. Die ersten Filter werden auf
1 BCYE (Polymyxin +Vancomycin), 1 BCYE (ohne Antibiotikum), 1 Blut-Agarplatten
aufgelegt und bei 37°C, 5% CO 2 inkubiert. Nach etwa 3 Tagen können die Platten
ausgewertet werden. Die übrigen Filter werden einer Säurewaschung unterzogen.
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Säurewaschung
Die verbleibenden Filterproben werden nach der Filtration mit je 10 ml HCl-KCl-Puffer
versetzt und für 5 min bei RT inkubiert. Der Überschuß wird unter Vakuum
abgesaugt. Zur Neutralisation werden je 10 ml KOH-Reagenz auf die Filter gegeben.
Nach weiteren 10 min wird erneut unter Vakuum abgesaugt. Die Filter werden auf 2
BCYE (Polymyxin +Vancomycin), 1 BCYE (ohne Antibiotikum), 1 BCYE- Blut-
Agarplatten aufgelegt und bei 37°C, 5% CO 2 inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach 3
Tagen.
Umweltproben
Aus dem Mainwasser und aus einer Bodenprobe werden jeweils Verdünnungsreihen
von 10 -1 - 10 -4 in LB- Medium erstellt. Je 100 µl werden auf LB- Agar ausplattiert und
für 2 Tage bei 37 ˚C inkubiert.
Legionella Kultivierung/ Auswertung Umweltisolate (am Donnerstag)
Die Anzahl der Kolonien wird gezählt. Die Keimzahl soll in CFU/Liter („colony forming
units“) berechnet werden. Ferner soll der prozentuale Anteil der Legionellen mit und
ohne Säurebehandlung berechnet werden.
Versuchen Sie, morphologisch unterschiedliche Bakterien zu isolieren und auf LB-
Platten zu vereinzeln (4 Isolate/ LB-Platte). Beschreiben Sie die
Kolonieeigenschaften (Geruch, Konsistenz, Farbe, Rand, etc). Die Platten werden
anschliessend für den Hemmhofassay verwendet (2.3).
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2.2 Antibiotikaresistenzbestimmung
Ziel: In diesem Versuch sollen Sie die Antibiotikaempfindlichkeit von Staphylokokken
mit Hilfe des Agar-Diffusionstestes feststellen.
Einleitung:
Seit etwa 50 Jahren hat die richtige und rechtzeitige Anwendung von Antibiotika in
der Human- und Veterinärmedizin vielen schweren Infektionskrankheiten wie
bakteriellen Hirnhautentzündungen, Lungenentzündungen, Tuberkulose, Diphtherie,
Scharlach, Harnwegsentzündungen, Abszessen ihren Schrecken genommen.
Den positiven Erfahrungen mit Antibiotika steht eine von den Mikrobiologen schon
bald beobachtete negative Entwicklung gegenüber: die zunehmende Auslese,
Anreicherung und Ausbreitung resistenter Keime, die auf eine Antibiotikabehandlung
nicht mehr ansprechen.
Viele Bakterien haben durch Mutationen mehrere Wege entdeckt, um ein
Antibiotikum unwirksam zu machen oder ihm zu entgehen:
• Das Antibiotikum-Molekül wird von den Bakterien chemisch-enzymatisch unwirksam
gemacht (z.B b-Lactamasen, Aminoglykosid-Phosphorylasen,
Acetyltransferasen, Adenylyltransferasen etc.).
• Die Bakterienzellen machen ihre Zellwand undurchlässig für das Antibiotikum
• Die Bakterienzellen scheiden eindringendes Antibiotikum wieder aus, bevor es
Schaden anrichten kann (z.B. mit in den Membranen vorkommenden
Effluxsystemen) und
• die Bakterien panzern sich durch genetische Veränderungen (Mutationen) der
Angriffspunkte (Targets) gegen den Angriff eines Antibiotikums.
Die Stämme werden in Müller-Hinton-Medium angeimpft und über Nacht im Schüttler
bei 37°C angezogen. Die Kultur wird mit frischem Medium verdünnt und 1 Stunde bei
37°C wachsen gelassen (~ McFarland-Standard 0,5). Dies entspricht einer Keimzahl
von 10 5 -10 6 Zellen/ ml. Von dieser Verdünnung werden 150 µl auf eine Müller-
Hinton-Agarplatte ausplattiert. Anschließend werden mit Hilfe einer Pinzette
Antibiotikatestplättchen auf die Platte aufgelegt und bei 37 °C über Nacht im
Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag erfolgt die Auswertung des Tests durch
Ausmessen der Hemmhofdurchmesser.
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Das Prinzip des Tests ist in der untenstehenden Abbildung dargestellt.
Anzucht
Keimzahleinstellung
Ausplattieren
von 10 4
Keimen
Auflegen von
standardisierten
Antibiotikatestplättchen
bei 37°C über
Nacht inkubieren
P
Tc
Cc
Gm
Ox
E
Auswertung:
Ausmessender Hemmhofdurchmesser
und
Vergleich mit Standardwerten
Für die Austestung von Staphylococcus epidermidis im Agardiffusionstest benutzen
Sie folgende standardisierte Testblättchen.
Testblättchen: enthält: Antibiotikagruppe:
OX5 Oxacillin Penicillinderivat
P10 Penicillin Penicillin
E 15 Erythromycin Makrolid
VA 30 Vancomycin Glykopeptid
CN 10 Gentamicin Aminoglycosid
CTM 30 Cefotiam Cephalosporin,
2.Generation
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Für die Austestung von E.coli im Agardiffusionstest
standardisierte Testblättchen.
benutzen Sie folgende
Testblättchen: enthält: Antibiotikagruppe:
PRL30 Piperacillin Penicillinderivat
CIP 5 Ciprofloxacin Gyrasehemmer
VA 30 Vancomycin Glykopeptid
Te 30 Tetrazyklin Tetrazyklin
C 30 Chloramphenicol Chloramphenicol
CN 10 Gentamicin Aminoglycosid
Auswertung der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (Agardiffusionstest)
Messen Sie mit dem Lineal die Hemmhofdurchmesser um die Antibiotikablättchen
aus und tragen Sie sie in folgende Tabelle ein:
Antibiotika Code Hemmhofgrenzwerte
für Staphylokokken
Hemmhofg
renzwerte
Hemmhof
Durchmesser
Bewertung
des
für gram- des
getesteten
Stäbchen getesteten Keims
Keims
Penicillin P 10 ≤ 28r
≥28s
Oxacillin OX5 ≤16r
≥16s
Piperacillin PRL30 ≤14r
≥19s
Vancomycin VA30 ≤10r
≥11s
Völlige
Resistenz
Gentamicin CN10 ≤13r
≥14s
Ciprofloxacin Cip5 ≤16r
≥20s
Erythromycin
≤16r
16

Tetrazyklin
Chloramphenicol
Cefotiam
≥21s
CTM30 ≤16r
≥19s
≤16r
≥22s
≤20r
≥21s
Beurteilen Sie anhand der Tabelle (Kokken und Stäbchen), ob der Erreger sensibel
(s), intermediär oder resistent (r) ist.
MHK- Bestimmung-Demonstration
Die MHK (minimale Hemmkonzentration) ist die niedrigste Konzentration einer
antibiotischen Substanz (in µg/ml), die das Keimwachstum unter
Versuchsbedingungen hemmt. Bei der Bouillondilutionsmethode wird aus einer
Antibiotikastammlösung (z.B. Gentamicin) eine Verdünnungsreihe mit abfallenden
Wirkstoffkonzentrationen angelegt. Die wirkstoffhaltigen Rörchen werden mit einer
definierten Menge des zu testenden Keimes (z.B. Staph.epi.) beimpft und bebrütet.
Die Konzentration des Antibiotikums im letzten Röhrchen, das kein Wachstum
(Trübung) zeigt, ist die MHK.
Pipetierschema:
1. Kultur in Müller-Hinton-Medium 4 Stunden wachsen lassen
2. mit frischem Medium auf McFarland 0,5 einstellen
3. anschließend 1:200 in Müller-Hinton-Medium weiterverdünnen
4. Antibiotika-Verdünnungsreihe herstellen
2ml Stammlösung (c=2mg/ml) + 5,82ml Medium → c=512µg/ml
5. 12 Röhrchen beschriften, in jedes 0,5ml Medium geben
6. das erste Röhrchen dient als Wachstumskontrolle ohne AB,
in das 2. Röhrchen 0,5ml AB-Lösung, aus diesem Röhrchen in die restlichen
10 immer 0,5ml überpipettieren, aus dem 12. Röhrchen 0,5ml verwerfen
7. in alle Röhrchen 0,5ml Kultur geben
8. 18h bei 37°C wachsen lassen
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9. Ablesen: Keimwachstum erscheint als Trübung des Mediums. Röhrchen mit
geringer Wirkstoffkonzentration sind getrübt, solche mit hoher Konzentration
erscheinen klar (abhängig von der Empfindlichkeit des zu testenden Keimes).
Das letzte Röhrchen, das klar ist, enthält die Wirkstoffkonzentration, die zur
Hemmung der Keimvermehrung gerade ausreicht. Dieses ist die „minimale
Hemmkonzentration des Antibiotikums= MHK“.
2.3 Hemmhofassay (am Donnerstag)
Die aus den Bodenproben und dem Mainwasser gewonnenen Umweltbakterien
werden für einen Softagar-Overlay-Assay verwendet, um Kolonien zu identifizieren,
die antimikrobielle Aktivität gegen E.coli (Gram-negativ) oder gegen S. epidermidis
(Gram-positiv) haben. Falls Isolate mit antimikrobieller Aktivität isoliert werden
konnten, werden diese als Hemmhöfe im Overlay-Agar sichtbar.
Verbrauchsmaterial:
sterile Filtersysteme
8 sterile Membranfilter (Porengröße 0.2 μm)
steriles H 2 O dest.
2 BCYE-Agarplatten (ohne Antibiotika)
2 BCYE-Agarplatten (0.5 μg / ml Vancomycin + 20 μg / ml Polymyxin B)
2 Agarplatten mit Humanblut
HCl-KCl Puffer: 18 Teile 0,2 M KCl
1 Teil 0,2 M HCl
KOH-Reagenz: 10 mM KOH Lösung
Literatur:
Steinert M, Hentschel U, Hacker J (2002) Legionella pneumophila: an aquatic
microbe goes astray. FEMS Microbiol Rev. 26(2):149-62.
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Versuch 3: Bestimmung der Bakterienzahl in Umweltproben
Ziel: In diesem Experiment soll die Gesamtbakterienzahl sowie der Anteil der
kultivierbaren Bakterien in Schwammproben bzw. in Meerwasser bestimmt werden.
Einleitung:
Das Phänomen der ‚Great plate count anomaly’ (Amann 1995) beschreibt die
Erkenntnis, dass von den in der Umwelt vorliegenden Bakterien nur geschätzte 0.1%
auf Labormedien kultivierbar sind. Diese Beobachtung hat sich auch für die
mikrobiellen Gemeinschaften bestätigt, die marine Schwämme besiedeln.
A
B
C
Abbildung 1. Morphologischer Aufbau eines typischen Schwammes (A, B).
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Gewebes von A. aerophoba (C).
Versuchsbeschreibung:
- Jede Gruppe erhält eine Schwammprobe von einer ‚bakterienhaltigen’ oder von
einer ‚bakterienarmen’ Schwammart bzw. eine Meerwasserprobe.
- Die Probe wird verdünnt und im Mörser homogenisiert.
- Die Gesamtbakterienzahl wird nach Anfärbung mit dem DNA-Farbstoff DAPI
bestimmt.
- Die Fraktion kultivierbarer Bakterien wird nach Ausplattierung auf Nährmedien
bestimmt.
- Der Anteil der kultivierbaren Bakterien an der Gesamtbakterienzahl wird berechnet.
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Protokoll:
- die Schwammprobe 1:10 mit steril-filtriertem, artefiziellem Meerwasser (ASW) in 15
ml Falconröhrchen verdünnen
- die Probe in den Mörser überführen und zermörsern
- den Schwammextrakt durch ein Nitex-Netz gießen, um Gewebereste zu entfernen
der so erstellte Schwammextrakt wird, wie folgt, aufgearbeitet:
(a) Bestimmung der Gesamtzellzahl:
- Schwammextrakt mit 3.7% Formaldehyd (Endkonzentration) für mindestens 2
Stunden fixieren: 900µl Schwammextrakt + 100µl Formaldehyd (37%)
- aus dem Extrakt Verdünnungen von 10 -1 – 10 -3 mit ASW erstellen
- Jede Verdünnung mit 0.7 µg/ ml DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole)
Endkonzentration für 30 min in der Dunkelheit (z.B. Schublade) anfärben
- Den angefärbten Extrakt zu 9 ml sterilfiltriertem ASW hinzugeben und auf 0.2 µm
Polykarbonatfilter mit der Vaccumpumpe vorsichtig applizieren (siehe Betreuer!)
- den Filter mit H 2 O und anschließend mit 70% Ethanol waschen
- den Filter mit der Bakterienseite nach oben auf einen Objektträger legen und mit
Citifluor und Deckgläschen eindeckeln
- Unter dem Epifluoreszenzmikroskop bei 100x Vergrößerung und unter Nutzung des
Zählfensters auszählen
- Die Bakterienzellzahl im Ausgangsmaterial unter Berücksichtigung der
Verdünnungen berechnen
(b) Bestimmung der kultivierbaren Bakterienfraktion:
- aus dem Extrakt Verdünnungen von 10 -1 – 10 -3 mit ASW erstellen, je 1 ml
- 3 x 100 µl jeder Verdünnungsstufe auf Zobell- und LB-Agar ausplattieren
- nach 2 Tagen die Anzahl an Bakterien pro Platte auszählen
- Die Anzahl an kultivierbaren Bakterien im Ausgangsmaterial unter Berücksichtigung
der Verdünnungen berechnen
20

Gruppe, Name, Probe:
Verdünnungen (wichtig!):
1. Verdünnung 2. Vedünnung 3. Verdünnung
Zählfeld Bakterien Zählfeld Bakterien Zählfeld Bakterien
1. 1. 1.
2. 2. 2.
3. 3. 3.
4. 4. 4.
5. 5. 5.
6. 6. 6.
Av. Av. Av.
Bemerkungen:
Jeder Student sollte 2 Zählfelder pro Verdünnung zählen, ohne die Werte der
anderen zu kennen. Kommen Sie auf gleiche Zahlen?
Beschreiben Sie genau, was sie unter dem Mikroskop sehen.
Gibt es Partikel mit Autofluoreszenz? Woher resultiert die blaue Färbung?
Sehen alle Partikel gleich aus? Wie gross sind die Partikel? Was könnten die
Schwammzellen sein?
Was wären mögliche Fehlerquellen?
Für die Berechnung der Gesamtzellzahl benötigte Faktoren:
- Kantenlänge des Zählgitters (Strecke für 10 Kleinfelder): 123μm
- Filterdurchmesser: 16,2mm
21

Verbrauchsmaterial:
- je 1 g Schwammmaterial (bakterienhaltig, bakterienfrei); Aquarienwasser
- steril-filtriertes ASW
- Zobell- und LB-Platten giessen, müssen trocken sein!
LB-Agar: 8g Trypton, 4g Hefeextrakt, 4g NaCl, 12g Agar; ad 800ml H 2 O dest.
Zobell-Agar: 4g Trypton, 0,8g Hefeextrakt, 12g Agar; ad 600ml ASW/ 200ml H 2 O dest.
- 2 x Mörser und Pistill, Nitex-Sieb
- DAPI (neu ansetzen, 100 µg/ ml Stocklösung, 4C Aufbewahrung)
- 2 Filtrationeinheiten und Vacuumpumpen, 0.2 µm Polykarbonatfilter, 70% Ethanol
- Objektträger und Citifluor, Handzähler
- Epifluoreszenz-Mikroskop reservieren!
Literatur:
1. Friedrich AB, Hacker J, Fischer I, Proksch P, Hentschel U (2001) Temporal
variations of the microbial community associated with the mediterranean
sponge Aplysina aerophoba. FEMS Microbiol Ecol 38: 105- 113
22

Versuch 4: Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH) mit
Legionellen und Schwamm-assoziierten Bakterienisolaten
Ziel: Einsatz von 16S rRNA gerichteten, fluoreszenz-markierten Oligonukleotid-
Sonden zur phylogenetischen Einordnung von Bakterien.
Einleitung:
Die Mehrheit der in der Umwelt vorkommenden Bakterien kann bisher nicht
kultiviert werden. Konservative Schätzungen ergeben, dass sich < 1% der Bakterien
auf Labormedien vermehren lassen. Besonders die Untersuchungen von extremen
Habitaten (z.B. Meereis, Tiefsee, heiße Geysire, Besiedelung von Wirten
(Symbionten/Pathogene)) stellen ein großes Reservoir an unbekannten Bakterien
dar. Da die FISH Technik kultivierungs-unabhängig ist, ist sie besonders geeignet,
um die mikrobielle Diversität von Umweltproben zu erfassen.
Die Methode der in-situ-Hybridisierung (FISH) ermöglicht es, Mikroorganismen
am Ort ihres Vorkommens zu markieren und taxonomisch zu identifizieren. Als Ziel
für eine Identifizierung dienen hier Bereiche der 16S und 23S rRNA, die sich
aufgrund ihres ubiquitären Vorkommens und der hohen Kopienzahl von 10 3 -10 5 /Zelle
sehr gut zum Nachweis auch einzelner Zellen nutzen lassen. Die 16S rRNA steht
hier im Vordergrund, da bereits mehr als 70,000 Sequenzen in Datenbanken
niedergelegt worden sind.
Das Prinzip der in-Situ Hybridisierung besteht darin, das eine Oligonukleotid-
Sonde nach Permeabilisierung der Zelle an den komplementären Sequenzbereich,
der in der Zelle vorliegenden rRNA spezifisch bindet. Da die Sonde an einen
Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist, können markierte Bakterien als Signale erkannt
werden. Die 16S rRNA-Sequenz enthält Bereiche, die in allen Bakterien identisch
sind (konservierte Bereiche), und andere, die artspezifisch sind (variable Bereiche).
Durch geschickte Wahl der Sequenz-Bindungsregion können Sonden konstruiert
werden, die für verschiedene taxonomische Gruppen spezifisch sind. Falls die
komplette 16S rDNA Sequenz schon bekannt ist, können spezifische Sonden
entwickelt werden. Damit ist die gezielte Identifizierung eines Isolates in einer
Umweltprobe gewährleistet.
23

Versuchsbeschreibung:
Jede Gruppe fixiert eine Legionella-Übernachtkultur und eine Kultur eines
unbekannten Schwamm-Bakteriums. Die Hybridisierung mit verschiedenen 16S
rRNA-Sonden wird auf Objektträgern durchgeführt. Die Auswertung erfolgt am
Epifluoreszenz-Mikroskop.
Protokoll:
Expt. 5.1
- Jede Gruppe erhält je 2 ml Übernachtkultur von Legionella und von einem
unbekannten Schwammbakterium.
- Die Kulturen bei 13.000 rpm 2 min zentrifugieren.
- Pellet in je 1 ml 4% PFA (Paraformaldehyd in 1x PBS) aufnehmen und ÜN im
Kühlschrank fixieren
Expt. 5.2
- Pellet 2x mit 1 ml PBS (phosphate buffered saline) waschen
- Jede Gruppe erhält 2 Objektträger mit jeweils 8 Feldern
- Mit einem Bleistift die Objektträger beschriften (siehe unten)
1 2 3 4
5 6 7 8
SB
35% FA
Leg
1 und 5 EUB - Mix cy3
2 und 6 EUB - Mix FITC
3 und 7 Gamma42a
4 und 8 ohne sonde
1 2 3 4
5 6 7 8
SB
25% FA
Leg
1 und 5 hgc
2 und 6 Alpha
3 und 7 ohne Sonde
4 und 8 bleiben frei
- Je 5 µl der gewaschenen Legionella Kultur und je 5 µl fixierte Schwamm-
Bakterium Kultur in die jeweiligen Felder des entsprechenden Objektträgers
tropfen
- auf dem Heizblock (42 ˚C) trocknen
- Inzwischen EtOH Reihe (50%, 80%, 100%) ausgehend von 100% EtOH
erstellen
- Objektträger entwässern: Alkoholreihe: je 5 min in 50%, 80%, 100% Ethanol
- bei Raumtemperatur trocknen lassen
- Hybridisierungspuffer ansetzen!!!
- Je 40 µl Hybridisierungspuffer incl. der entsprechenden Sonden (Eub, Alpha,
Gamma, Gram-Positive) auf je ein Objektträger Feld tropfen (eine Sonde pro
24

Feld). 40 µl Hybridisierungspuffer als Negativ-Kontrolle auf das fünfte
Objektträger Feld tropfen. Die restlichen Felder bleiben frei.
- mind. 2 h bei 46°C in einer feuchten Kammer im Hybridisierungsofen
inkubieren
- ca. 30 min vor Ende der Hybridisierung, Waschpuffer ansetzen und auf 48°C
vorwärmen (Wasserbad)!!!
- 20 min bei 48°C mit 50 ml Waschpuffer waschen (im Wasserbad bei 48°C)
- Objektträger vorsichtig mit destilliertem Wasser (aus der Spritzflasche)
abspülen
- im Brutschrank bei 37°C trocknen lassen
- mit dem Eindeckmittel Citifluor eindecken, ein Deckglas auflegen
- am Epifluoreszenz Mikroskop unter Aufsicht des Assistenten (Kristina Bayer)
auswerten
Auswertung
- Füllen Sie die folgende Tabelle mit +/- aus.
- Welcher taxonomischen Gruppe sind Legionella und das unbekannte
Schwamm-Bakterium zuzuordnen?
Schwamm-
Bakterium
Kultur Eub Alpha-
Proteobakteria
Legionella sp.
Gamma-
Proteobakteria
Gram-Positive
Hybridisierungspuffer (2ml Gesamtvolumen; Stringenz 25 und 35%)
362µl 5M NaCl
40µl 1M Tris/HCl
500 bzw. 700µl Formamid
4µl 10% SDS
ad 695 bzw. 894 µl
H 2 O-Millipore
Waschpuffer: (50 ml Gesamtvolumen; Stringenz 25 und 35%)
0,5 ml 0,5M EDTA (pH8,0)
1 ml 1M Tris/HCl (pH8,0)
1490 bzw. 700 µl 5M NaCl
50 µl 10% SDS
46,96 bzw. 47,75 ml H 2 O-Millipore
Sondensatz:
(Tabelle mit den Konzentrationen der Sonden-Stocklösungen und den
Endkonzentrationen im Hybridisierungspuffer)
25

Verbrauchsmaterial:
- Bleistift
- 2 Objektträger mit jeweils 8 Feldern
- Übernachtkulturen (Legionella sp. und ein unbekanntes Schwamm-Bakterium)
- 4% PFA (Paraformaldehyd in 1x PBS)
- PBS (Phosphate buffered Saline)
- 100 % Ethanol
- 4 x 50 ml Falcon-Röhrchen
- Citifluor und Deckgläschen
- 16S rRNA-Sondensatz
- Fluoreszenz-Mikroskop reservieren
Name Sequenz 5’ → 3’ T m
(FA –
conc.)
Spezifität Markierung mit Position in
E.coli
EUB-Mix
EUB 338 I 1)
EUB 338 II
EUB 338 III
GCTGCCTCCCGTAGGAGT
GCAGCCACCCGTAGGTGT
GCTGCCACCCGTAGGTGT
55°C
55°C
55°C
(0-50%)
hgc 1) TATAGTTACCACCGCCGT 53,7°C
(25%)
ALPHA 1) CGTTCG(CT)TCTGAGCCAG 56,4°C
(20%)
GAM 42a 1) GCCTTCCCACATCGTTT 54,3°C
(35%)
1) Amann et al., 1995
Eubakterien
Planctomycetales
Verrucomicrobiales
Gram-positive
Bakterien mit hohem
GC-Gehalt
Proteobakterien der
α-Gruppe
Proteobakterien der γ-
Gruppe
cy3 und FITC
cy3 und FITC
cy3 und FITC
cy3
cy3
cy3
16S rRNA,
Pos. 338-
355
23S rRNA,
Pos. 1901-
1918
16S rRNA,
Pos. 19-35
23S rRNA,
Pos. 1027-
1043
Literatur:
(1) Amann R, Ludwig W and Schleifer KH (1995) Phylogenetic identification and
in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 59 (1):
143-169
(2) Friedrich, AB, Merkert H, Fendert T, Hacker J, Proksch P and Hentschel U
(1999) Microbial diversity in the marine sponge Aplysina cavernicola (formerly
Verongia cavernicola) analyzed by fluorescence in situ hybridisation (FISH), Mar.
Biol. 134: 461-470
26

Versuch 5: Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese (DGGE)
Ziel: Die Erstellung eines phylogenetischen Profiles einer komplexen mikrobiellen
Gemeinschaft
Einleitung:
Mittels DGGE kann die Struktur und Artenzusammensetzung von komplexen
mikrobiellen Gemeinschaften untersucht werden, ohne dabei von der Kultivierbarkeit
der Organismen abhängig zu sein. Das gesamte Bandenmuster einer
Polyacrylamidgelspur stellt das Profil der mikrobiellen Gemeinschaft da, während
jede einzelne Bande die 16S rRNA eines Bakterienstammes repräsentiert. Es wird
sozusagen ein ‚Fingerprint‘ einer mikrobiellen Gemeinschaft erstellt. Der Vergleich
von verschiedenen Proben ermöglicht die Identifizierung von Banden, die gleich sind
und solchen, die unterschiedlich sind. Diese Banden können zur phylogenetischen
Identifizierung aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert werden. Die Vorteile der
DGGE liegen darin, dass eine ‚Übersicht‘ über die mikrobielle Zusammensetzung
und Vielfalt erstellt werden kann. Nachteilig ist jedoch, dass aufgrund der kurzen
Sequenz (200-500 Basen) nur eine grobe phylogenetische Einordnung der
respektiven Banden möglich ist.
Abbildung 1: DGGE Profile von Aplysina Schwämmen nach Aquarienhälterung
27

Die Methode der DGGE beruht auf dem Prinzip der Auftrennung eines
Gemisches von gleich langen DNA Fragmenten, die einen unterschiedlichen GC
Gehalt und damit eine unterschiedliche Schmelztemperatur (T m ) besitzen. Mittels
eines spezifischen Primerpaares wird aus einer heterogenen Probe von
chromosomaler DNA (z.B. aus einem Schwamm) ein bestimmter Bereich der 16S
rDNA PCR amplifiziert (siehe Experiment 3). Diese PCR Fragmente werden nun
nicht, wie bei der herkömmlichen Gelelektrophorese nach ihrer Grösse, sondern
aufgrund des im DGGE Geles vorherrschenden Harnstoff- und Formamidgradienten
aufgetrennt. Dabei spielt die unterschiedliche Schmelztemperatur (abhängig von
Sequenz und GC Gehalt) der Fragmente die entscheidene Rolle. Erreicht ein
Fragment die für es spezifische Konzentration an Harnstoff und Formamid im Gel, so
wird die doppelsträngige Struktur nach dem Reissverschlussprinzip aufgetrennt.
Aufgrund der sterischen Veränderung bleibt diese Fragment im Gel stecken und
bildet eine Bande, bzw., mehrere 16S Fragmente bilden ein Bandenmuster. Um eine
Schärfung der Banden im Gel zu erreichen, bzw. den Schmiereffekt zu reduzieren,
wurde ein Trick, die GC-clamp eingeführt. Diese 30-40 Basen lange, GC-reiche
Region wird in der PCR durch einen der beiden PCR Primer and die jeweiligen PCR
Fragmente angehängt. Diese GC clamp wirkt wie ein Anker, der die beiden
Fragmente nach Denaturierung zusammenhält. Das Prinzip der DGGE ist in
folgender Abbildung verdeutlicht:
0% Denaturierung
100% Denaturierung
28

Versuchsbeschreibung:
Jede Gruppe hat eine DGGE-PCR Probe von Montag (Experiment 1) bei –20C
eingefroren. Das DGGE-Gel wird von Ihnen unter Aufsicht des Assistenten gegossen
und ÜN im Kühlschrank aufbewahrt. Die PCR-Proben werden von Ihnen mit
Ladepuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Die Laufzeit beträgt etwa 6 h . Das
Gel wird mit SYBR-Gold gefärbt, eingescannt und ausgewertet.
Protokoll:
Expt. 6.1 DGGE-PCR Reaktion
- Siehe Expt 1.1
Expt. 6.2
DGGE-Gele giessen
Pipettiervorgabe für ein 10% Acrylamid Gel
0% Denaturing Solution 100 % Denaturing Solution
40% Acrylamide/Bis 25 ml 25 ml
50 x TAE 2 ml 2 ml
Formamid ---- 40 ml
Harnstoff (Urea) ----- 42 g
Dest. H20 73 ml auf 100 ml
Endvolumen 100 ml 100 ml
- Platten putzen, Spacer einlegen, Halterung aufschrauben
- Folgende Lösungen im Erlenmeyerkolben zusammenpipettieren:
- 12.5 ml der 0% und 100% Denaturing Solution
- 40 µl 10% APS
- 16 µl TEMED (Katalysator)
- die beiden Ansätze gut mischen, in die entsprechenden Spritzen füllen, und mit
Hilfe des Gradientengiessers das DGGE- Gel giessen
- über Nacht bei 4°C auspolymerisieren lassen
29

Expt. 6.3 DGGE Durchführung
- PCR Produkte auftauen und mit 10 µl Ladepuffer versetzen
- Heizer auf 63C hochfahren
- Gel in die Appartur einsetzen, Kamm entfernen
- Proben mit Hamiltonspritze auftragen
- Apparatur anschalten: Gelelektrophorese bei 60°C, 150V für 6 h.
- Gel aus der Apparatur entfernen, 30 min in SYBR-Gold färben, einscannen und
auswerten.
Verbrauchsmaterial:
DGGE- PCR Proben von Mittwoch
DGGE Ladepuffer (2% Bromphenolblau, 2% Xylene cyanol, 86% Glycerin)
ein polymerisiertes, fertig vorbereitetes DGGE Gel und Puffer, DGGE Apparatur
SYBR-Gold-Bad
Literatur:
1. Muyzer G, Smalla K (1998) Application of denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in
microbial ecology. Ant. V. Leeuwenhoek 73: 127-141
2. Schmitt S, Weisz J, Lindquist N, Hentschel U (2007) Vertical transmission of a
phylogenetically complex yet highly sponge-specific microbial consortium in the
viviparous sponge Ircinia felix. Appl Environ Microbiol: im Druck
30

Versuch 6: Erstellung einer 16S rDNA Genbank
Ziel: Die Erstellung von 16S rDNA Genbanken dient der kultivierungsunabhängigen
Erfassung der bakteriellen Diversität eines ausgewählten Habitats.
Einleitung:
Im Anbetracht der rasanten technischen Fortschritte in den Biowissenschaften
erscheint es erstaunlich, dass >99% aller auf dieser Erde vorzufindenen Bakterien
bisher noch vollkommen unbekannt sind. In der mikrobiellen Diversität schlummert
ein biotechnologisches Potential, was bisher bei Weitem nicht ausgeschöpft ist und
auch von diversen Biotec Firmen aktiv verfolgt wird. Dabei braucht man gar nicht an
‚extremen Standorten‘, wie heissen Tiefseequellen, Polareis oder in tiefen
Erdschichten zu suchen, um fündig zu werden. Sogar vor der eigenen Haustür, wie
zB Bodenproben aus der näheren Umgebung, zeugen von einer grossen
prokaryontischen Vielfalt. Wie kann man nun Bakterien untersuchen und
gegebenenfalls nutzbar machen, die mit gängigen Kultivierungsversuchen nicht
anziehbar sind sind? Am Beispiel des marinen Schwammes Aplysina aerophoba (10
8 Bakterien / g Schwamm, davon < 0.15% kultivierbar) werden wir eine 16S rDNA
Genbank anlegen, die dann zur Beschreibung der mikrobiellen Vielfalt in
weiterführenden Experimenten genutzt werden kann.
Als Matritze für die PCR dient die extrahierte genomische Gesamt-DNA des
Schwammgewebes von A. aerophoba. Dieses, als Metagenom bezeichnetes DNA
Gemisch, umfasst sowohl eukaryontische Schwamm DNA, als auch prokaryontische
DNA der mit A. aerophoba assoziierten Bakterien. Durch die PCR wird eine Vielzahl
unterschiedlicher 16S rRNA Gene amplifiziert. Durch eine anschliessende Klonierung
des Amplikons werden die einzelnen unterschiedlichen 16S rRNA Gene separat in
den Vektor „pGEM-T easy“ ligiert und in E. coli K12 Novablue transformiert. Im sich
anschliessenden ‚Blue-white-screen’wachsen die transformierten E.coli Zellen nun
weiß oder blau. Dies liegt daran, dass die Insertionsstelle auf dem Plasmid in einem
lacZ Gen liegt. Enthält das Plasmid ein Insert, so kann keine β-Galaktosidase mehr
gebildet werden. Diese Kolonien wachsen weiß. Klone, deren Plasmid kein Insert
enthält, die also β-Galaktosidase expremieren können, wachsen blau und sind für
den weiteren Versuch uninteressant. Da die weiterführenden Experimente den
Rahmen dieses Praktikums sprengen würden, sind sie hier der Vollständigkeit halber
erwähnt, werden aber nicht praktisch durchgeführt.Von ausgewählten weissen
Klonen würde dann eine Plasmid DNA Extraktion erfolgen, die dann als Matrize für
eine Sequenzierung der einzelnen, in den Vektor inserierten 16S rRNA Gene dient.
Die abschliessenden phylogenetischen Analysen und Baumrechnungsverfahren
liefern die Information über die phylogenetische Zugehörigkeit und über die Diversität
der in einer Probe vorhandenen Bakterien.
Einschränkend sei zu bemerken, dass aus der mengenmässigen Verteilung
bestimmter Klone in einer Genbank keine Rückschlüsse auf das tatsächliche
quantitative Vorkommen der entsprechenden Organismen in deren Habitat gezogen
werden dürfen. So können zum Beispiel geringfügig vertretende Matritzen während
einer PCR nicht erfasst werden, was besonders bei der Anwendung hoher PCR
Zyklusanzahlen der Fall sein kann. Ebenso können bestimmte Matritzen bevorzugt
amplifiziert werden und so zu einer unnatürlich hohen Klonabundanz in einer
31

Genbank führen. Eine weitere Einschränkung ist, dass nur solche Organismen
detektiert werden, die durch die verwendeten Primer erfasst werden.
Versuchsbeschreibung:
7.1 Jede Gruppe hat am Montag eine Klonier-PCR Probe bei –20C eingefroren
7.2 Das PCR Produkt wird gereinigt, in einen Vektor ligiert und in kompetente
E.coli -Zellen transformiert (Klonierung). Die transformierten Zellen werden
auf Indikatorplatten ausplattiert und über Nacht im Brutschrank inkubiert.
7.3 Auswertung des Blue-White Screens: positive Klone werden gepickt, in
Flüssigkultur angeimpft und im Schüttler bei 37°C ÜN angezogen.
7.4 Es erfolgt eine Plasmid-Minipräparation, PCR-Reaktion und ein
Restriktionsverdau
7.5 Die Plasmide werden mit einem Restriktionsenzym verdaut und die
Restriktionsmuster auf einem Gel verglichen
Protokoll:
Expt 7.1
16S rDNA-PCR (wurde von Euch am Montag durchgeführt)
Expt. 7.2 Klonierung des PCR Produktes
Reinigung des PCR Produktes (Firma Qiagen
- 250 µl Puffer PB zum PCR Produkt hinzufügen und mixen
- Das PCR Produkt auf die Säule geben und 60 sec zentrifugieren (→ das PCR
Produkt bindet an die Säule)
- Den Durchlauf wegwerfen, die Säule erneut auf das 2ml Gefäss setzen
- 750 µl Waschpuffer PE auf die Säule geben und erneut 60 sec zentrifugieren (→
das PCR Produkt wird gewaschen)
- Durchlauf wegwerfen, die Säule auf das Gefäss setzen und 60 sec zentrifugieren
- Die Säule auf ein neues 1.5 ml Eppendorf Gefäss setzen, 30 µl H20 auf die Säule
geben und 1min zentrifugieren. (→ das PCR Produkt wird eluiert)
- Die Säule wegwerfen. Das gereinigte PCR Produkt befindet sich im
Eppendorfgefäss.
32

Ligation
- Rapid Ligation Mix (Promega) 10 μl
- pGEM-T Easy Vektor 1 μl
- Ligase T4 1 μl
- PCR-Produkt, Positiv-, oder Negativkontrolle 8 μl
Die Ansätze (1 x 20 µl) werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Eine Gruppe macht abgesehen von ihrer Ligation noch eine Positiv- und eine
Negativkontrolle mit.
Transformation der ligierten Vektoren in kompetente E.coli Novablue
- 2 μl des jeweiligen Ligationsansatzes zu ca. 100 μl kompetenten Zellen geben
- 30 min Inkubation auf Eis
- Hitzeschock für 1:15 min bei 42°C
- 5 min Inkubation auf Eis
- Zellen vorsichtig in 1 ml LB-Medium verdünnen
- 2 h bei 37°C schütteln lassen
- 150µl direkt mit Glasskugeln auf eine LB-Amp-IPTG-Xgal-Agarplatte ausplattieren
- restliche Kultur abzentrifugieren und in 100µl LB-Medium vorsichtig
resuspendieren, ebenfalls mit Glasskugeln auf eine LB-Amp-IPTG-Xgal-Agarplatte
ausplattieren
- Inkubation über Nacht bei 37°C
7.3 Auswertung des Blue-White Screens
- Am nächsten Tag das Ergebnis des Blue-White Screens interpretieren
- Pro Gruppe werden 4 weiße und 1 blauer Klon in je 3 ml LB-amp-Medium
angeimpft und über Nacht auf dem Schüttler bei 37°C inkubiert.
7.4 Plasmidminipräparation
- Die ÜN Kulturen 3 min bei bei 8.000 rpm abzentrifugieren
- Überstand verwerfen. Das Pellet in 150 µl Puffer P1 resuspendieren
- 150 µl Puffer P2 hinzugeben, die Proben 5 min bei Raumtemp inkubieren
- 150 µl Puffer P3 hinzugeben und 5 min im Eisbad inkubieren.
- 10 min bei 13.000 rpm zentrifugieren, den Überstand abnehmen (und aufheben!)
und das Pellet verwerfen, zweimal zentrifugieren!
33

- 350 µl Isopropanol zum Überstand hinzugeben, vorsichtig invertieren (Plasmid-
DNA fällt aus)
- 15 min bei 13.000 zentrifugieren. Überstand verwerfen.
- Das Plasmid-DNA-haltige Pellet mit 70% EtoH waschen, trocknen und in 50 µl
sterilem H20 aufnehmen
PCR-Reaktion
RFLP-PCR (Gesamtvolumen 5 x 50 μl):
1 μl Plasmid DNA
5 μl Reaktionspuffer (10x)
1 μl Primer SP6
1 μl Primer T7
1 μl dNTP´s
0,25 μl Taq-Polymerase
ad. 50µl mit sterilem H2O
PCR-Programm Biometra PCR-Maschine eingeben:
Initiale Denaturierung 2 min 95°C
30 Zyklen:
1 min 95°C (Denaturieren)
1 min 45°C (Annealing)
1,5 min 72°C (Extension)
Finaler Elongationsschritt: 10 min 72°C
Restriktionsverdau
Die Proben werden anschliessend für den Restriktionsverdau verwendet (siehe
Experiment 8.1, Seite 34). Den Restriktionsverdau am Donnerstag durchführen und
das entsprechende RFLP Gel am Freitag giessen, laufen lassen und auswerten.
Verbrauchsmaterial:
Qiagen PCR Purification Kit und Säulen
Promega Klonierungskit (Ligation und Transformation)
Positiv DNA und Negativ Kontrolle
Kompetente E.coli Novablue
LB-Amp-IPTG-Xgal-Agarplatten
Glassperlen
LB und LBamp Medien
Literatur:
1. Dojka ME, Harris JK, Pace NR (2000). Expanding the known diversity and
environmental distribution of an uncultured phylogenetic division of bacteria. Appl.
Environ. Microbiol.66:1617- 1621
1. Hentschel U, Hopke J, Horn M, Friedrich AB, Wagner M, Moore BS (2002)
Molecular evidence for a uniform microbial community in sponges from different
oceans. Appl Environ Microbiol 68: 4431- 4440
34

Experiment 7: RFLP Analyse
(Restriction Fragment Length Polymorphism)
Ziel: Diese Methode ermöglicht eine Abschätzung der Diversität innerhalb der
positiven Klone der Genbank
Einleitung:
Nach einem erfolgreichen Blue-White Screen steht man oft vor dem Problem,
dass man hunderte von weissen Klonen (also denen, die ein insert haben) auf der
Agarplatte hat, und nun abschätzen muss, wie viele verschieden und wie viele gleich
sind, bzw., welche für die Sequenzierung ausgewählt werden sollen. Dazu wird die
RFLP- Analyse eingesetzt. Zunächst werden die weissen Klone gepickt, die Plasmid-
DNA wird isoliert und eine PCR-Reaktion zur Amplifizierung des 16S rDNA Gens
durchgeführt. Mit dieser PCR weist man nach, dass sich ein Insert der richtigen
Grösse im Vektor befindet. Zudem vermeidet man, dass die Vektorsequenz in
nachfolgenden Restriktionsverdau mit geschnitten wird. Das PCR Produkt wird dann
mit einem Restriktionsenzym geschnitten, welches das PCR-Produkt in, im Idealfall,
5-8 Fragmente schneidet. Man erhält nach einer Gelelektrophorese nun ein
Bandenmuster. Dieses ist für unterschiedliche Gene natürlich auch verschieden.
Erhält man allerdings gleiche Bandenmuster, so kann man mit einer gewissen
Wahrscheinlichkeit sagen, dass es sich hier entweder um gleiche 16S rDNA Gene
oder sehr nah verwandte Gene handelt. Um eine möglichse diverse Genbank zu
erhalten, wählt man repräsentative Klone mit unterschiedlichen RFLP-Mustern aus.
Ein typisches RFLP-Gel
600 bp
200bp
35

8.1 Restriktionsverdau
Ansatz:• H 2 O bidest.
• Puffer
• PCR-Produkt
• Hae III
7 μl
2 μl
10 μl
1 μl (2 units)
Das bei der RFLP verwendete Enzym Hae III schneidet DNA immer zwischen GG
und CC. Den Ansatz zunächst 2 Stunden bei 37 o C inkubieren, dann die Reaktion mit
5 μl Stop-Puffer beenden. Die Proben werden auf ein 3 %iges Agarosegel
aufgetragen und bei 150 V laufen gelassen. Als Marker wird ein 100 bp DNA Ladder
verwendet.
8.2 RFLP-Gel-Auswertung
Welche Klone würden sie in gleiche OTU’S (operational taxonomic units) einordnen?
Welche Klone würden Sie zur Sequenzierung wählen?
36