F1- Praktikum Mikrobiologie Block N: Molekulare mikrobielle Ökologie

Die Methode der DGGE beruht auf dem Prinzip der Auftrennung eines
Gemisches von gleich langen DNA Fragmenten, die einen unterschiedlichen GC
Gehalt und damit eine unterschiedliche Schmelztemperatur (T m ) besitzen. Mittels
eines spezifischen Primerpaares wird aus einer heterogenen Probe von
chromosomaler DNA (z.B. aus einem Schwamm) ein bestimmter Bereich der 16S
rDNA PCR amplifiziert (siehe Experiment 3). Diese PCR Fragmente werden nun
nicht, wie bei der herkömmlichen Gelelektrophorese nach ihrer Grösse, sondern
aufgrund des im DGGE Geles vorherrschenden Harnstoff- und Formamidgradienten
aufgetrennt. Dabei spielt die unterschiedliche Schmelztemperatur (abhängig von
Sequenz und GC Gehalt) der Fragmente die entscheidene Rolle. Erreicht ein
Fragment die für es spezifische Konzentration an Harnstoff und Formamid im Gel, so
wird die doppelsträngige Struktur nach dem Reissverschlussprinzip aufgetrennt.
Aufgrund der sterischen Veränderung bleibt diese Fragment im Gel stecken und
bildet eine Bande, bzw., mehrere 16S Fragmente bilden ein Bandenmuster. Um eine
Schärfung der Banden im Gel zu erreichen, bzw. den Schmiereffekt zu reduzieren,
wurde ein Trick, die GC-clamp eingeführt. Diese 30-40 Basen lange, GC-reiche
Region wird in der PCR durch einen der beiden PCR Primer and die jeweiligen PCR
Fragmente angehängt. Diese GC clamp wirkt wie ein Anker, der die beiden
Fragmente nach Denaturierung zusammenhält. Das Prinzip der DGGE ist in
folgender Abbildung verdeutlicht:
0% Denaturierung
100% Denaturierung
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