F1- Praktikum Mikrobiologie Block N: Molekulare mikrobielle Ãkologie

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Expt. 6.3 DGGE Durchführung - PCR Produkte auftauen und mit 10 µl Ladepuffer versetzen - Heizer auf 63C hochfahren - Gel in die Appartur einsetzen, Kamm entfernen - Proben mit Hamiltonspritze auftragen - Apparatur anschalten: Gelelektrophorese bei 60°C, 150V für 6 h. - Gel aus der Apparatur entfernen, 30 min in SYBR-Gold färben, einscannen und auswerten. Verbrauchsmaterial: DGGE- PCR Proben von Mittwoch DGGE Ladepuffer (2% Bromphenolblau, 2% Xylene cyanol, 86% Glycerin) ein polymerisiertes, fertig vorbereitetes DGGE Gel und Puffer, DGGE Apparatur SYBR-Gold-Bad Literatur: 1. Muyzer G, Smalla K (1998) Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Ant. V. Leeuwenhoek 73: 127-141 2. Schmitt S, Weisz J, Lindquist N, Hentschel U (2007) Vertical transmission of a phylogenetically complex yet highly sponge-specific microbial consortium in the viviparous sponge Ircinia felix. Appl Environ Microbiol: im Druck 30
Versuch 6: Erstellung einer 16S rDNA Genbank Ziel: Die Erstellung von 16S rDNA Genbanken dient der kultivierungsunabhängigen Erfassung der bakteriellen Diversität eines ausgewählten Habitats. Einleitung: Im Anbetracht der rasanten technischen Fortschritte in den Biowissenschaften erscheint es erstaunlich, dass >99% aller auf dieser Erde vorzufindenen Bakterien bisher noch vollkommen unbekannt sind. In der mikrobiellen Diversität schlummert ein biotechnologisches Potential, was bisher bei Weitem nicht ausgeschöpft ist und auch von diversen Biotec Firmen aktiv verfolgt wird. Dabei braucht man gar nicht an ‚extremen Standorten‘, wie heissen Tiefseequellen, Polareis oder in tiefen Erdschichten zu suchen, um fündig zu werden. Sogar vor der eigenen Haustür, wie zB Bodenproben aus der näheren Umgebung, zeugen von einer grossen prokaryontischen Vielfalt. Wie kann man nun Bakterien untersuchen und gegebenenfalls nutzbar machen, die mit gängigen Kultivierungsversuchen nicht anziehbar sind sind? Am Beispiel des marinen Schwammes Aplysina aerophoba (10 8 Bakterien / g Schwamm, davon < 0.15% kultivierbar) werden wir eine 16S rDNA Genbank anlegen, die dann zur Beschreibung der mikrobiellen Vielfalt in weiterführenden Experimenten genutzt werden kann. Als Matritze für die PCR dient die extrahierte genomische Gesamt-DNA des Schwammgewebes von A. aerophoba. Dieses, als Metagenom bezeichnetes DNA Gemisch, umfasst sowohl eukaryontische Schwamm DNA, als auch prokaryontische DNA der mit A. aerophoba assoziierten Bakterien. Durch die PCR wird eine Vielzahl unterschiedlicher 16S rRNA Gene amplifiziert. Durch eine anschliessende Klonierung des Amplikons werden die einzelnen unterschiedlichen 16S rRNA Gene separat in den Vektor „pGEM-T easy“ ligiert und in E. coli K12 Novablue transformiert. Im sich anschliessenden ‚Blue-white-screen’wachsen die transformierten E.coli Zellen nun weiß oder blau. Dies liegt daran, dass die Insertionsstelle auf dem Plasmid in einem lacZ Gen liegt. Enthält das Plasmid ein Insert, so kann keine β-Galaktosidase mehr gebildet werden. Diese Kolonien wachsen weiß. Klone, deren Plasmid kein Insert enthält, die also β-Galaktosidase expremieren können, wachsen blau und sind für den weiteren Versuch uninteressant. Da die weiterführenden Experimente den Rahmen dieses Praktikums sprengen würden, sind sie hier der Vollständigkeit halber erwähnt, werden aber nicht praktisch durchgeführt.Von ausgewählten weissen Klonen würde dann eine Plasmid DNA Extraktion erfolgen, die dann als Matrize für eine Sequenzierung der einzelnen, in den Vektor inserierten 16S rRNA Gene dient. Die abschliessenden phylogenetischen Analysen und Baumrechnungsverfahren liefern die Information über die phylogenetische Zugehörigkeit und über die Diversität der in einer Probe vorhandenen Bakterien. Einschränkend sei zu bemerken, dass aus der mengenmässigen Verteilung bestimmter Klone in einer Genbank keine Rückschlüsse auf das tatsächliche quantitative Vorkommen der entsprechenden Organismen in deren Habitat gezogen werden dürfen. So können zum Beispiel geringfügig vertretende Matritzen während einer PCR nicht erfasst werden, was besonders bei der Anwendung hoher PCR Zyklusanzahlen der Fall sein kann. Ebenso können bestimmte Matritzen bevorzugt amplifiziert werden und so zu einer unnatürlich hohen Klonabundanz in einer 31
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