F1- Praktikum Mikrobiologie Block N: Molekulare mikrobielle Ökologie

Protokoll:
- die Schwammprobe 1:10 mit steril-filtriertem, artefiziellem Meerwasser (ASW) in 15
ml Falconröhrchen verdünnen
- die Probe in den Mörser überführen und zermörsern
- den Schwammextrakt durch ein Nitex-Netz gießen, um Gewebereste zu entfernen
der so erstellte Schwammextrakt wird, wie folgt, aufgearbeitet:
(a) Bestimmung der Gesamtzellzahl:
- Schwammextrakt mit 3.7% Formaldehyd (Endkonzentration) für mindestens 2
Stunden fixieren: 900µl Schwammextrakt + 100µl Formaldehyd (37%)
- aus dem Extrakt Verdünnungen von 10 -1 – 10 -3 mit ASW erstellen
- Jede Verdünnung mit 0.7 µg/ ml DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole)
Endkonzentration für 30 min in der Dunkelheit (z.B. Schublade) anfärben
- Den angefärbten Extrakt zu 9 ml sterilfiltriertem ASW hinzugeben und auf 0.2 µm
Polykarbonatfilter mit der Vaccumpumpe vorsichtig applizieren (siehe Betreuer!)
- den Filter mit H 2 O und anschließend mit 70% Ethanol waschen
- den Filter mit der Bakterienseite nach oben auf einen Objektträger legen und mit
Citifluor und Deckgläschen eindeckeln
- Unter dem Epifluoreszenzmikroskop bei 100x Vergrößerung und unter Nutzung des
Zählfensters auszählen
- Die Bakterienzellzahl im Ausgangsmaterial unter Berücksichtigung der
Verdünnungen berechnen
(b) Bestimmung der kultivierbaren Bakterienfraktion:
- aus dem Extrakt Verdünnungen von 10 -1 – 10 -3 mit ASW erstellen, je 1 ml
- 3 x 100 µl jeder Verdünnungsstufe auf Zobell- und LB-Agar ausplattieren
- nach 2 Tagen die Anzahl an Bakterien pro Platte auszählen
- Die Anzahl an kultivierbaren Bakterien im Ausgangsmaterial unter Berücksichtigung
der Verdünnungen berechnen
20