线粒体证据揭示秦陵修陵劳工的来源 - 现代人类学通讯

袁 媛 等 : 线 粒 体 证 据 揭 示 秦 陵 修 陵 劳 工 的 来 源
研 究 报 告
达 76 米 , 陵 园 有 内 外 两 重 城 垣 , 内 城 周 长
3840 米 , 外 城 周 长 6210 米 。 内 外 城 廓 有 高
约 8-10 米 的 城 墙 , 今 尚 残 留 遗 址 。 秦 始 皇 陵
是 中 国 历 史 上 第 一 个 皇 帝 陵 园 , 其 巨 大 的 规
模 、 丰 富 的 陪 葬 物 居 历 代 帝 王 陵 之 首 ; 古 埃
及 金 字 塔 是 世 界 上 最 大 的 地 上 王 陵 , 而 中 国
秦 始 皇 陵 是 世 界 上 最 大 的 地 下 皇 陵 。1974 年
春 , 在 秦 始 皇 陵 坟 丘 东 侧 1.5 公 里 处 , 当 地
农 民 打 井 , 无 意 中 挖 出 一 个 陶 制 武 士 头 。 后
经 国 家 有 组 织 的 发 掘 , 终 于 发 现 了 震 惊 全 世
界 的 秦 始 皇 陵 兵 马 俑 。 兵 马 俑 坑 是 秦 始 皇 陵
的 陪 葬 坑 , 位 于 陵 园 东 侧 1500 米 处 。 现 已 发
掘 3 座 , 俑 坑 坐 西 向 东 , 呈 “ 品 ” 字 形 排 列 ,
坑 内 有 陶 俑 、 陶 马 8000 多 件 , 还 有 4 万 多 件
青 铜 兵 器 , 被 誉 为 “ 世 界 第 八 大 奇 迹 ”。1987
年 , 联 合 国 教 育 、 科 学 文 化 组 织 , 把 秦 始 皇
陵 列 入 世 界 文 化 遗 产 保 护 目 录 , 成 为 全 人 类
的 共 同 财 富 。
通 过 生 物 学 研 究 分 析 秦 俑 坑 附 近 出 土 的
秦 代 劳 工 遗 骸 , 无 疑 有 助 于 了 解 秦 俑 和 秦 陵
建 造 者 的 来 源 , 进 而 使 我 们 对 秦 代 历 史 有 更
多 更 直 接 的 理 解 。 本 项 研 究 就 是 通 过 古 代
DNA 研 究 来 分 析 这 批 遗 骸 的 族 属 情 况 。 古 代
DNA 是 指 保 留 在 古 代 生 物 遗 骸 和 遗 迹 中 的
遗 传 物 质 , 是 一 种 重 要 的 遗 传 资 源 。 近 年 来
人 类 遗 传 学 及 人 类 基 因 组 研 究 的 迅 速 发 展 ,
促 生 了 在 DNA 分 子 水 平 上 研 究 人 群 的 遗 传
学 特 征 的 方 法 , 即 分 子 人 类 学 。1997 年 ,
Krings 等 [1] 从 尼 安 德 特 人 (Homo neanderthalensis)
化 石 中 成 功 地 提 取 了 mtDNA 片 段 ,
并 进 行 PCR 扩 增 和 测 序 , 同 全 世 界 1600 例
现 代 人 的 mtDNA 进 行 比 较 之 后 , 得 出 尼 安 德
特 人 与 现 代 欧 洲 人 没 有 直 接 的 继 承 关 系 , 只
是 现 代 人 的 旁 系 远 亲 而 非 直 系 祖 先 , 支 持 非
洲 起 源 假 说 。 这 是 古 DNA 研 究 用 于 人 类 学 研
究 的 里 程 碑 事 件 。 其 中 , 线 粒 体 DNA(mtDNA)
位 于 线 粒 体 中 , 母 系 遗 传 , 是 闭 合 的 环 状 双
链 DNA 分 子 。 人 类 的 mtDNA 由 16569 个 碱
基 对 组 成 , 其 中 非 编 码 区 里 含 有 三 个 高 变 区 ,
分 为 HVRI (16024-16400)、HVRII(44-340)、
HVRIII (438-576)。 利 用 mtDNA 多 态 性 遗 传
标 记 来 追 溯 人 类 群 体 起 源 迁 移 事 件 发 生 的 大
致 时 间 及 路 线 , 成 为 人 类 进 化 研 究 的 重 要 手
段 。
一 、 材 料 与 方 法
1. 墓 葬 人 骨 材 料
我 们 从 陕 西 考 古 所 获 得 了 所 有 121 份 个
体 的 样 本 , 形 态 学 分 析 表 明 这 些 样 本 均 来 自
不 同 个 体 。 我 们 随 机 选 取 了 50 个 样 本 进 行
DNA 分 析 , 人 骨 样 品 主 要 是 肢 骨 残 段 。
2. 实 验 方 法
DNA 提 取 : a) 去 污 染 预 处 理 : 在 股 骨 中
段 取 1cm×2cm 的 骨 片 , 打 磨 去 除 表 面
1-2mm; 漂 白 液 浸 泡 、 无 水 乙 醇 清 洗 后 , 空
气 干 燥 ; 置 于 256nm 紫 外 灯 下 照 射 。b) 样 品
的 粉 碎 : 用 SPEX Sample Prep Freezer/
Mills6750 粉 碎 处 理 过 的 骨 片 。c)DNA 抽 提 :
DNA 抽 提 步 骤 按 照 Rohland 和 Hofreiter[2] 所
描 述 。
PCR 扩 增 : a)25μl 的 PCR 体 系 :1U rTaq
聚 合 酶 (Takara),200μM dNTP,1.5mM Mg 2+ ,
1μM 引 物 ( 表 1),1μg BSA(Takara) 以 及 4μl
的 DNA 抽 提 液 。b)PCR 程 序 :94°C 预 变 性
15min,45 个 循 环 (94°C30s,52°C30s,72°C30s),
72°C 延 伸 7min。c)PCR 产 物 鉴 定 :5μl PCR
产 物 通 过 2% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 , 条 带 单 一 且
长 度 准 确 的 PCR 产 物 被 用 于 后 续 操 作 。
PCR 产 物 直 接 测 序 : 所 得 PCR 产 物 , 首
先 通 过 直 接 测 序 初 步 了 解 其 DNA 的 序 列 情
况 。a)PCR 产 物 纯 化 :1.5-2μl(10ng) 的 PCR
产 物 与 0.1U 虾 碱 磷 酸 酶 (Shrimp Alkaline
Phosphatase,SAP) 和 1.25U 外 切 酶 (ExonI) 混
合 后 ,37℃ 孵 育 80min,80℃15min 变 性 失 活
酶 。b) 测 序 反 应 : 使 用 Big Dye Terminator kit
(Applied Biosystems), 程 序 为 96℃10s 预 变
性 ,25 个 循 环 (96℃10s,50℃5s,60℃90s),
60℃ 延 伸 4min; 测 序 引 物 为 相 应 的 PCR 引
物 。
克 隆 测 序 : 直 接 测 序 得 到 的 序 列 信 息 不
能 真 实 地 反 应 古 代 样 品 中 DNA 的 序 列 , 要 获
得 可 靠 的 序 列 信 息 , 需 要 进 行 克 隆 测 序 。
a)PCR 产 物 纯 化 、 连 接 : 使 用 AxyPrep PCR
Clean-up Kit(Axygen) 纯 化 PCR 产 物 , 所 得 产
物 5μl 与 5μl 的 Solution1 和 0.5μ 的 pMD18-T
Simple Vector(Takara) 混 合 ,4℃ 放 置 过 夜 。
b) 克 隆 : 氯 化 钙 法 制 备 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 ,
转 化 , 活 化 , 平 皿 培 养 过 夜 。c)PCR 鉴 定 克
101