(log ppb) HPRT VF (x 10

TOXICOLOGY 

Introductory Course 

Dr. Robert Landsiedel 

University Koblenz-Landau 

2008/2009

Toxicokinetics 

Metabolism

Fremdstoffe im Körper 

Das “Lipophilie Problem” des Körpers: 

Lipophile Stoffe werden leicht aufgenommen 

aber nur schwer wieder ausgeschieden 

Das “Vielfältigkeits Problem” des Körpers: 

viele verschiedene Fremdstoffe aber nur relativ wenige Enzyme

Fremdstoffmetabolismus 

Funktionalisierungsreaktionen (Phase I Metabolismus ) 

Oxidation 

Reduktion 

Hydrolyse 

Konjugationsreaktioenen (Phase II ) 

Glucuronidierung und Sulfonylierung 

Acetylierung 

Glutathionkonjugation 

Aminosäurekonjugation 

Methylierung

Enzymsysteme 

Lipophiler 

Fremdstoff 

Funktionalisierung 

Pharmakologisch 

aktiv 

Beispiel: Paracetamol 

H 

N 

OH 

O 

CH 3 

Funktionalisierter 

Metabolit 

(mitunter reaktiv!) 

O 

N 

CH 3 

O 

reaktives Cinon-Imin 

Konjugation 

Hydrophiles 

Ausscheidungsprodukt 

Pharmakologisch 

inaktiv 

H 

N 

O 

OGlucuronid 

CH 3

Leber als Hauptorgan 

des Fremdstoffmetabolismus 

Schematische Wiedergabe zweier Sinusoide mit Blutgefäßversorgung 

und Gallengang

Leber als Hauptorgan 

des Fremdstoffmetabolismus 

Aufnahme und Abgabe von Fremdstoffen in die und aus der Leber 

• Leberkapillaren: transportieren Blut von 

Pfortader zu Leberzelle 

• durch Mikrovilli große Oberfläche der 

Leberzelle 

• gute Stoffaufnahme aus dem Blut 

In der Leberzelle veränderte Fremdstoffe: 

Abgabe in Blut oder Galle 

� Kriterium: Substratspezifität für 

Gallentransporter und Molekulargewicht. 

� Gallengängigkeit ist speziesabhängig: 

Ratte: 320 

Meerschweinchen: 400 

Kaninchen: 470 

Mensch: 470

hoch lipophil, 

metabolisch stabil 

Akkumulation im 

Körperfett 


Xenobiotikum 

lipophil polar hydrophil 

polar 

Konjugation 

hydrophil 

(Aktiver) Transport aus der Zelle 

(Phase 3) 

Plasmazirkulation 

biliäre Exkretion 

renale Exkretion 

Beispiele 

DDT 

Vitamin C 

Salicylsäure 

PAK 

Meistens Mischwege

FUNKTIONALISIERUNG

Cytochrome P450 

(CYP family genes) 

• Oxidizes substrates 

• Most versatile Phase 1 family of 

enzymes with the greatest number 

of substrates 

• There are > 1000 isoforms in ~74 

families, also subdivided into 

subfamilies 

• 3A4, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, and 

1A2 are by far the most 

prevalent in drug 

biotransformation 

• Found everywhere, but 

concentrated in hepatic microsomes

Cytochrom P450 

R-H + O 2 + NADPH + H + 

R-OH + H 2 O + NADP +


Zyklus der Oxidation eines Fremdstoffes R-CH 3 

Einzelschritte (vereinfacht) 

I Bindung des Fremdstoffes an Häm 

II Übertragung eines Elektrons 

(Reduktion eines Fe 3+ zu Fe 2+) 

III Bindung von O 2 

(Übertragung eines zweiten Elektrons) 

IV Abspaltung von H 2 O 

Bildung eines hoch reaktiven 

Ferryl-Sauerstoff-Komplexes (Fe V = 0) 

Insertion eines Sauerstoffs 

in das Substrat


CYP450 

Class 

CYP1 

CYP2 

CYP3 

A1, A2 

A6, B6, C8, C9, C19, 

D6, E1 

Inducible 

Isoforms 

A4 

Example Substrates 

PAHs, Acetaminophen, Caffeine, Estradiol, 

Warfarin 

Butadiene, Nicotine, Taxol, Diclofenac, Warfarin, 

Diazepam, Codeine, Dextromethorphan 

Inhibitible 

Acetaminophen, Aldrin, Cyclophosphamide, 

Diazepam, Digitoxin, Erythromycin, Steroids, 

Loratadine


Fremdstoff 

Induziertes P-450- 

Enzym 

Tabakrauch CYP1A1 

Tabakrauch 

Indolverbindungen in Kohl 

CYP1A2 

Alkohol CYP2E1 

Arzneimittel: 

z.B. Barbiturate 

Cytochrom P-450 abhängige Monooxigenasen: Charakteristika 

Fremdstoff 

SKF525A (Proadifen) 

CYP2Bn 

CYP3A4 

Induziertes P-450- 

Enzym 

Universelle Inhibitisten 

aller CYPS 

Naphtoflavon 1A1 – 1A2 

Ketoconazol 3A4 

� Speziesunterschiede in den 

Isoenzymaktivitäten 

� modulierende Faktoren 

innerhalb einer Spezies: 

Geschlecht, Alter, genetische 

Variabilität 

� Induzierbar 

Fremdstoffe, die CP-450- 

Enzyme induzieren: 

� Hemmbar 

Fremdstoffe, die CP-450- 

Enzyme inhibieren


Oxidative 

Desalkylierung 

Oxidative 

Desaminierung 

Cytochrom P-450 katalysierte Oxidationen 

Hydroxylierung von 

Aliphaten 

Oxidative 

Desulfierung 

Cytochrom 

P-450 

Hydroxylierung von 

Aromaten 

Epoxidierung von 

Aromaten 

Epoxidierung von 

Alkenen und Alkinen 

Oxidation von Heteroatomen 

(N, S) 

Oxidation durch CYP an welchen Positionen ? 

• sterisch zugänglich 

• Eisen Oxokomplex: stark elektrophil � greift elektronenreiche Positionen an

Cytochrom P450


• Cytochrome P450 2A6 

• Microsomal (endoplasmic reticulum) 

• Biotransforms Coumarin 

O O HO 

O O 

CYP2A6 

Coumarin 7-hydroxycoumarin

Coumarin and Stroke 

• Coumarin 

• Interferes with blood clotting 

• Used in stroke patients and those at risk for stroke 

• Polymorphisms in CYP2A6 

• Deletions, regulatory 

What are the possible consequences? 

What are the possible solutions?


Benzo[a]pyrene 

HC CH 2 HC CH 2 

Styrene Styrene oxide 

H 

O 

H 

O 

Benzo[a]pyrene 

7,8-oxide

Cytochrom P450


N-Hydroxylierung aromatischer Amine


CYP: Oxidative Desulfurierung von 

Thioketonen und Thiophosphorverbindungen


TAKE HOME MESSAGE CYP 

CYP abhängige Monoxigenierungen sind von vorrangiger 

Bedeutung für die Biotransformation von Fremdstoffen: 

• Sie sind meist geschwindigkeitsbestimmend 

für den Gesamtmetabolismus eines Fremdstoffes 

• Sie werden durch Enzymfamilien unterschiedlicher oft überlappender 

Spezifität katalysiert: 

viele organische Fremdstoffe können oxidiert werden 

• Der höchste Umsatz insgesamt findet in der Leber statt, 

viele extrahepatische Organe (Gewebe) haben ebenfalls 

metabolische Kapazität 

(innerhalb der Zelle sind CP-450 Enzyme v.a. im glatten ER lokalisiert

Monoamine oxidase 

• Monoamine Oxidase (MAO) 

• Membrane bound 

• Uses NADPH as a source of reducing equivalents 

• Found in the endoplasmic reticulum and in mitochondria, of 

nerve endings and liver 

• Biotransforms 5-Hydroxytryptamine

MAO Inhibitors 

• 5-Hydroxytryptamine (Serotonin) 

• Neurotransmitter 

• Formed from tryptophan 

• Found mostly in the gut (90%), also in the CNS 

• Phenelzine® 

• MAO Inhibitor 

• Antidepressant 

Pharmacological action? 

Any potential side effects? 

Foods high in tyramine content (foods that are aged or fermented) 

Increases blood pressure 

Solution – SSRIs (Paxil®, Zoloft®)

Flavinabhängige Monooxigenasen 

(FMO) 

nicht CYP-abhängige Oxidationen 

• oxidieren sek. Und tert. Amine, Hydrazine und organische Thioverbindungen 

• sind in ER lokalisiert 

• die Oxidation des Substrates RH erfolgt durch Peroxid: ein Sauerstoff wird auf den 

Fremdstoff übertragen

Flavin monooxygenase 

• Flavoprotein 

• Mixed-function amine oxidase 

• Located in smooth endoplasmic reticulum, in human, pig, 

rabbit liver, guinea-pig lung, human kidney 

• Uses NADPH as a source of reducing equivalents 

• Not inducible

Alkoholdehydrogenase (ADH) 

Oxidation durch Dehydrogenasen (Dehydrogenierung) 

• cytosolisches Leberenzym, NAD-abhängig, 

• Oxido-Reduktase, Zn 2+ -abhängig 

• geringe Substratspezifität (katalysiert auch Rückreaktion) 

R-CH 2 -OH + NAD + → R-CHO + NADH + H + 

Alkohol Aldehyd

Alkoholdehydrogenase (ADH)

Alkoholdehydrogenase (ADH)

Aldehyddehydrogenase (ALDH)

Aldehyddehydrogenase (ALDH) 

Hemmung der Aldehyddehydrogenase: 

durch Coprin 

HO 2 C 

NH 2 

O 

HO 

N 

H

Andere nicht-CYP Oxidationen 

Prostaglandin-H-Synthetase (PGS) 

� oxidiert eine Vielzahl unterschiedlicher Fremdstoffstrukturen: 

aromatische Amine, polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, 

Phenole, Aminophenole 

� kommt in Epithelzellen z.B. Niere, Haut vor 

� Peroxidaseaktivität: reduziert Prostaglandin G 2 (PGG 2 ) zum Alkohol (PGH 2 ), 

dabei werden Fremdstoffe (RH) in Ein-Elektronenschritten oxidiert 

H 2 O 2 -abhängige Peroxidasen (POD) 

� oxidieren Phenole, aromatische Amine, Aminophenole, Thiolverbindungen 

� kommen in vielen extrahepatischen Geweben vor

Zusammenfassung: 

Oxidativer Fremdstoffmetabolismus 

Fremdstoffe als Substrate oxidierender Enzyme (Überblick): 

Stoffgruppe 

Alkane 

Alkene 

Aromaten, benzoid 

Aromaten, polycyclisch 

Alkohle 

Aldehyde 

Phenole 

Amine, primär 

Amine, sekundär 

Amine, tertiär 

N-Methylaniline 

(N-Demethylierung 

Hydrazine 

Thioverbindungen 

CYP 

450 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

Enzyme 

FMO MAO POD PGS ADH AIDH 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

(+) 

+ 

+ 

- 

FMO flavinabhängige Monooxygenase 

MAO Monaminoxidase 

POD H 2 O 2 abhängige Peroxidase 

+ 

+ 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

+ 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

+ 

+ 

+ 

- 

- 

- 

+ 

- 

- 

+ 

+ 

- 

- 

+ 

+ 

+ 

- 

+ 

- 

+ 

- 

- 

- 

- 

+ 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

PGS Prostaglandin-H-Synthetase 

ADH Alkoholdehydrogenase 

AIDH Aldehyddehydrogenase 

- 

- 

- 

- 

- 

+ 

- 

- 

- 

- 

- 

- 

-

Reduktion 

• von Halogen-Alkanen durch klassische mikrosomale Enzymsysteme CYP450: 

� Übertragung eines Elektrons von Fe 2+ auf das Substrat (anstatt auf Sauerstoff) 

Beispiel: Reduktion von Tetrachlorkohlenstoff

Reduktion 

Reduktive Spaltung

Reduktion

Hydrolyse 

Hydrolyse von Carbonsäureestern 

Esterasen 

Interatkion mit 

Organophosphaten 

A-Esterasen Substrat Arylester 

B-Esterasen 

Carboxylesterasen / 

Amidasen 

Acetylcholinesterase 

Pseudocholinesterase 

Inhibition 

C-Esterasen Keine Interaktion Acetylester 

Bevorzugte Substrate 

Aliph. (und arom.) 

Ester/Amide 

Acetylcholin 

Carbonsäureester(amide) 

Ester, quaternäre 

Ammoniumionen

hoch lipophil, 

metabolisch stabil 

Akkumulation im 

Körperfett 


Xenobiotika 

lipophil polar hydrophil 

polar 

Konjugation 

hydrophil 

(Aktiver) Transport aus der Zelle 

(Phase 3) 

Plasmazirkulation 

biliäre Exkretion 

renale Exkretion 

Beispiele 

DDT 

Vitamin C 

Salicylsäure 

PAK 

Meistens Mischwege

KONJUGIERUNG 

Xenobiotika 


(Phase I) 

Glucuronyltransferasen 

Glucuronidierung Glucuronid 

Sulfotransferasen 

Acetylierung Acetat 

Acetyltransferasen 

Sulfatierung Sulfat 

Phase 1-Metabolit 

Konjugationsreaktion 

Phase II 

Phase 2-Metabolit 

Glutathiontransferasen 

Glutathionkonjugation Mercaptursäure 

AS-N-Acyl-transferasen 

Aminosäurekonjugation AS-Konjugat 

Methyltransferasen 

Methylierung Methylether

Glucuronidierung 

UDP-Glucuronosyltransferasen (UGT) 

Glucuronosyltransferasen bilden eine Superfamilie aus 2 Familien (UGT1 und UGT2) 

UGT1 : bisher 4 Isoenzyme (human) 

UGT2 : 2 Unterfamilien UGT2A und UGT2B 

UGT2A: bisher 1 Isoenzym 

u.a. Glucuronidierung von Phenolen (z.B. 4-Methylumbelliferon) 

UGT2B: mehrere Isoenzyme, Glucuronidierung von Steroiden und Fremdstoffen. 

Bildung aktivierter Glucuronsäure (UDPGA) 

HOH HOH2C 2C 

O 

OH + 

HO O 

OH 

P 

UTP 

UDPG + 2 NAD + + H 2O 

HOH2C O 

OH 

HO O 

OH 

HOOC 

O 

OH 

HO O 

OH 

P P O 

α-D-Glucose-1-P UDP-α-Glucose (UDPG) 

O 

H2C O N 

HO OH 

+ 2 NADH + 2 H 

UDP 

+ 

UDP-α-Glucuronsäure (UDPGA) 

NH 

O 

+ 

P P



Glucuronidierung von Phenolen, Carbonsäuren und Aminen 

HOOC 

O 

H 

HOOC 

O O 

H 

N 

OH 

HO O 

OH 

+ HO 

UDP 

N 

C 

O 

CH3 OH 

HO 

OH 

O 

C CH3 + UDP 

UDPGA Paracetamol p-Hydroxyacetanilid-β-glucuronid 

(Ether-Typ) 

O 

UDPGA + C 

HO 

UDPGA + H 2N 

Benzoesäure 

Anilin 

HOOC 

OH 

HO 

O O 

OH 

O 

C 

+ UDP 

Benzoylglucuronid (Ester-Typ) 

HOOC 

O NH 

OH + UDP 

HO 

OH 

Anilinglucuronid



Glucuronidierung: Verschiedene Klassen von Glucuroniden 

Typ des Glucuronids 

O-Glucuronid 

Ethertyp 

Estertyp 

N-Glucuronid 

S-Glucuronid 

C-Glucuronid 

Stoffklasse des Fremdstoffes 

Alkohol, Phenol 

Carbonsäure 

Carbamat 

aromatisches Amin 

Sulfonamid 

aromatisches Thiol 

Dithiocarbaminsäure 

1,3 Dicarbonyl-verbindungen



• Die Glucuronidierung ist die bedeutendste Konjugationsart 

•mit vielen funktionellen Gruppen möglich (-OH, -NH 2 , -SH, -COOH) 

• katalysiert durch Glucuronosyltransferasen 

• Glucuronide sind gut wasserlöslich und gut ausscheidbar 

• Eventuelle Instabilitäten gebildeter Glucuronide bedingen mögliche Toxizität 

• Glucuronidierung ist meistens detoxifizierend

Sulfatierung 

“Sulfatierung” - Sulfonierung 

� “Sulfatierung” ist als Phase II-Reaktion katalysiert durch Sulfotransferasen 

� Sulfotransferasen katalysieren den Transfer des Sulfonatrests (SO 3 H) aus 3'- 

Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (PAPS; "aktives Sulfat") auf nukleophile 

Akzeptoren 

� durch die Sulfonierung von Hydroxyl-, Sulfhydryl- und Aminogruppen werden 

Sulfate, Thiosulfate und Sulfamate gebildet 

� Die Sulfokonjugate sind besser wasserlöslich und ausscheidbar als die 

Ausgangsverbindungen 

� Die Sulfokonjugation ist meist detoxifizierend (Toxifizierung ist aber auch möglich) 

� Der “Sulfatrest” stammt vor allem aus schwefelhaltigen Aminosäuren 

- die Menge an aktiviertem Sulfat ist beschränkt 

- als Phase II-Konjugationsreaktion kann die “Sulfatierung” bei höheren Dosen von 

Fremdstoffen erschöpft werden

Acetylierung 

H3C C 

O 

S CoA + R NH 2 

Acetyl-CoA 

NH 2 

SO2 NH2 + 

H3C C 

O 

S CoA 

Sulfanilamid Acetyl-CoA 

Acetylierung: Acetyltransfer 

• auf den Stickstoff von primären Aminen, Arylaminen, Hydrazinen, 

Hydraziden (N-Acetyltransfer) 

• auf den Sauerstoff von Hydroxylaminen (O-Acetyltransfer) 

• Transfer der Acetylgruppe (N,O-Acetyltransfer und N,N-Acetyltransfer) 

Acetylierung von Aminen und Amiden 

- CoA-SH 

R N C CH3 

H 

O 

H 

N 

O 

C 

SO2 NH2 CH 3 

+ CoA SH 

Coenzym A 

NH 2 

+ + 

SO 2 

H 

N 

O 

C 

H 

N 

C 

O 

CH3 H 

N 

SO 2 

C 

O 

CH 3 

CH 3

Acetylierung 

Acetylierung ist als Phase II-Reaktion katalysiert durch Acetyltransferasen: 

Der Mechanismus des enzymatischen Acetyltransfers verläuft sequenziell: 

1) Transfer der Acetylgruppe aus AcCoA auf das Enzym 

2) Bindung des Substrats 

Acetylierung: Acetyltransfer 

3) Transfer der Acetylgruppe auf das Substrat 

4) Dissoziation des acetylierten Substrats vom Enzym 

AcCoA + AT Ac-AT + CoA 

Ac-AT + S Ac-S + AT

Acetylierung 

N-Acetyltransferasen 

Acetylierung: Acetyltransferasen 

Mensch: zwei Acetyltransferasen: NAT-1, NAT-2 

� Unterschied in Spezifität für Acetyl-Akzeptoren 

NAT-1:monomorph: z.B. p-Aminobenzoesäure, p-Aminosalicylsäure 

NAT-2:polymorph: z.B. Isoniazid, Coffein-Metabolite, 2-Naphthylamin, 4-Aminobiphenyl, 

Benzidin, 2-Aminofluoren, N-Hydroxy-2-aminofluoren, (O-Acetylierung) 

� Acetylierte Amine sind z.T. schlechter wasserlöslich als Ausgangsstoffe 

� Acetylierung oft für Wirkungsbeendigung von Fremdstoffen verantwortlich 

� Toxikologische Rolle der Acetyltransferasen-Reaktion: 

� metabolische Aktivierung aromatischer Amine möglich (z.B. bei den Humankanzerogenen 

2-Naphtylamin, 4-Aminobiphenyl, Benzidin und 2-Aminofluoren) 

� allg. abhängig von: 

N-Acetylierung eines aromatischen Amins 

O-Acetylierung eines aromatischen Hydroxylamins

Acetylierung 

N-Acetyltransferasen 

Der Acetyliererstatus ist abhängig von der Population 

Anteil der schnellen Acetylierer in verschiedenen Ländern 

Japaner 

Chinesen 

Italiener 

Deutsche 

Ägypter 

Marokkaner 

Population 

schnelle Acetylierer 

90 % 

80 % 

51 % 

43 % 

13 % 

10 %

Aminosäure-Konjugation 

� bei der Konjugation von Carbonsäuren mit Aminosäuren wird (im Gegensatz 

zur vorher besprochenen Konjugationen) nicht das Konjugationsagens, 

sondern der Fremdstoff aktiviert 

� Carbonsäuren werden mit Hilfe von ATP in ein AMP-Derivat übergeführt und 

auf Coenzym A übertragen. Anschließend wird der Acyl-Rest mit der Amino- 

Gruppe einer Aminosäure enzymatisch konjugiert 

� Bei Nagern wird als Aminosäure häufig Glycin, beim Menschen Glutamin, bei 

Vögeln Ornithin verwendet 

� Die Aminosäurekonjugation von Carbonsäuren konkurriert mit der 

Glucuronidierung das Verhältnis dieser beiden Konjugate ist speziesabhängig 

� Beispiel ist die Bildung von Hippursäure aus Benzoesäure

Methylierung 

� Methylierung ist katalysiert durch Methyltransferasen 

� Bei der Methylierung körpereigener und körperfremder Stoffe wird die 

Methylgruppe der Aminosäure L-Methionin aus der aktivierten Form S- 

Adenosyl-L-methionin (SAM) auf Hydroxyl- und Aminogruppen übertragen 

� keine Erhöhung der Polarität aber Absenkung der biologischen Aktivität und 

chemischen Instabilität (z.B. bei Catecholen) 

� Methyltransferasen sind teils membrangebundene, teils cytosolische 

Enzyme mit unterschiedlichen Isoformen 

� Methyltransferasen werden nach ihrer Substratklasse unterschieden 

z.B. - Catechol-O-Methyltransferasen 

- Phenol-O-methyltransferasen 

- N-Methyltransferasen

Methylierung 

Methylierung von Catecholen durch Catechol-O-methyltransferase 

R 

R 

OH 

OH 

OH 

OCH 3 

+ 

+ 

HOOC 

COMT 

HOOC 

NH 2 

C 

H 

CH 2 

CH 2 

CH 3 

S 

+ 

S 

CH 2 

O 

N 

N 

HO OH 

S-Adenosyl- L-methionin 

(SAM) 

NH 2 

C 

H 

CH 2 

CH 2 

CH 2 

O 

HO OH 

N 

N 

S-Adenosyl- L-homocystein 

NH 2 

N 

N 

N 

NH 2 

N

Glutathion-S-Transferasen 

(GSH-Transferasen) 

GSH-Transferasen katalysieren die Reaktion eines elektrophilen 

Kohlenstoff-Atoms zahlreicher Metaboliten mit dem nukleophilen 

Tripeptid Glutathion 

� GSH-Transferasen kommen in vielen Geweben vor 

- membrangebunden (im endoplasmatischen Reticulum) 

- im Cytoplasma 

� Von gelösten GSH-Transferasen sind mindestens 10 Isoenzyme bekannt, 

die jeweils aus 2 Untereinheiten bestehen 

und überlappende Substratspezifität besitzen 

� Cytosolische und microsomale GSH-Transferasen sind induzierbar 

� Dreidimensionale Strukturen verschiedener GSH-Transferasen im Komplex 

mit unterschiedlichen Glutathionkonjugaten sind bekannt:



• Conjugation Reactions 

• Glutathione (GSH) 

COO - O 

CH CH 2 CH 2 C 

NH 2 

γ-glutamic acid 

N 

CH 

CH 2 

SH 

O 

C 

cysteine 

NH CH 2 COO - 

glycine



• Glutathione (GSH) 

• Reacts non-enzymatically 

• Substrates 

– Hydrophobic 

– Electrophilic 

• Catalyzed enzymatically 

• Glutathione-S-transferases 

– 5-10% of cellular protein 

Conjugates excreted 

-in bile (large conjugates) 

-in urine as mercapturic acids (small, converted conjugates)



Konjugation mit Glutathion (GSH) und Abbau zur Mercaptursäure 

- Gly 

COOH 

H 2N C H 

γ -G lu Cys Gly 

H 2 C CH 2 C 

O 

Cys 

S 

O 

NH C H 

C NH CH 2 COOH 

CH 2 

SH 

Glutathion (GSH; γ -G lu-Cys-G ly) 

O 

[O] GSH 

Cys 

Glu 

Cys 

S 

OH 

+ Ac 

OH 

H + 

O 

S 

C CH3 

Gly 

Cys 

Gly 

S 

OH OH 

- Glu 

CH 2 CH COOH 

S 

Mercaptursäure 

HN COCH 3 

+ H 2 O



H 

N 

OH 

Aktivierung 

z.B. 

O 

H 

N 

O 

N 

OH 

O 

CH 3 

CH 3 

Reaktion mit 

zellulären 

Proteinen 

O 

CH 3 

Protein 

Konjugation 

Sulfatierung 


Konjugation 

mit Glutathion 

H 

Konjugation mit Glutathion (GSH) 

N 

OH 

Sulfat 

Glucuronid 

O 

CH 3 

SG 

Mercaptursäure 

� manche Fremdstoffe können 

sowohl mit GSH, als auch mit 

zellulären Metaboliten reagieren 

� wenn nach hohen Dosen eines 

Fremdstoffes in der Leber mehr 

GSH verbraucht, als neu synthetisiert 

wird, kann die Verarmung 

an GSH zu einer Umsetzung 

mit zellulären Makromolekülen 

führen. 

� ein Beispiel ist das Auftreten 

von Leberzellnekrosen nach 

einer Überdosis Paracetamol



Papilloma nach DMBA Verabreichung: 

Einfluss von Glutathiontransferase 

Fig. 5. Tumor incidence of papillomas in mice treated with DMBA and TPA. Susceptibility of the mice to the 

tumorigenic effects of DMBA was determined by using the initiation-promotion protocol outlined in Material and 

Methods. After treatment, GstP1/P2(/) and GstP1/P2(+/+) mice were scored for papilloma numbers on a 

weekly basis, and statistical analysis was carried out by using the Statview software package (Abacus Concepts, 

Berkeley, CA). a = P < 0.0001, b = P < 0.001. 

Henderson et al, PNAS 1998

Zusammenfassung 

Konjugation 

Reaktionen 


Sulfatierung 

Glutathionkonjugation 

Acetylierung 

Methylierung 

Aminosäurenkonjugation 

Konjugationsagens 

aktivierte Glucuronsäure 

(UDPGA) 

aktiviertes Sulfat (PAPS) 

Glutathion (GSH) 

aktiviertes Acetat (Acetyl- 

CoA) 

aktiviertes Methionin (SAM) 

verschiedene Aminosäuren 

Funktionelle Gruppen 

OH (Phenole, Alkohole) 

CO2H (arom. u. aliph. Säuren) 

NH2 (arom. Amine u. Amide) 

SH (Mercaptane) 

OH (Phenole, Alkohole) 

NH2 (arom. Amine) 

elektrophile Zentren (Epoxide, 

Alkyl-, Allyl- u. Benzylhalogenide, 

Chinone) 

NH 2 (Amine, Hydrazine, 

Aminosäuren) 

OH (Phenole, Catechole) 

NH2 (aliph. u. arom. Amine 

CO 2 H (arom. u. aliph. 

Carbonsäuren)

Zusammenfassung 

Konjugation 

TAKE HOME MESSAGE: Metabolismus Phase II 

� Phase-II Reaktionen sind Konjugationsreaktionen, bei denen funktionalisierte 

Fremdstoffe, bzw. deren Phase-I Metabolite in hydrophile Konjugate umgewandelt 

werden 

� Wesentliche Phase-II Reaktionen sind: Glucuronidierung, Acetylierung, Sulfatierung, 

Glutathion-Konjugation, Methylierung und Aminosäurekonjugation 

� eine der bedeutendsten Konjugationsarten ist die Glucuronidierung 

� Die Konjugationsreaktionen sind enzymatische Prozesse – das Konjugationsagens 

wird i.d.R. durch entsprechende Transferasen übertragen 

� Phase-II Enzyme sind meist polymorph, d.h. es existieren unterschiedliche 

Geno/Phänotypen - Polymorphismen sind für interindividuell unterschiedliche 

Empfindlichkeiten gegenüber Fremdstoffen von großer Bedeutung 

� Phase-II Konjugationen sind i.w. Entgiftungsreaktionen - Metabolische Toxifizierung 

von Fremdstoffen ist aber auch möglich

• “Phase III” 

biotransformation is 

the last part of the 

metabolism and 

disposition of 

pharmacologically 

active molecules 

• Comprised of export 

enzymes which 

consume ATP/GTP to 

transport various 

conjugates across 

membranes 

EXPORT (Phase 3)

Polymorphism 

• Polymorphism: alternative alleles for genes which occur >1% of population 

• may or may not affect gene function 

• found at increased frequencies in certain populations due to nonrandom 

mating 

• CYP polymorphisms are well-characterized and categorized well for 

genetic populations 

• Example: Warfarin (anticoagulant) has a very narrow therapeutic index 

• Warfarin is hydroxylated primarily by CYP2C9 to deactivate it 

• Polymorphism in CYP2C9 (2C9*2, 2C9*3) has reduced hydroxylation 

activity and can reduce metabolism of drug, potentially causing death

Polymorphismus 

Polymorphismus: Schnelle und langsame Acetylierer 

Bei TBC-Patienten, die mit Isoniazid behandelt werden, sind die Halbwertszeiten der 

Acetylierung unterschiedlich: 

� bei 50% der Patienten beträgt die Halbwertszeit ca. 60 min 

� bei den anderen 50% ca. 180 min 

O C 

H H 

N NH2 

N 

N 

Isoniazid Acetylisoniazid 

� Polymorphismen werden durch Veränderung der Gene entsprechender Enzyme 

verursacht (Punktmutation, Deletion, Amplifikation) 

� Von einem Polymorphismus spricht man, wenn ein seltener, von der Norm abweichender 

Phänotyp in mindestens 1% der Gesamtpopulation auftritt 

� Ein Phänotyp < 1% in der Gesamtpopulation wird als "seltene Variante" ezeichnet 

O C 

N N 

H 

O 

C 

CH3

Induction of Biotransformation 

Enzymes 

• Enzymes are regulated 

• level of expression (transcription / translation) 

• level of activity 

• For metabolic enzymes a modulator is often the substrate or similarlyshaped 

molecule (containing characteristic groups 

• benzene rings 

• aldehyde moity 

• halide groups 

• One potential mechanism of drug-drug interactions

AhR-Mediated Induction of 

Biotransformation Enzymes

Drug-Drug Metabolism Interaction 

• Drugs are primarily detoxified by enzymatic reactions; enzymes 

therefore control the rate of their metabolism 

• There are thousands of drugs, but only dozens of enzymes – so 

there will be a great deal of substrate overlap 

• Example: Ketoconazole (common antifungal) inhibits hydroxylation 

activity of CYP3A4, thereby prolonging action of dozens of other 

3A4 ligands (APAP, diazepam, warfarin, steroids, verapimil), 

• Example: Flavones in grapefruit juice induce CYP3A4, shortening 

these drugs’ actions 

• Example: Phenobarbital and rifampin induce CYP3A4 and therefore 

ethinylestradiol metabolism; causing a decrease in its contraceptive 

effect

Metabolische Aktivierung 

(Giftung) 

Metabolit 1 

Metabolit 

1.1 Metabolit 

1.2 

Fremdstoff 

Ausscheidung 

Metabolit 2 

Metabolit 2.1 

? 

Entgiftung 

Giftung 

Sequestrierung

Acetaminophen 

• Reduction (NADPH-cytochrome P450 reductase) 

• Acetaminophen (Tylenol) 

H C 

N 

OH 

CH 3 

O 

CYP2E1 

CYP1A2 

CYP3A4 

N 

O 

CH 3 

C 

O 

= reactive compound

Ethanol 

• Overlap in specificity 

• Recall biotranformation of ethanol 

• Alcohol Dehydrogenase 

CH 3 CH 2 OH 

Ethanol 

ADH 

CH 3 C 

O 

H 

Acetaldehyde 

Is this the only biotransformation pathway?

Ethanol 

• Ethanol 

• Widely consumed 

• Induces (increases) the expression of CYP2E1 

• Acetaminophen (Tylenol) 

• Widely used pain reliever 

• Toxified by CYP2E1? 

What are the possible consequences? 

What are the possible solutions?

Differential Sensitivity 

• Gender Differences 

• Alcohol Dehydrogenase 

Men tolerate ethanol “better” 

than women 

WHY?

Ethnic Differences 

Genetic Polymorphism 

• Ethanol Metabolism (Aldehyde Dehydrogenase-ALDH) 

• ALDH2 finishes the job 

CH 3 CH 2 OH 

Ethanol 

CH 3 C 

O 

H 

Acetaldehyde 

CYP2E1 

ADH 

ALDH2 

CH 3 CH 

CH 3 C 

OH 

OH 

O 

OH 

Acetic Acid

Ethnic Differences 

Genetic Polymorphism 

• Ethanol Metabolism (Aldehyde Dehydrogenase-ALDH) 

• ALDH2 finishes the job? 

• ~50% of Japanese, Vietnamese, and Chinese have an inactivating 

polymorphism in ALDH2 

CH 3 C 

O 

H 

Acetaldehyde 

Facial vasodilation 

Induces nausea 

ALDH2 

CH 3 C 

O 

OH 

Acetic Acid 

CH 3 C 

O 

H 

Acetaldehyde 

Alcoholics 

and 

Disulfiram

CYP and DNA Damage 

• EROD Activity (Oxidative dealkylation) 

• 7-ethoxyresorufin → Resorufin 

• Indirect measure of CYP1A2 activity 

• DNA damage 

• Measured using DNA content estimates 

EROD activity correlates with DNA damage 

What do you conclude?

Dimethylbenzanthracene 

Aktivierung PAK 

an Hand des Beispiels von 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) 

DMBA 

Tumors 

P450 

DNA- 

ADDUCTS 

Conjugates 

(Detoxification) 

GST P 1 

mEH 

P450

Dimethylbenzanthracene 

Überlebungsrate nach DMBA-Gabe: Einfluß von CYP 1B1 

Surviving animals [%] 

100 

80 

60 

40 

20 

DMBA-survival-strip-1/12/98.dat 

Wildtype 

0 

0 50 100 150 200 

Days (after last DMBA dosage) 

CYP1B1-null 

Buters et al. PNAS 1999

Benzo[a]pyren 

CYP: Oxidation von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen 

Benzo[a]pyren

N-Nitrosamine 

CYP: Oxidative Desalkylierung

Aromatische Amine: Aminobiphenyl 

Metabolische Aktivierung aromatischer Amine am Beispiel 

4-Aminobiphenyl durch CYP1A2 und Acetyltransferasen 

4-Aminobiphenyl 

Cytochrom P4501A2rasch 

NH 2 


NH-OH 

O 

N 

4-Acetylaminobiphenyl 

CH 3 

relativ langsamCytochrom 

P4501A2 

O 

H 

CH 3 

N OH 

4-(N-Hydroxy)-biphenyl 4-(N-Hydroxy-N-acetyl)-biphenyl 


H 

N 

O 

O 

CH 3 

4-(N-Acetoxy)-aminobiphenyl 

(reaktiver N-Acetoxyester) 

Nitreniumion 

NH+

Aromatische Amine 


Langsame Acetylierer haben bei einer 

Exposition mit aromatischen Aminen 

ein erhöhtes Risiko an Harnblasen- 

Tumoren zu erkranken: 

Modell: Bei “Langsamen Acetylierern” 

werden die Aminogruppen im Molekül 

geringer acetyliert und dadurch stärker 

hydroxiliert - Resultierende 

Hydroxylamine sind im sauren Milieu der 

Harnblase instabil und setzen reaktive, 

mutagene Nitreniumionen frei 

Monooxygenasen 

(hauptsächlich CYP1A2) 

Arylamin 

rasch 

Arylhydroxylamin 

NH 2 

OH 

N 

H 

AT1, AT2 

Deacetylasen 

H 

N 

N 

H 

+ 

Aryl-nitreniumion 

OH 2+ 

Arylamid 

O 

N 

H 

CH 3

Aromatische Amine 


� Schnelle Acetylierer haben ein erhöhtes Risiko an Colonkrebs 

Modell: Faktor sind die bei der Zubereitung eiweißhaltiger Lebensmittel 

gebildeten heterocyclischen Amine: 

diskutierter Mechanismus: 

� schnelle Bildung von N-Hydroxy-Verbindungen durch CYP450 1A2 

� wegen höherer molekularer Masse: gebildete Glucuronide über Galle in den 

Darm sezerniert 

� durch bakterielle ß-Glucuronidasen werden Hydroxylamine freigesetzt 

� N-Hydroxy-Verbindungen werden im Darm durch NAT-2 gegiftet 

� Die bei O-Acetylierung von N-Hydroxy-Verbindungen entstehenden N-Acetoxyester 

sind reaktiv und zerfallen zu Nitreniumionen 

� Nitreniumionen, reagieren mit DNA-Basen und bilden DNA-Addukte

1,3-Butadien 

The Story of 1,3-Butadiene 

Environmental and Occupational Toxicants 

and 

Genetic Polymorphisms 

C 4 H 6 

C C C C 

H 

H 

H H 

H 

H

Butadien 

• BD monomer, styrene-BD polymer plants 

• Synthetic rubbers, resins, and plastics 

•Cigarette smoke, automobile exhaust, industrial 

emissions, gas formulations 

• Gas at 24°C, volatile, aromatic 

What is the route of entry?

• Oxidation of BD 

Butadien 

•Cytochrome P450 2E1 

•Forms reactive epoxides 

• Hydrolysis of epoxyBDs 

•Microsomal epoxide hydrolase 

•Forms nonreactive diols 

H 2 C 

H 2 C 

C 

H 

C 

H 

C 

C 

OH 

C 

O 

C 

OH 

C 

O 

HO 

C 

C 

C 

HO 

C 

OH 

C 

O 

C 

C 

OH

Butadien 

• Conjugation to GSH 

• Glutathione-S-transferases (T1, M1) 

•EpoxyBDs to Mercapturic acids 

•Excreted in Urine

Is Butadien Mutagenic? 

• Butadien exposure measured in plant workers 

• Gene mutations measured 

HPRT VF (x 10 -6 ) 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

1 10 100 1000 10000 

1,3-butadiene (log ppb)

Evolutionary Biotransformation 

Vertebrates 

Highly Conserved 

e.g. CYP 1A1 

• Nucleotide sequence 

• 83% between Humans and Mouse 

• Albumin at 78% 

• 63% between Fish and Mammals 

• Protein sequence 

• 89% between Humans and Mouse 

Evolutionary Rate 

0.1% / million years for Cyp1a1 

0.3% / million years for Albumin


Toxicant Susceptibility 

DNA Sequence Variation lead to: 

• Amino acid substitutions 

• Catalytic 

• Stability 

• Genomic deletions 

• Loss of Function 

• Regulatory differences 

• Altered transcription



• Microsomal epoxide hydrolase 

• Amino acid substitutions 

•Lower activity (60%) 

•Elevate activity (125%)




• Lower activity (60%) 

• Exposure to BD 

What happens to exposed people with low activity mEH?

Differential Sensitivity 

• Gender Differences 


•Male mice express more enzyme than females 

Would you predict that female 

mice are more sensitive to BD 

than male mice?


25 

20 

15 


5 

0 



Low Activity 


1,3-butadiene (log ppb) 


25 

20 

15 


5 

0 

Normal Activity 


1,3-butadiene (log ppb)

Metabolism Studies: 

Liver in vitro metabolism systems 

Model 

Isolated perfused 

liver 

Liver slices 

Hepatocytes 

Liver cell lines 

Subcellular fractions 

Genetically 

engineered cells 


Characteristics 

Ex vivo organ culture; complete liver enzymes and cofactors; bile flow 

Closest to in vivo 

Ex vivo tissue culture; complete liver enzymes and cofactors; cell-cell 

interactions, cryopreservation limited - Close to in vivo, 

Ex vivo cell culture; from livers or biopsies; complete liver enzymes 

and cofactors; cryopreservation possible – Cell culture 

In vitro cell culture; variable enzyme spectra; enzyme activities 

limited; genotype instability; cryopreservation possible – Cell Culture 

Protein suspension; ER-bound and cytosolic enzymes; lack of 

cofactors; cryopreservation possible – enzyme preparation 

In vitro cell culture or protein suspension; Enzymes produced in ER 

of host cells (bacteria, yeast, mammalian cell lines or baculovirus); 

with or without cofactors – arteficial system 

Modified according to Guillouzo A (1998) Environmental Health Perspectives 106(2), 511-532. and Coecke S et al. (2006) ATLA 34, 49-84.



Metabolic stability 

Metabolic profiling 

Kinetics 

Drug-drug 

interactions 

Induction studies 

Metabolism tool for in 

vitro endpoint tests 

Applications of in vitro liver systems 

Slices 

+ 

+ 

± 

± 

+ 

± 

Hepatocyte 

s 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

± 

Liver in vitro system 

Cell 

lines 

- 

- 

± 

± 

Subcellular 

fractions 

Modified according to Guillouzo A (1998) Environmental Health Perspectives 106(2), 511-532. 

Pelkonen O et al. (2004) Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 96, 167-175. 

- 

± 

+ 

± 

+ 

+ 

- 

± 

Genetically 

engineered 

cells 

- 

± 

- 

± 

- 

±



Incorporating biotransformation into in vitro endpoint tests 

Coecke S et al. (2006) ATLA 34, 49-84



Incorporating biotransformation into in vitro endpoint tests 

Coecke S et al. (2006) ATLA 34, 49-84



Model 

Isolated perfused liver 

Liver slices 

Hepatocytes 

Liver cell lines 

Subcellular fractions 

Genetically 

engineered cells 

Liver in vitro systems: Limitations 

Limitations 

Fresh tissue needed; short-term viability (2-3h); study of one or a few 

compounds only; humans excluded; low reduction of animal numbers 

Fresh tissue needed; limited viability (~24h); damaged cells at the 

surface; marginal aeration of inner cells; slow transport; bile collection 

excluded 

Specific techniques and well-established procedures needed; Liver 

architecture lost, enzyme levels decrease during culture; batch variability 

Poor or absent enzyme expression; limited enzyme activities; genotype 

and phenotype instability; not many adequately characterised cell lines 

Microsomes contains only CYPs, FMOs and UGTs; co-factors addition is 

necessary; extrapolation to in vivo limited; induction effects excluded; 

partial metabolic profile; short-term incubation 

Limited enzyme number per experiment → pilot study needed; shortterm 

study; Extrapolation to the in vivo situation limited 

Modified according to Coecke S et al. (2006) ATLA, 34, 49-84; Guillouzo A (1998) Environmental Health Perspectives106(2), 511-532; Plant N (2004) DDT 9(7), 328- 

336; Pelkonen O et al. (2004) Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 96, 167-175



Summary 

� Liver in vitro metabolism systems exist at different levels and applicabilies, 

including studies on metabolic stability, metabolic profiling, enzyme induction/ 

inhibition and drug-drug interaction 

� Limitations: Liver in vitro systems may not provide an overall picture of the 

metabolism due to the contribution of other organs and tissues and due to the 

lack of enzymes and/or cofactors in the respective system 

� For incorporating metabolism into in vitro endpoint tests, the charactersitics of 

the test compounds and the test systems have to be taken into account, since most 

likely predictivites of „black box tests“ may be low

(log ppb) HPRT VF (x 10

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