人疱疹病毒6 型(HHV-6)酶联免疫分析( ELISA) 试剂盒使用说明书
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人 疱 疹 病 毒 6 <strong>型</strong> (<strong>HHV</strong>-6) 酶 联 免 疫 分 析 (ELISA)<br />
试 剂 盒 使 用 说 明 书<br />
本 试 剂 仅 供 研 究 使 用<br />
目 的 : 本 试 剂 盒 用 于 测 定 人 血 清 , 血 浆 及 相 关<br />
液 体 样 本 中 疱 疹 病 毒 6 <strong>型</strong> (<strong>HHV</strong>-6) 的 含 量 。<br />
实 验 原 理 :<br />
本 试 剂 盒 应 用 双 抗 体 夹 心 法 测 定 标 本 中 人 疱 疹 病 毒 6 <strong>型</strong> (<strong>HHV</strong>-6) 水 平 。 用 纯 化 的 人 疱 疹<br />
病 毒 6 <strong>型</strong> (<strong>HHV</strong>-6) 抗 体 包 被 微 孔 板 , 制 成 固 相 抗 体 , 往 包 被 单 抗 的 微 孔 中 依 次 加 入 疱 疹 病<br />
毒 6 <strong>型</strong> (<strong>HHV</strong>-6), 再 与 HRP 标 记 的 疱 疹 病 毒 6 <strong>型</strong> (<strong>HHV</strong>-6) 抗 体 结 合 , 形 成 抗 体 - 抗 原 - 酶 标<br />
抗 体 复 合 物 , 经 过 彻 底 洗 涤 后 加 底 物 TMB 显 色 。TMB 在 HRP 酶 的 催 化 下 转 化 成 蓝 色 , 并<br />
在 酸 的 作 用 下 转 化 成 最 终 的 黄 色 。 颜 色 的 深 浅 和 样 品 中 的 疱 疹 病 毒 6 <strong>型</strong> (<strong>HHV</strong>-6) 呈 正 相 关 。<br />
用 酶 标 仪 在 450nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 (OD 值 ), 通 过 标 准 曲 线 计 算 样 品 中 人 疱 疹 病 毒 6 <strong>型</strong><br />
(<strong>HHV</strong>-6) 浓 度 。<br />
试 剂 盒 组 成 :<br />
试 剂 盒 组 成 48 孔 配 置 96 孔 配 置 保 存<br />
说 明 书 1 份 1 份<br />
封 板 膜 2 片 (48) 2 片 (96)<br />
密 封 袋 1 个 1 个<br />
酶 标 包 被 板 1×48 1×96 2-8℃ 保 存<br />
标 准 品 :180ng/L 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
标 准 品 稀 释 液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
酶 标 试 剂 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
样 品 稀 释 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
显 色 剂 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
显 色 剂 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
终 止 液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
浓 缩 洗 涤 液 (20ml×20 倍 )×1 瓶 (20ml×30 倍 )×1 瓶 2-8℃ 保 存<br />
样 本 处 理 及 要 求 :<br />
1. 血 清 : 室 温 血 液 自 然 凝 固 10-20 分 钟 , 离 心 20 分 钟 左 右 (2000-3000 转 / 分 )。 仔 细 收 集 上<br />
清 , 保 存 过 程 中 如 出 现 沉 淀 , 应 再 次 离 心 。<br />
2. 血 浆 : 应 根 据 标 本 的 要 求 选 择 EDTA 或 柠 檬 酸 钠 作 为 抗 凝 剂 , 混 合 10-20 分 钟 后 , 离 心<br />
20 分 钟 左 右 (2000-3000 转 / 分 )。 仔 细 收 集 上 清 , 保 存 过 程 中 如 有 沉 淀 形 成 , 应 该 再 次<br />
离 心 。<br />
3. 尿 液 : 用 无 菌 管 收 集 , 离 心 20 分 钟 左 右 (2000-3000 转 / 分 )。 仔 细 收 集 上 清 , 保 存 过 程<br />
中 如 有 沉 淀 形 成 , 应 再 次 离 心 。 胸 腹 水 、 脑 脊 液 参 照 实 行 。<br />
4. 细 胞 培 养 上 清 : 检 测 分 泌 性 的 成 份 时 , 用 无 菌 管 收 集 。 离 心 20 分 钟 左 右 (2000-3000 转 /<br />
1
分 )。 仔 细 收 集 上 清 。 检 测 细 胞 内 的 成 份 时 , 用 PBS(PH7.2-7.4) 稀 释 细 胞 悬 液 , 细 胞<br />
浓 度 达 到 100 万 /ml 左 右 。 通 过 反 复 冻 融 , 以 使 细 胞 破 坏 并 放 出 细 胞 内 成 份 。 离 心 20 分<br />
钟 左 右 (2000-3000 转 / 分 )。 仔 细 收 集 上 清 。 保 存 过 程 中 如 有 沉 淀 形 成 , 应 再 次 离 心 。<br />
5. 组 织 标 本 : 切 割 标 本 后 , 称 取 重 量 。 加 入 一 定 量 的 PBS,PH7.4。 用 液 氮 迅 速 冷 冻 保 存 备<br />
用 。 标 本 融 化 后 仍 然 保 持 2-8℃ 的 温 度 。 加 入 一 定 量 的 PBS(PH7.4), 用 手 工 或 匀 浆 器<br />
将 标 本 匀 浆 充 分 。 离 心 20 分 钟 左 右 (2000-3000 转 / 分 )。 仔 细 收 集 上 清 。 分 装 后 一 份 待<br />
检 测 , 其 余 冷 冻 备 用 。<br />
6. 标 本 采 集 后 尽 早 进 行 提 取 , 提 取 按 相 关 文 献 进 行 , 提 取 后 应 尽 快 进 行 实 验 。 若 不 能 马 上<br />
进 行 试 验 , 可 将 标 本 放 于 -20℃ 保 存 , 但 应 避 免 反 复 冻 融 .<br />
7. 不 能 检 测 含 NaN3 的 样 品 , 因 NaN3 抑 制 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 (HRP) 活 性 。<br />
操 作 步 骤<br />
1. 标 准 品 的 稀 释 与 加 样 : 在 酶 标 包 被 板 上 设 标 准 品 孔 10 孔 , 在 第 一 、 第 二 孔 中 分 别 加 标<br />
准 品 100μl, 然 后 在 第 一 、 第 二 孔 中 加 标 准 品 稀 释 液 50μl, 混 匀 ; 然 后 从 第 一 孔 、 第 二<br />
孔 中 各 取 100μl 分 别 加 到 第 三 孔 和 第 四 孔 , 再 在 第 三 、 第 四 孔 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50μl,<br />
混 匀 ; 然 后 在 第 三 孔 和 第 四 孔 中 先 各 取 50μl 弃 掉 , 再 各 取 50μl 分 别 加 到 第 五 、 第 六 孔<br />
中 , 再 在 第 五 、 第 六 孔 中 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50ul, 混 匀 ; 混 匀 后 从 第 五 、 第 六 孔 中 各<br />
取 50μl 分 别 加 到 第 七 、 第 八 孔 中 , 再 在 第 七 、 第 八 孔 中 分 别 加 标 准 品 稀 释 液 50μl, 混<br />
匀 后 从 第 七 、 第 八 孔 中 分 别 取 50μl 加 到 第 九 、 第 十 孔 中 , 再 在 第 九 第 十 孔 分 别 加 标 准<br />
品 稀 释 液 50μl, 混 匀 后 从 第 九 第 十 孔 中 各 取 50μl 弃 掉 。( 稀 释 后 各 孔 加 样 量 都 为 50μl,<br />
浓 度 分 别 为 120 ng/L,80 ng/L ,40 ng/L,20 ng/L , 10 ng/L)。<br />
2. 加 样 : 分 别 设 空 白 孔 ( 空 白 对 照 孔 不 加 样 品 及 酶 标 试 剂 , 其 余 各 步 操 作 相 同 )、 待 测 样<br />
品 孔 。 在 酶 标 包 被 板 上 待 测 样 品 孔 中 先 加 样 品 稀 释 液 40μl, 然 后 再 加 待 测 样 品 10μl( 样<br />
品 最 终 稀 释 度 为 5 倍 )。 加 样 将 样 品 加 于 酶 标 板 孔 底 部 , 尽 量 不 触 及 孔 壁 , 轻 轻 晃 动 混<br />
匀 。<br />
3. 温 育 : 用 封 板 膜 封 板 后 置 37℃ 温 育 30 分 钟 。<br />
4. 配 液 : 将 30(48T 的 20 倍 ) 倍 浓 缩 洗 涤 液 用 蒸 馏 水 30(48T 的 20 倍 ) 倍 稀 释 后 备 用 。<br />
5. 洗 涤 : 小 心 揭 掉 封 板 膜 , 弃 去 液 体 , 甩 干 , 每 孔 加 满 洗 涤 液 , 静 置 30 秒 后 弃 去 , 如 此<br />
重 复 5 次 , 拍 干 。<br />
6. 加 酶 : 每 孔 加 入 酶 标 试 剂 50μl, 空 白 孔 除 外 。<br />
7. 温 育 : 操 作 同 3。<br />
8. 洗 涤 : 操 作 同 5。<br />
9. 显 色 : 每 孔 先 加 入 显 色 剂 A50μl, 再 加 入 显 色 剂 B50μl, 轻 轻 震 荡 混 匀 ,37℃ 避 光 显 色<br />
15 分 钟 .<br />
10. 终 止 : 每 孔 加 终 止 液 50μl, 终 止 反 应 ( 此 时 蓝 色 立 转 黄 色 )。<br />
11. 测 定 : 以 空 白 空 调 零 ,450nm 波 长 依 序 测 量 各 孔 的 吸 光 度 (OD 值 )。 测 定 应 在 加 终 止<br />
液 后 15 分 钟 以 内 进 行 。<br />
注 意 事 项 :<br />
1. 试 剂 盒 从 冷 藏 环 境 中 取 出 应 在 室 温 平 衡 15-30 分 钟 后 方 可 使 用 , 酶 标 包 被 板 开 封 后 如 未<br />
用 完 , 板 条 应 装 入 密 封 袋 中 保 存 。<br />
2. 浓 洗 涤 液 可 能 会 有 结 晶 析 出 , 稀 释 时 可 在 水 浴 中 加 温 助 溶 , 洗 涤 时 不 影 响 结 果 。<br />
3. 各 步 加 样 均 应 使 用 加 样 器 , 并 经 常 校 对 其 准 确 性 , 以 避 免 试 验 误 差 。 一 次 加 样 时 间 最 好<br />
控 制 在 5 分 钟 内 , 如 标 本 数 量 多 , 推 荐 使 用 排 枪 加 样 。<br />
4. 请 每 次 测 定 的 同 时 做 标 准 曲 线 , 最 好 做 复 孔 。 如 标 本 中 待 测 物 质 含 量 过 高 ( 样 本 OD 值<br />
大 于 标 准 品 孔 第 一 孔 的 OD 值 ), 请 先 用 样 品 稀 释 液 稀 释 一 定 倍 数 (n 倍 ) 后 再 测 定 , 计<br />
2
算 时 请 最 后 乘 以 总 稀 释 倍 数 (×n×5)。<br />
5. 封 板 膜 只 限 一 次 性 使 用 , 以 避 免 交 叉 污 染 。<br />
6. 底 物 请 避 光 保 存 。<br />
7. 严 格 按 照 说 明 书 的 操 作 进 行 , 试 验 结 果 判 定 必 须 以 酶 标 仪 读 数 为 准 .<br />
8. 所 有 样 品 , 洗 涤 液 和 各 种 废 弃 物 都 应 按 传 染 物 处 理 。<br />
9. 本 试 剂 不 同 批 号 组 分 不 得 混 用 。<br />
10. 如 与 英 文 说 明 书 有 异 , 以 英 文 说 明 书 为 准 。<br />
计 算 :<br />
以 标 准 物 的 浓 度 为 横 坐 标 ,OD 值 为 纵 坐 标 ,<br />
在 坐 标 纸 上 绘 出 标 准 曲 线 , 根 据 样 品 的 OD<br />
值 由 标 准 曲 线 查 出 相 应 的 浓 度 ; 再 乘 以 稀 释<br />
倍 数 ; 或 用 标 准 物 的 浓 度 与 OD 值 计 算 出 标<br />
准 曲 线 的 直 线 回 归 方 程 式 , 将 样 品 的 OD 值<br />
代 入 方 程 式 , 计 算 出 样 品 浓 度 , 再 乘 以 稀 释<br />
倍 数 , 即 为 样 品 的 实 际 浓 度 。<br />
( 此 图 仅 供 参 考 )<br />
试 剂 盒 性 能 :<br />
1. 样 品 线 性 回 归 与 预 期 浓 度 相 关 系 数 R 值 为 0.95 以 上 。<br />
2. 批 内 与 批 见 应 分 别 小 于 9% 和 11%<br />
检 测 范 围 :<br />
5 ng/L -150 ng/L<br />
保 存 条 件 及 有 效 期 :<br />
1. 试 剂 盒 保 存 :;2-8℃。<br />
2. 有 效 期 :6 个 月<br />
3
Human <strong>HHV</strong>-6<br />
FOR RESEARCH USE ONLY<br />
Drug Names<br />
Generic Name:Human <strong>HHV</strong>-6 ELISA Kit.<br />
Purpose<br />
This kit allows for the determination of <strong>HHV</strong>-6 concentrations in Human serum, blood<br />
plasma, and other biological fluids.<br />
Principle of the assay<br />
The kit assay Human <strong>HHV</strong>-6 level in the sample,use Purified Human <strong>HHV</strong>-6 antibody to<br />
coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add <strong>HHV</strong>-6 to wells, Combined<br />
<strong>HHV</strong>-6 antibody which With HRP labeled , become antibody - antigen - enzyme-antibody<br />
complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue<br />
color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid<br />
solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm.<br />
The concentration of <strong>HHV</strong>-6 in the samples is then determined by comparing the O.D. of the<br />
samples to the standard curve.<br />
4
Materials provided with the kit<br />
Materials provided with<br />
the kit<br />
48determinations 96 determinations Storage<br />
User manual 1 1<br />
Closure plate membrane 2 2<br />
Sealed bags 1 1<br />
Microelisa stripplate 1 1 2-8℃<br />
Standard:180ng/L 0.5ml× 1 bottle 0.5ml× 1 bottle 2-8℃<br />
Standard diluent 1.5ml× 1 bottle 1.5ml× 1 bottle 2-8℃<br />
HRP-Conjugate reagent 3ml× 1 bottle 6ml× 1 bottle 2-8℃<br />
Sample diluent 3ml× 1 bottle 6ml× 1 bottle 2-8℃<br />
Chromogen Solution A 3ml× 1 bottle 6ml× 1 bottle 2-8℃<br />
Chromogen Solution B 3ml× 1 bottle 6ml× 1 bottle 2-8℃<br />
Stop Solution 3ml× 1 bottle 6ml× 1 bottle 2-8℃<br />
wash<br />
solution<br />
Specimen requirements<br />
(20ml×20 fold)<br />
×1bottle<br />
(20ml×30 fold)<br />
×1bottle<br />
2-8℃<br />
1. serum- coagulation at room temperature 10-20 mins,centrifugation 20-min at the speed of<br />
2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.<br />
2. plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20<br />
mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If<br />
precipitation appeared, Centrifugal again.<br />
3. Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.<br />
remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of<br />
Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.<br />
4. cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container,<br />
centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the<br />
composition of cells, Dilut cell suspension with PBS(PH7.2-7.4), Cell concentration<br />
reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of<br />
intracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove<br />
supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.<br />
5
5. Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS(PH7.2-7.4), Rapidly<br />
frozen with liquid nitrogen, maintain samples at 2-8℃ after melting,add PBS(PH7.4),<br />
Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.<br />
remove supernatant.<br />
6. extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevant<br />
literature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t,<br />
specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.<br />
7. Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.<br />
Assay procedure<br />
1.Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, add<br />
Standard 100μl to the first and the second well, then add Standard dilution 50μl to the first and<br />
the second well, mix; take out 100μl form the first and the second well then add it to the third<br />
and the forth well separately. then add Standard dilution 50μl to the third and the forth<br />
well ,mix ; then take out 50μl from the third and the forth well discard, add 50μl to the fifth and<br />
the sixth well ,then add Standard dilution 50μl to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50μl<br />
from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standard<br />
dilution 50μl to the seventh and the eighth well ,mix ; take out 50μl from the seventh and the<br />
eighth well and add to the ninth and the tenth well, add Standard dilution 50μl to the ninth and<br />
the tenth well, mix , take out 50μl from the ninth and the tenth well discard(add Sample 50μl to<br />
each well after Diluting ,(density: 120 ng/L,80 ng/L ,40 ng/L,20 ng/L , 10 ng/L)<br />
2.add sample:Set blank wells separately (blank comparison wells don’t add sample and<br />
HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample<br />
dilution 40μl to testing sample well, then add testing sample 10μl (sample final dilution is<br />
5-fold), add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.<br />
3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.<br />
4.Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled<br />
water and reserve.<br />
5.washing:Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer<br />
to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.<br />
6
6.add enzyme:Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.<br />
7.incubate:Operation with 3.<br />
8.washing:Operation with 5.<br />
9.color:Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the<br />
light preservation for 15 min at 37℃<br />
10.Stop the reaction:Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue color<br />
change to yellow color).<br />
11.assay:take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and<br />
within 15min.<br />
Important notes<br />
1. The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes in<br />
the room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should<br />
be stored in Sealed bag.<br />
2. washing buffer will Crystallization separation, it can be heated the water helps dissolve<br />
when dilute . Washing does not affect the result.<br />
3. add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids the<br />
experimental error. add sample within 5 mins, if the number of sample is much ,<br />
recommend to use Volley .<br />
4. if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the first<br />
standard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilution<br />
factor.(× n× 5).<br />
5. Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.<br />
6. The substrate evade the light preservation.<br />
7. Please according to use instruction strictly, The test result determination must take the<br />
microtiter plate reader as a standard.<br />
8. All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective material<br />
process.<br />
9. Do not mix reagents with those from other lots.<br />
7
Calculate<br />
Take the standard density as the horizontal, the OD<br />
value for the vertical ,draw the standard curve on graph<br />
paper, Find out the corresponding density according to the<br />
sample OD value by the Sample curve, multiplied by the<br />
dilution multiple, or calculate the straight line regression<br />
equation of the standard curve with the standard density and<br />
the OD value ,with the sample OD value in the equation,<br />
calculate the sample density, multiplied by the dilution factor,<br />
the result is the sample actual density.<br />
This chartis for reference only<br />
Assay range<br />
5 ng/L -150 ng/L<br />
Storage and validity<br />
1.Storage: 2-8℃.<br />
2.validity: six months.<br />
8