תקציר
17.02.2015 • Views
Share Embed Flag

תקציר

תקציר

תקציר

SHOW MORE
SHOW LESS
ePAPER READ
DOWNLOAD ePAPER
shemer.mslib.huji.ac.il

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

START NOW

תקציר<br />

חישת הטעם הינה מערכת מורכבת המאפשרת לבעלי חיים לזהות ולברור מקורות מזון איכותיים בהתאם<br />

לצרכים הפיסיולוגיים ולמנוע הרעלה.‏ תאי הטעם<br />

(taste receptor cells)<br />

ממוקמים בעיקר בלשון ומרוכזים יחד ביחידות מורפולוגיות בשם פקיעיות הטעם<br />

בעצמן מאורגנות בתוך שלושה סוגים של פפילות<br />

האחראים על חישה זו<br />

buds) (taste אשר<br />

circumvallate ו-‏ folate ,fungiform :(papillae)<br />

.(CV)<br />

הקולטנים אשר אחראים על זיהוי וקשירת התרכובות המתוקות<br />

(T1Rs)<br />

והמרות<br />

(T2Rs)<br />

שבמזון התגלו לפני מספר שנים ומשתייכים למשפחה הרחבה של קולטנים התלויים בחלבון<br />

G<br />

.(GPCRs)<br />

גירוי חוש הטעם הינו תהליך מהיר אשר מסתיים תוך שניות ספורות.‏ למרות זאת,‏ טעמם של<br />

טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים נמשך לתקופות ארוכות יותר,‏ עד מספר דקות,‏ תופעה המכונה<br />

שאריתיות.‏ התחושה הלא נעימה שנגרמת כתוצאה מכך מונעת צריכה גדולה יותר של מגוון רחב של<br />

מזונות בעלי ערך תזונתי,‏ כגון ירקות המכילים טעמנים מרים או מוצרים דיאטטים המכילים ממתיקים דלי<br />

קלוריות.‏ למרות השלכותיה,‏ המנגנון המולקולרי של תופעה זו אינו ידוע.‏<br />

רבים מן התרכובות המרות והממתיקים המלאכותיים הם בעלי אופי אמפיפטי,‏ כלומר מכילים קבוצות<br />

הידרופיליות והידרופוביות במבנה הכימי שלהם.‏ מחקרים הראו כי תכונה זו מאפשרת למולקולות אלו<br />

לחדור במהירות ממברנות ליפידיות של ליפוזומים ואף ממברנות פלסמטיות של תאים ביתר קלות.‏ בנוסף,‏<br />

מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביוכימיים הראו פעילות מוגברת של תאי הטעם כתוצאה מחשיפתם<br />

לטעמנים אמפיפטיים.‏ השערת העבודה הינה שבמקביל להפעלת קולטני הטעם,‏ טעמנים אמפיפטיים<br />

חודרים את הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם.‏ בתוך ציטוזול התאים,‏ אותם הטעמנים יכולים לבוא<br />

במגע עם מרכיבים ציטוזוליים שונים,‏ ובין היתר לשבש את תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטנים ע"י<br />

עיכוב קינאזות הקשורות לכיבוי הסיגנל,‏ כגון הקינאזות ממשפחת ה-‏<br />

.(GPCR kinases) GRKs<br />

במקרה כזה,‏ על פי השערת העבודה,‏ הטעמנים האמפיפטיים גורמים לקולטני הטעם להיות פעילים<br />

ולסיגנל להימשך לזמן רב יותר,‏ ולכן גורמים לתחושת השאריתיות.‏<br />

מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים חודרים לתוך תאי טעם מפפילות<br />

CV<br />

או פקיעיות טעם<br />

מבודדות.‏ המטרה הראשונה במחקר הנוכחי היה להוכיח כי יכולת זו קיימת גם בתנאים פיזיולוגיים,‏ בהם<br />

תאי הטעם חשופים לטעמנים אך ורק מצידם האפיקלי.‏ חשיפתה של פפילת CV שלמה לתמיסות טעמנים<br />

אמפיפטיים בעלי פלואורסצנציה עצמית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי אפשר לעקוב אחר<br />

חדירתם של הטעמנים לתוך הפפילה.‏ הופעתה של פלואורסצנציה בדיוק בתעלת הפפילה,‏ בה ממוקמות<br />

מרבית פקיעיות הטעם,‏ הראתה כי הטעמנים חודרים ומצטברים בתוך פקיעיות הטעם עצמן.‏ חוסר יכולתו<br />

של מדעיך הפלואורסצנציה KI להפחית את עוצמת הפלואורסצנציה אשר התקבלה לאחר חשיפתה של<br />

פפילת ה-‏ CV לטעמנים השונים הוכיח כי אלה אכן חדרו לתוך ציטוזול התאים.‏ בנוסף,‏ הזרמת תמיסות<br />

טעמנים שונים לתוך פיה של חולדה מורדמת הובילה למציאת ריכוזים גבוהים ‏(מילימולרים)‏ של אותם<br />

הטעמנים בתוך ציטוזול תאי הטעם,‏ כפי שנקבע בעזרת<br />

.HPLC<br />

יחד,‏ תוצאות אלו תומכות לא רק<br />

1

בהשערה כי הטעמנים אכן חודרים בתנאים פיזיולוגיים לתוך ציטוזול תאי הטעם,‏ אלא מראות שבמקרים<br />

מסוימים,‏ כמו קפאין וכינין,‏ טעמנים אלה עשויים להצטבר כנגד מפל הריכוזים.‏<br />

בהמשך נבחנה נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

,GRKs<br />

האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה של<br />

קולטנים ממשפחת ה-‏ ,GPCR בתאי פקיעית הטעם של פפילת .CV תוצאות מניסוי RT-PCR הראו כי<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2<br />

GRK6 ו-‏<br />

מתבטאים בפפילת ה-‏<br />

CV<br />

עצמה אך גם באפיתל הלא-סנסורי<br />

הסמוך לה בלשון.‏ צביעה פלואורסצנטית של חתכי פפילת CV בעזרת נוגדנים המכוונים כנגד כל אחד<br />

מה-‏ GRKs הראתה שלעומת<br />

GRK5 ו-‏<br />

בעיקר בתאים הלא-סנסוריים שברקמת הפפילה.‏ רמת הביטוי של<br />

שמיקומה לא נקבע.‏<br />

מכיוון שתהליך הדסנסיטזציה של הקולטנים לטעם המתוק והמר<br />

β2AR שימש בהמשך המחקר כמודל המייצג את כלל משפחת ה-‏<br />

GRK2 אשר מתבטאים בפקיעיות הטעם עצמן,‏<br />

GRK6 נמצא<br />

,GRK3<br />

,T1Rs)<br />

.GPCRs<br />

לעומת זאת,‏ נמצאה כה נמוכה<br />

(T2Rs אינו ידוע,‏ הקולטן ה-‏<br />

על מנת להוכיח את השערת<br />

העבודה ולחקור את השפעותיהם של טעמנים אמפיפטיים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה -<br />

,β2AR<br />

בוטא הקולטן באופן מלאכותי בתאי<br />

.HeLa<br />

תאים אלו נבחרו כתאי המודל הטובים ביותר<br />

להמשך המחקר על בסיס יכולתם של הטעמנים לחדור לתוכם ולהגיע לריכוזים ציטוזוליים הדומים לאלו<br />

שנמצאו בתאי הטעם.‏ נבחנו השפעותיהן של שש תרכובות אמפיפטיות,‏ שלוש מתוקות ‏(סכרין,‏<br />

D-TRP<br />

ו-‏ ,(NHD<br />

.β2AR<br />

cAMP ה-‏<br />

ושלוש מרות ‏(קפאין,‏ נרינגין וכינין).‏ ראשית,‏ נבחנה השפעת הטעמנים על תפקוד הקולטן ה-‏<br />

חשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים השונים למשך 10 דקות גרמה להגברה משמעותית ברמות<br />

בתגובה ל-‏<br />

,(ISO) isoproterenol<br />

הראו כי הטעמנים לא פעלו כליגנדים לקוטלן ה-‏<br />

הכרחית על מנת לקבל את ההגברה ברמות ה-‏<br />

אשר נמשכה גם 2 דקות לאחר גירוי הקולטן.‏ התוצאות<br />

,β2AR<br />

,cAMP<br />

ושחדירתם לתוך ציטוזול התאים הייתה<br />

דבר אשר מוכיח כי מקור השפעת הטעמנים היה<br />

ציטוזולי ולא רצפטורלי.‏ בנוסף,‏ השפעתם של הטעמנים על רמות השליח המשני לא הייתה תלויה<br />

בפעילותם של<br />

,PDE<br />

אשר אחראי על פירוק נוקלאוטידים ציקליים בתא,‏ או של ,PKA אשר משתתף<br />

בתהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן.‏ תוצאות אלו יחד מצביעות על כך שההגברה שנראתה ברמות ה-‏<br />

cAMP בנוכחות הטעמנים נבעה מהגברה בפעילות הקולטן עצמו.‏ בהמשך,‏ נעשה שימוש בנוגדן המכוון<br />

ספציפית כנגד אתר בקולטן המזורחן ע"י<br />

GRK2 ו-‏ GRK5 בלבד,‏<br />

על מנת לעקוב אחר התקדמותו של<br />

תהליך הדסנסיטיזציה.‏ חשיפה של התאים לטעמנים השונים גרמה לא רק לעיכוב בעוצמת הזרחון של<br />

הקולטן אלא גם להשהיה בזמן הופעתו.‏ בנוסף,‏ תהליך האינטרנליזציה אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה-‏<br />

,GRKs<br />

ה-‏<br />

ומתאפיין בהחדרת הקולטן לציטוזול התאים,‏ נמצא אף הוא מעוכב בנוכחות הטעמנים.‏ עיכוב זה<br />

תורגם באחוז גבוה יותר של תאים המכילים קולטן ממברנלי ונוכחות גדולה יותר של קולטן בממברנה<br />

הפלסמטית של התאים גם 15-20 דקות לאחר גירוי הקולטן.‏ תהליך נוסף אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י<br />

.(Mitogen-activated protein kinase) MAPK הינו מסלול ה-‏ GRKs<br />

מופעל מצד אחד כתוצאה מזרחון הקולטן ה-‏ β2AR ע"י PKA אך גם לאחר קשירת<br />

הקולטן המזורחנים ע"י<br />

מסלול העברת אותות זה<br />

β-arrestin לאתרי<br />

.GRKs<br />

כתוצאה מהפעלת מסלול זה,‏ מזורחן ומשופעל<br />

.ERK<br />

הטעמנים לא<br />

2

.PKA<br />

השפיעו על רמת הזרחון הבסיסית של ERK<br />

‏,וגם לא על<br />

ב-‏ התלוי השפעול<br />

לעומת זאת,‏<br />

הם<br />

עיכבו ספציפית את השפעול התלוי במסלול ה-‏ .GRKs/β-arrestin<br />

לסיכום,‏ תוצאות עבודה זו מוכיחות את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים חודרי ממברנות<br />

מעכבים את הקינאזות ממשפחת ה-‏ GRKs ולכן משבשים את מהלך הדסנסיטיזציה של הקולטן.‏ כתוצאה<br />

מכך,‏ הטעמנים גורמים לקולטן עצמו להיות פעיל יותר לזמן ארוך יותר.‏ ייתכן ומנגנון זה יסביר בעתיד<br />

את תחושת השאריתיות המורגשת בזמן טעימת טעמנים מרים וממתיקים מלאכותיים.‏ מכיוון שקינאזות ה-‏<br />

GRKs<br />

משתתפות בדסנסיטיזציה של מגוון רחב של קולטנים,‏ ייתכן ולטעמנים האמפיפטיים השפעות<br />

רחבות יותר משל חישת הטעם עצמה.‏ למשל,‏ ידוע כי טעמנים אלה מגיעים במהירות לאפיתל המעי,‏ אשר<br />

הוכח לאחרונה כי הוא מכיל קולטנים T1Rs המעורבים בוויסות ספיגת הגלוקוז ואולי רכיבים תזונתיים<br />

נוספים.‏ בנוסף,‏ ידוע כי מספר תרכובות כגון קפאין,‏ נרינגין או סכרין יכולות להימצא בדם ובאיברים<br />

שונים בגוף מספר דקות לאחר צריכתן.‏ ייתכן כי טעמנים כאלה יוכלו להשפיע באותם האיברים על<br />

תהליכים פיזיולוגיים התלויים בקולטנים אחרים השייכים למשפחת ה-‏<br />

. GPCRs<br />

3

תוכן עניינים<br />

.1<br />

8 ........................................................................................................<br />

1.1<br />

- 1.2 חישת הטעם...........................................................................................................‏ 8<br />

9 .......................................................................................<br />

1.3<br />

10 .............................................................................<br />

- 1.4<br />

10 ................................................................................................... 1.4.1<br />

13 ................................................................................................<br />

1.4.2<br />

15 .........................................................................<br />

1.4.3<br />

16 ................................................................................................<br />

1.4.4<br />

16 ................................................................................................<br />

1.4.5<br />

17 ............................................<br />

1.5<br />

17 .........................................<br />

1.5.1<br />

1.5.2<br />

1.6<br />

20 ..................................................... GPCRs<br />

1.6.1<br />

22 ...............................................GRKs<br />

1.6.2<br />

22 ................................................................................GRK2<br />

1.6.3<br />

24 .............GPCRs<br />

1.6.4<br />

1.7<br />

28.............................................................................................................<br />

.2<br />

- 2.1 חומרים...............................................................................................................‏ 28<br />

28 .............................................................................................<br />

2.1.1<br />

- 2.1.2 נוגדנים,‏<br />

- 2.1.3 בופרים ותמיסות............................................................................................‏ 30<br />

2.2 שיטות .................................................................................................................. 32<br />

(in situ)<br />

2.2.1<br />

מבוא.............................................................................................................................‏‎8‎<br />

- חושים כימיים<br />

- אברוני חוש הטעם ביונקים<br />

מנגנונים תאיים של חישת הטעם<br />

- הטעם המר<br />

- הטעם המתוק<br />

- הטעם האוממי ‏(חומצות אמינו)‏<br />

- הטעם המלוח<br />

- הטעם החמוץ<br />

- העברת אותות בין-תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית<br />

- העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם<br />

- תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים............................‏ 18<br />

- מנגנון סיום העברת האותות ‏(דסנסיטיזציה)‏ של קולטנים מסוג ............................GPCR 20<br />

- תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

- מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

- בקרה על פעילות<br />

- שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

- חשיבות המחקר ומטרת העבודה...............................................................................‏ 24<br />

חומרים ושיטות<br />

- רשימת חומרים<br />

אנזימים,‏ חומצות גרעין וערכות.............................................................‏ 29<br />

- הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות CV שלמות תוך מעקב דינמי במיקרוסקופ<br />

קונפוקלי פלואורסצנטי...............................................................................................‏ 32<br />

- הפרדת פפילת ה-‏ CV בחולדה<br />

- הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CV וקביעת כמות חלבון..................................‏ 33<br />

- חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת CV<br />

- קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת CV בעזרת שיטת ...........HPLC 35<br />

33 .........................................................................<br />

2.2.2<br />

2.2.3<br />

vivo) (in בחולדות מורדמות ............ 34<br />

2.2.4<br />

2.2.5<br />

36 ....................................................................................................RT-PCR - 2.2.6<br />

2.2.6.1<br />

36 ...............................................................Reverse Transcription (RT) - 2.2.6.2<br />

37 ...................................................Polymerase Chain Reaction (PCR) - 2.2.6.3<br />

37 ........................................................................................<br />

2.2.6.4<br />

37 ..................................................(sequences)<br />

2.2.6.5<br />

2.2.7<br />

38 ..................................................................................................<br />

2.2.7.1<br />

2.2.7.2<br />

39 ..................................... Western blot<br />

2.2.7.3<br />

40 ................................................... HeLa<br />

2.2.8<br />

- 2.2.8.1 החזקת תאים..........................................................................................‏ 40<br />

40 ...................... HeLa<br />

2.2.8.2<br />

41 .........................................................................<br />

2.2.9<br />

- הפקת רנ"א כללי RNA) (total מתוך פפילת CV ואפיתל לא סנסורי................‏ 36<br />

- בחירת תחלים<br />

- קביעת רצף חומצות הגרעין<br />

- קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה-‏ GRK בפפילת CV ע"י צביעת חתכים מרקמות לשון<br />

‏(אימונוהיסטוכימיה)‏<br />

- הכנת חתכים מלשון................................................................................‏ 38<br />

- צביעת חתכי פפילת CV בעזרת נוגדנים.......................................................‏ 39<br />

- בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת<br />

- קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי<br />

– הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי<br />

- מדידת שינויים ברמות cAMP<br />

4

- 2.2.9.1 ביטוי מלאכותי ‏(טרנספקציה)‏ של הקולטן ה-‏ β2AR בתאי ....................HeLa 41<br />

- 2.2.9.2 הכנת הדוגמאות......................................................................................‏ 41<br />

42 ....................... (RIA) radioimmunoassay<br />

2.2.9.3<br />

42 ..................................................................<br />

2.2.9.4<br />

2.2.10<br />

- 2.2.10.1 הכנת הדוגמאות....................................................................................‏ 42<br />

2.2.10.2<br />

43 .........<br />

2.2.10.3<br />

2.2.11<br />

- 2.2.12 מידור<br />

- 2.2.13 קביעת שפעול של ...............................................................................ERK 45<br />

2.2.14<br />

.3<br />

3.1<br />

3.1.1<br />

47 .........................................................<br />

3.1.2<br />

GRKs בפפילת CV בחולדות ............... 48<br />

3.2<br />

48 ....................................<br />

3.2.1- ביטוי<br />

49 .........................immunostaining<br />

3.2.2<br />

- קביעת כמות cAMP בשיטת ה-‏<br />

- קביעת חלבון בשיטת ברדפורד<br />

- קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי..................................‏ 42<br />

- קשירת החרוזים לנוגדן כנגד .............................................................HA 43<br />

- השקעה אימונית (immunoprecipitation) של הקולטן הבטא-אדרנרגי<br />

- מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי............................‏ 44<br />

‏(פרקציונציה)‏ של התא.........................................................................‏ 44<br />

- ניתוח סטטיסטי של התוצאות..........................................................................‏ 45<br />

תוצאות........................................................................................................................‏‎46‎<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות CV שלמות.........................................................‏ 46<br />

- מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי...............................................‏ 46<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות<br />

- נוכחות ודפוס התבטאות של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

RT-PCR בשיטת ה-‏ CV שונים בפפילת ה-‏ GRKs<br />

– קביעת מיקומם של ה-‏ GRKs השונים בשיטת<br />

3.3- חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני GPCRs בעזרת מודל בתאי HeLa<br />

51 .................................................................................................................................<br />

3.3.1- חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי ..........................................HeLa 51<br />

3.3.2- השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני cAMP לאחר גירוי הקולטן ה-‏<br />

51 ................................................................................................................... β2AR<br />

3.3.2.1- הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה-‏ cAMP בתגובה<br />

לגירוי הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO<br />

- הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים<br />

- פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת cAMP<br />

בתגובה לגירוי הקולטן ה-‏ β2AR<br />

- השפעת הטעמנים איננה תלויה ב-‏ PDE או ב-‏ .PKA<br />

- השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה-‏ β2AR ע"י GRK2/5 בעקבות גירוי ע"י ISO<br />

- השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה-‏ ..........................β2AR 58<br />

– השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ERK בתגובה לגירוי עם<br />

52 ...........................................................................<br />

52 .................................<br />

3.3.2.2<br />

3.3.2.3<br />

54 .............................................................................<br />

55 ...................................<br />

3.3.2.4<br />

56<br />

3.3.3<br />

3.3.4<br />

3.3.5<br />

61 ..................................................................................................................... .ISO<br />

.4<br />

63 ...............................................................<br />

4.1<br />

4.2<br />

4.3<br />

67 ...................................................................................................GRKs<br />

דיון ומסקנות.................................................................................................................‏‎63‎<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם<br />

- איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה-‏ GRKs בתאי פפילת ה-‏ CV בחולדה...........................‏ 66<br />

- טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏ GPCRs על ידי עיכוב פעילותן<br />

של קינאזות ה-‏<br />

רשימת ספרות...................................................................................................................‏‎74‎<br />

5

רשימת קיצורים<br />

β2AR<br />

BSA<br />

cAMP<br />

CAFF<br />

CCCP<br />

cGMP<br />

CLT<br />

CV<br />

D-TRP<br />

DABCO<br />

DAG<br />

DMEM<br />

DMSO<br />

EGTA<br />

ERK<br />

FBS<br />

G protein<br />

GAPDH<br />

GMP<br />

GPCR<br />

GRK<br />

HEPES<br />

HPLC<br />

IBMX<br />

IMP<br />

IP 3<br />

ISO<br />

KI<br />

MAPK<br />

MSG<br />

β2-adrenergic receptor<br />

Bovine serum albumin<br />

Adenosine 3’-5’ cyclic monophosphate<br />

Caffeine<br />

Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone<br />

Guanine 3’-5’ cyclic monophosphate<br />

Cyclo(Leu-Trp) / Cyclo(L-Leucine-L-Tryptophan)<br />

Circumvallate<br />

D-Tryptophan<br />

1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octane<br />

Diacylgycerol<br />

Dulbecco's Modified Eagle's Medium<br />

Dimethylsulfoxide<br />

Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic<br />

acid<br />

Extracellular signal-regulated kinase<br />

Fetal bovine serum<br />

Guanine nucleotide binding protein<br />

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase<br />

Guanosine 5’-monophosphate<br />

G-protein-coupled receptor<br />

G-protein-coupled receptor kinase<br />

(N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])<br />

High performance liquid chromatography<br />

3-Isobutyl 1-methylxanthine<br />

Inosine 5’-monophosphate<br />

Inositol 1,4,5-trisphosphate<br />

Isoproterenol hydrochloride<br />

Potassium iodide<br />

Mitogen-activated protein kinase<br />

Monosodium glutamate<br />

6

NaF<br />

Sodium fluoride<br />

NAR<br />

Naringin<br />

NHD<br />

Neohesperidin dihydrochalcone<br />

PBS<br />

Phosphate buffered saline<br />

PCR<br />

Polymerase chain reaction<br />

PDE<br />

Phosphodiesterase<br />

PI<br />

Propidium iodide<br />

PKA<br />

Phosphokinase A<br />

PKC<br />

Phosphokinase C<br />

PLC<br />

Phospholipase C<br />

QUIN<br />

Quinine<br />

RIA<br />

Radio-immuno assay<br />

RIPA<br />

Radio-immunoprecipitation assay buffer<br />

RT<br />

Reverse transcription<br />

SACC<br />

Saccharin<br />

T1R Taste receptor family 1<br />

T2R Taste receptor family 2<br />

TCA<br />

Trichloroacetic acid<br />

7

1. מבוא<br />

- חושים כימיים<br />

1.1<br />

היכולת לזהות,‏ לפרש ולהגיב לגירויים סביבתיים הינה תכונה חיונית להתפתחותם,‏ הסתגלותם<br />

והישרדותם של בעלי חיים בסביבה בה הם חיים.‏ מנגנוני החישה הפריפריים הכוללים חישת גירויים<br />

חיצוניים ‏(חושי הראייה,‏ השמיעה והמישוש)‏ וחישת גירויים החודרים לתוך הגוף ‏(חוש הטעם והריח)‏<br />

נועדו למטרה זו.‏<br />

חוש הריח וחוש הטעם המזהים חומרים כימים,‏ נדיפים או מוצקים בהתאמה,‏ הינן שתי מערכות חישה<br />

המאפשרות זיהוי מקורות מזון וסכנות מסוגים שונים ‏(אויבים או רעלים).‏ מערכת חישת הריח מורכבת<br />

משני איברים המופרדים מבחינה פיזית:‏ האפיתל האולפקטורי באף אשר אחראי על זיהוי המגוון האדיר<br />

של הריחנים הקיימים MOE) (main olfactory epithelium ואזור נוסף הנקרא האברון הוומרונזלי<br />

,(vomeronasal organ VNO)<br />

המשתתף בתהליך חישת הפרומונים המגדירים התנהגות מינית כגון<br />

רביה,‏ תוקפנות כלפי בעלי חיים אחרים ועוד.‏ אפיתל חוש הטעם<br />

,(taste sensory epithelium)<br />

הממוקם בלשון,‏ בחך ובתחילת הוושט מספק מידע מידי על הרכב היונים,‏ הימצאות מרכיבים עתירי<br />

קלוריות ונוכחות חומרים לא רצויים במזון.‏ למרות מיקום נפרד ותפקידים פיזיולוגיים שונים,‏ חוש הטעם<br />

והריח משתפים פעולה לעיתים קרובות:‏ בהערכת איכות המזון למשל,‏ חוש הריח מאפשר לזהות מראש<br />

מזון מקולקל או להגביר את התיאבון למאכלים מסוימים.‏ בנוסף,‏ ריחנים המשתחררים לאחר לעיסת<br />

המזון ומגיעים לחלל הפה מגרים את התאים הסנסוריים הממוקמים במוקוזה:‏ השילוב בין חוש הטעם<br />

לחוש הריח יפורש בזיכרון כ"טעם המזון"‏<br />

.(42)<br />

- חישת הטעם<br />

1.2<br />

חישת הטעם משחקת תפקיד מרכזי בתזונת בעלי החיים,‏ בהערכת ההרכב היוני והקלורי של המזון ובזיהוי<br />

חומרים העלולים להיות רעילים.‏ כיום הוכח שיונקים מסוגלים להבחין בין חמישה טעמים שונים:‏ בנוסף<br />

לארבעת הטעמים הידועים מתוק,‏ מר,‏ מלוח וחמוץ,‏ טעם המונוסודיום גלוטמאט התגלה כייחודי ומכונה<br />

כעת בספרות ‏"הטעם האוממי".‏ קיימת עדיין מחלוקת לגבי קיומו של ‏"הטעם השומני":‏ יש הטוענים כי<br />

מדובר אך ורק בתחושת מרקם,‏ אך לפני כמה שנים התגלו ראיות בהן חומצות שומניות חופשיות מסוגלות<br />

לעורר תגובה בתאי טעם דרך תעלות אשלגן ולגרום להעברת אותות<br />

.(53)<br />

טעמנים מתוקים,‏ מלוחים או אוממי וכן נוכחות חומצות שומן במזון מעוררים תחושה שלעיתים מהנה<br />

ומעוררת תיאבון.‏ תגובות אלו חשובות מבחינה אבולוציונית בכך שהן מאפשרות לבעלי החיים להעדיף<br />

מזונות עתירי אנרגיה הדרושים להישרדות.‏ חישת הטעם המר ובמידה מסוימת גם החמוץ חיונית לא פחות<br />

ומהווה קו הגנה,‏ מאחר והיא מאפשרת,‏ ביחד עם חוש הריח,‏ זיהוי מזון מקולקל או חומרים רעילים<br />

8

טבעיים ‏(טוקסינים)‏ כגון אלקלואידים צמחיים.‏ לכן תגובה אופיינית,‏ מולדת ברוב היונקים,‏ לטעם מר<br />

הינה סלידה.‏ יש לציין יחד עם זאת שדחיית הטעם המר איננה חד משמעית:‏ חלק משמעותי מן החומרים<br />

המרים והחמוצים הם בעלי חשיבות תזונתית ‏(חסה,‏ כרוב,‏ כרובית,‏ ברוקולי)‏ ואפילו מעוררי תיאבון<br />

‏(לימון,‏ אשכוליות,‏ תפוחים,‏ סודה לשתייה ועוד).‏ בנוסף להערכת הרכב יוני וקלורי,‏ נמצא שלמערכת<br />

חישת הטעם מנגנונים מיוחדים להערכת ריכוז המים מול ריכוז המומסים במזון הנבלע ולכן לחישת הטעם<br />

המלוח,‏ החמוץ וטעם המים חשיבות בשמירה על איזון מערכתי של אוסמולריות וריכוז יונים מעבר<br />

להספקת יונים חיוניים לגוף<br />

.(124)<br />

- אברוני חוש הטעם ביונקים<br />

1.3<br />

תאי הטעם TRCs) (taste receptor cells - האחראים על חישת הטעם הינם תאים נוירואפיתליאליים<br />

קטנים<br />

‏(אורכם 40-60 μm וקוטרם (20-40 μm<br />

בעלי אופי ביפולרי:‏ באזור האפיקלי נמצאים מיקרווילי<br />

(microvilli) המכילים את הקולטנים לטעם,‏ ובצד הבזולטרלי מועבר המידע למוח במנגנון מורכב הכולל<br />

תקשורת בין תאים וקשרים סינפטיים עם סיבים עצביים<br />

מורפולוגיות הנקראות פקיעיות טעם<br />

.(143)<br />

,(taste buds)<br />

ל-‏ 50 ובתוכן בין<br />

תאי הטעם מאורגנים ביחידות<br />

150<br />

תאים,‏ כאשר כל התאים<br />

מפנים את המיקרווילי לעבר פתח פקיעית הטעם pore) (taste החשוף לחלל הפה וכך למזון ולטעמנים.‏<br />

תאי הטעם,‏ המכונים מבחינה היסטורית גם תאים מסוג<br />

,(type II cells) II<br />

נמצאים בפקיעית בסמיכות<br />

לשלושה סוגי תאים נוספים IV) (type ,I III and האחראים בין היתר על תקשורת בין תאית,‏ העברת<br />

המידע למוח,‏ חידוש תאי הפקיעית ועוד.‏ פקיעיות הטעם נמצאות בעיקר על הלשון אך ניתן למצוא בודדות<br />

בין תאי האפיתל בכל חלל הפה.‏ באדם,‏ בערך שני שליש מפקיעיות הטעם מאורגנות באברונים הנקראים<br />

פפילות<br />

.(taste papillae)<br />

הטעם שהן מכילות:‏<br />

מבחינים בשלושה סוגי פפילות,‏ הנבדלות במבנה,‏ מיקום ומספר פקיעיות<br />

fungiform papillae<br />

הלשון ומכילות פקיעיות בודדות,‏<br />

מספר גדול יותר של פקיעיות,‏ ו-‏<br />

foliate papillae<br />

הנמצאות במספר רב ‏(מאות)‏ בעיקר בשליש הקדמי של<br />

circumvallate papillae<br />

הממוקמות בצידיו האחוריים של הלשון ומכילים<br />

הנמצאות בחלק האחורי של הלשון<br />

במספרים בודדים (1-5 לפי בעל החיים)‏ אך מכילות את המספר הרב ביותר של פקיעיות<br />

‏(איור 1.1).<br />

חלוקה טופוגרפית של הלשון על פי רגישותו של כל אזור לטעמים השונים הייתה מקובלת עד לפני כמה<br />

שנים.‏ ידוע כיום שניתן לחוש בכל אחד מן הטעמנים ע"י גירוי של כל אחד מסוגי פפילות הטעם מכל אזור<br />

בלשון.‏ בנוסף לפפילות הטעם,‏ קיימות על פני הלשון פפילות נוספות<br />

(filliform)<br />

פקיעיות טעם והן בעלות תפקידים שונים מחישת טעם כמו למשל ערבוב המזון בפה.‏<br />

אשר אינן מכילות<br />

9

איור 1.1<br />

(circumvallate ו-‏ foliate ,fungiform)<br />

(TRC)<br />

buds) (taste שהן מכילות.‏<br />

- מיקום ומבנה של פפילות ופקיעיות הטעם בלשון.‏<br />

הנבדלות במבנה,‏ מיקום ומספר פקיעיות הטעם<br />

a- שלושה סוגי פפילות<br />

בתוך פקיעית הטעם,‏ תאי הטעם נחשפים לטעמנים דרך ה-‏<br />

- b ניתן לחוש בכל אחד מחמשת הטעמים המוכרים בכל מקום בלשון.‏ לקוח מתוך<br />

.taste pore<br />

.(23)<br />

- 1.4<br />

1.4.1<br />

מנגנונים תאיים של חישת הטעם<br />

- הטעם המר<br />

תרכובות מרות מעוררות חוסר נעימות בריכוזים נמוכים עד לדחייה חזקה בריכוזים גבוהים.‏ מגוון רחב<br />

של תרכובות אורגניות,‏ חלקן מקורן בצומח וחלקן מתוצרת תעשייתית הינן מרות וביניהן ניקוטין,‏ קפאין,‏<br />

סטריכנין,‏ סוכרוז אוקטאצטט,‏ ציקלוהקסימיד,‏ כינין,‏ נרינגין,‏ דנטוניום ועוד.‏ אבולוציונית,‏ הטעם המר<br />

מזהיר אותנו מפני מזונות מקולקלים ורעלים מן הטבע:‏ אחד האתגרים המרתקים במחקר הטעם הינו<br />

להבין כיצד קולטנים לטעם המר עוצבו באבולוציה לשרת מטרה זו.‏<br />

משפחת הקולטנים לטעם מר,‏ כמו זאת לטעם המתוק ואוממי,‏ זוהתה בוודאות רק בסוף שנות התשעים<br />

הודות למאגרי מידע גנומיים ברשת.‏ קבוצה חדשה של קולטנים מצומדים לחלבוני<br />

(G-protein-<br />

G<br />

coupled receptors - GPCRs)<br />

זוהי משפחה רחבה למדיי של עד<br />

פוטנציאליים זוהו בבני אדם ו-‏<br />

‏(הקולטנים לפרומונים ב -<br />

מוקמה בכרומוזום מספר 6 וקרויה בשם משפחת ה-‏<br />

.(104 ,2) T2R<br />

80<br />

קולטנים בעכברים,‏ חולדות ובני אדם.‏ עד כה לפחות<br />

26<br />

33<br />

(VNO<br />

גנים<br />

בעכברים.‏ הקולטנים מראים קרבה לקולטנים הוומרונזאלים<br />

ומראים בין<br />

30 % ל-‏ 70 %<br />

זהות ברצף חומצות האמינו בתוך<br />

המשפחה.‏ ייתכן והשוני בין הקולטנים הוא המאפשר את זיהוי המגוון הרחב של מבנים כימיים הקיים<br />

בקבוצת הטעמנים המרים.‏ בדומה ל-‏ GPCRs אחרים בעלי קצה N‏-טרמינלי חוץ תאי קצר,‏ ההנחה היא<br />

10

שחומצות האמינו החשובות לקשירת הליגנד ולקביעת הספציפיות לטעמנים שונים נמצאות באזורים<br />

הטרנסממברנליים ובאחת הלולאות החוץ תאיות של הקולטן<br />

.(111)<br />

זיהוי ליגנדים לקולטנים שונים<br />

ממשפחת ה-‏ T2Rs התאפשר בשנים האחרונות ע"י ביטוי של אותם הקולטנים בתרביות תאים<br />

,18 ,8)<br />

,(149 ,137 ,89 ,24<br />

אך עד כה רובם של הקולטנים למר עדיין מוגדרים ‏"יתומים"‏<br />

(orphan<br />

.receptors)<br />

T2Rs ה-‏<br />

בנוסף לספציפיות לליגנדים שונים,‏ ייתכן והפולימורפיזם הקיים בגנים המקודדים לקולטני<br />

אחראי גם להבדלים ברגישות לטעמנים שונים בפרטים שונים ולקיום<br />

ו-‏ tasters<br />

,tasters<br />

תופעה ידועה גם בבעלי חיים וגם בבני אדם<br />

ניסויים שנעשו בחולדות ועכברים הראו נוכחות של<br />

בפפילות<br />

.(24)<br />

T2R mRNAs ב-‏ 15%<br />

,foliate ו-‏ circumvallate<br />

אך רק ב-‏ 2% מהתאים בפפילות ה-‏ fungiform<br />

מתאי פקיעיות הטעם<br />

יש ,2) .(24<br />

הטוענים שתא אחד יכול לבטא מגוון רחב של קולטני ,T2R דבר המרמז על היכולת של תא בודד לזהות<br />

טעמנים מרים שונים<br />

.(2)<br />

בניגוד לטענה זו,‏ מחקר אחר הראה שתאים המגיבים למר מופעלים אך ורק על<br />

ידי טעמן אחד מתוך חמישה,‏ כך שטעמנים שונים מעוררים תת-אוכלוסיות שונות של תאי טעם<br />

.(21 ,9)<br />

חלבון (Guanine nucleotide binding protein – protein G) G בשם ,gustducin<br />

בעל הומולוגיה<br />

גבוהה לחלבון G אחר בשם transducin ומתבטא במערכת הראייה,‏ נמצא ברקמת הטעם ‏(ומאוחר יותר<br />

גם ברקמות אחרות<br />

,10)<br />

.(107 ,16)<br />

101)) ומתבטא באופן סלקטיבי ב-‏ 20-30% מתאי הטעם בכל סוגי הפפילות<br />

הקשר בין gustducin לטעם המר ידוע כבר מתחילת שנות ה-‏<br />

.(107) 90<br />

ניסויי<br />

בעכברים הראו שתת-היחידה<br />

פוספודיאסטראז ספציפי לטעם שזוהה כ-‏<br />

הנוקלאוטידים הציקליים<br />

α-gustducin<br />

מעורבת בטרנסדוקצית הטעם המר דרך הפעלת<br />

.(147) PDE1A<br />

(cNMPs)<br />

הפעלת אנזים זה גורמת לירידה ברמת<br />

בתא.‏ השפעת ירידה זו בהמשך מסלול העברת האותות איננה<br />

ברורה.‏ ייתכן ורמות נמוכות של נוקלאוטידים משפיעות על פעילות קינאזות בתא או לחילופין תתכן<br />

בקרה של תעלות יוניות שונות המבוטאות בתאי טעם,‏ אשר חלקן מעוכבות ע"י<br />

inhibited) וחלקן תלויות ב-‏<br />

non-<br />

knockout<br />

(cNMP- cNMPs<br />

.(179) ( cNMP-gated channels) cNMPs<br />

בנוסף ל-‏ α-gustducin נמצאו בתאי טעם תת-יחידות α מחלבוני G אחרים:‏<br />

,Gα q ,Gα s ,Gα i3 ,Gα i2<br />

.(179 ,147 ,107) α-transducin ו-‏ Gα 14 ,Gα 15<br />

תפקיד בטרנסדוקצית הטעם המר מכיוון ש-‏<br />

התגובה לתרכובות מרות<br />

knock-out<br />

סביר שאחת או יותר מתת-יחידות אלה משחקת<br />

של<br />

α-gustducin<br />

.(57 ,20)<br />

איננו מבטל לחלוטין את<br />

לאחרונה,‏ הוכח שהקולטנים לטעם המר מתבטאים יחד עם<br />

Gα i2<br />

בפקיעיות טעם (20) ושקולטנים כגון mT2R5 מעוררים מסלולי העברת אותות המערבים שפעול של<br />

חלבון G מסוג<br />

.(127)<br />

G i/o<br />

עוד לפני שזוהו הקולטנים,‏ מסלולי העברת האותות של חישת הטעם המר נחקרו בהרחבה.‏ היום,‏ מסלול<br />

העברת האותות המערב היווצרות<br />

נחשב למרכזי בחישת הטעם המר<br />

במקביל להפעלת תת-היחידה α של<br />

ברמת ה-‏<br />

(IP 3 ) Inositol-1,4,5-trisphosphate<br />

ודיאצילגליצרול<br />

(DAG)<br />

,gustducin<br />

.(23)<br />

βγ תת-היחידה<br />

IP 3<br />

בתא על ידי הפעלת פוספוליפאז שזוהה כ-‏<br />

משתחררת כקומפלקס וגורמת לעלייה<br />

.(183 ,179 ,146 ,145 ,66) PLCβ2<br />

עלייה<br />

11

ב-‏ IP 3 גורמת לשחרור מאגרים תוך תאיים של סידן,‏ ובהמשך לשפעול תעלה המשתייכת למשפחת ה-‏<br />

(Transient Receptor Potential protein) TRPs<br />

וזוהתה כ-‏<br />

.(134 ,131) TRPM5<br />

התעלה וכניסה מסיבית של יוני נתרן דרכה גורמים לדפולריזציה של התא.‏ מחקרים הראו ש-‏<br />

פתיחת<br />

knock-<br />

out של<br />

PLCβ2 או של TRPM5 גורמים לחוסר רגישות לטעם המר וכן לטעם המתוק והאוממי,‏ דבר<br />

המצביע על חשיבות מרכזית של מסלול זה בחישת שלושת טעמים אלו<br />

מלוח וחמוץ לא נפגעו מ-‏<br />

.(183 ,34)<br />

knock-out זה,‏<br />

מכיוון שהטעמים<br />

נראה כי טעמים אלו מנצלים מסלולי העברת אותות שונים.‏<br />

איור 1.2<br />

– שני מסלולי העברת אותות מצטיירים כמרכזיים בחישת הטעם המר,‏ המתוק ואוממי.‏<br />

לאחר גירוי הקולטן,‏ שני מסלולי העברת אותות אפשריים.‏ מצד אחד שפעול תת-היחידה α יכולה לגרום לשפעול<br />

‏(או עיכוב)‏ של אדניליל ציקלאז או פוספודיאסטראזות,‏ אשר גורמים לשינוי ברמות נוקלאוטידים ציקליים.‏ בנוסף,‏<br />

שחרור תת-היחידה גורם לשפעול הפוספוליפאז אשר גורם לעלייה ברמות ה-‏ בתא ושפעול<br />

תעלות ה-‏ מסלול ה-‏ TRPM5/PLCβ2 ידוע כחיוני לחישת הטעמים מר,‏ מתוק ואוממי.‏ לקוח מתוך<br />

IP 3<br />

PLCβ2<br />

βγ<br />

.TRPM5<br />

.(143)<br />

תרכובות מרות מגוונות כגון כינין,‏ אוראה,‏ דנטוניום,‏ קפאין,‏ מתיל-קסאנטין וחומצות אמינו מסוימות,‏<br />

מסוגלות בנוסף למסלולים שפורטו מקודם להשפיע על מסלול העברת האותות ללא תיווך של קולטן אלא<br />

ע"י חדירה דרך הממברנה הפלסמטית ואינטראקציה ישירה עם חלבוני הטרנסדוקציה ככל הנראה הודות<br />

למבנה סטרוקטורלי דומה לאתר הקולטן הקושר את החלבון.‏ כינין ככל הנראה מסוגל לעבור בדרך זו<br />

אינטראקציה ישירות עם חלבוני G<br />

,(116)<br />

ולהפעיל תעלות קטיונים בצפרדע הקרקרנית<br />

במתח<br />

לעכב תעלות אשלגן בסלמנדרה אמריקנית<br />

(31) Necturus<br />

.(170) bullfrog<br />

,(159)<br />

cGMP<br />

תרכובות.‏<br />

בתא<br />

דנטוניום מעכב תעלות אשלגן התלויות<br />

וקפאין מעכב פוספודיאסטראזות וכך גורם לעלייה ברמות הנוקלאוטידים הציקליים כגון<br />

.(144)<br />

במקרים אלה,‏ תאים שאינם בהכרח קשורים לטעם המר מסוגלים להגיב לאותן<br />

12

1.4.2<br />

בשם<br />

- הטעם המתוק<br />

זמן קצר לאחר זיהוי הקולטנים לטעם המר,‏ מספר קבוצות חוקרים דיווחו על זיהוי קולטן לטעם המתוק<br />

T1R3 .(119 ,110 ,106 ,86) T1R3<br />

האנושי באזור המקביל לזה בגנום העכברי הנקרא<br />

התגלה ע"י סריקת גנים ל-‏ GPCRs הממוקמים בגנום<br />

.Sac locus<br />

לוקוס זה הינו אחד משני האזורים בגנום<br />

העכבר ‏(לוקוסים)‏ הידועים למעלה משלושים שנה כאחראים על חישת הטעם המתוק:‏ ה-‏<br />

שמיקומו בזרוע הדיסטלית של כרומוזום<br />

Sac locus<br />

4<br />

ואחראי על תגובה לסוכרוז,‏ סכרין וממתקים מלאכותיים<br />

נוספים.‏ בנוסף,‏ ה-‏ Dpa locus שמופה בזרוע הפרוקסימלית של כרומוזום 4 נמצא אחראי על תגובה ל-‏<br />

D‏-פנילאלנין<br />

.(121 ,96 ,5)<br />

פיזיולוגית,‏ הוכח ששני אזורים אלו משפיעים על העברת תגובה עיצבית<br />

פריפריאלית לסוכרוז,‏ דבר המרמז על קידוד לקולטן או מרכיב אחר של מסלול הטרנסדוקציה של הטעם<br />

המתוק.‏ ואכן הקולטן הראשון לטעם מתוק אותר בלוקוס ה-‏<br />

לאחר בדיקות נוספות נמצאה הומולוגיה של 30% בין<br />

.Sac<br />

T1R3<br />

GPCRs<br />

המתבטאים בתאי טעם הקרויים<br />

T1R1 ו-‏ T1R2<br />

לשני קולטנים ‏"יתומים"‏ ממשפחת ה -<br />

שתפקידם לא הוגדר עד אז.‏ בעכברים<br />

וחולדות T1R3 מתבטא בכ-‏ 15-30% מתאי הטעם בכל שלושת סוגי הפפילות.‏ לעומתו,‏<br />

בעיקר בפפילות מסוג fungiform ו-‏ T1R2 בפפילות מסוג<br />

situ hybridization הראו שבכל תא שבו מתבטא T1R3 מתבטא איתו<br />

T1R1 מבוטא<br />

.circumvallate ו-‏ foliate<br />

in ניסויים של<br />

T1R1 או<br />

,T1Rs<br />

.(119<br />

,82)<br />

T1R2 בהתאם לסוג<br />

הפפילה עובדה זו מרמזת על כך שקולטנים ממשפחת ה-‏ בדומה ל-‏ GPCRs<br />

אחרים,‏ פועלים דרך הטרודימריזציה ‏(יצירת קומפלקס בין שתי יחידות קולטן לפני או אחרי קישור<br />

הליגנד,‏ המאפשרת יציבות בקשירת הליגנד או שפעול פעילות אנזימטית בחלק התוך תאי של הקומפלקס<br />

כגון פעילות של קינאז).‏ כחיזוק להשערה זו,‏<br />

פונקציונלי.‏ לעומת זאת תאים המבטאים<br />

(119) Nelson et al.<br />

T1R3 ו-‏<br />

הראו שקולטן T1R בודד איננו<br />

T1R2 מגיבים בצורה חזקה ביותר לטעמנים מתוקים<br />

כגון הסוכרים הטבעיים סוכרוז ופרוקטוז אך גם לממתיקים מלאכותיים כמו סכרין ואצסולפאם-‏K‏.‏<br />

בנוסף,‏ הטרודימר זה מגיב לחומצות אמינו בעלות טעם מתוק כמו D‏-טריפטופן ולחלבונים מתוקים כמו<br />

.(94) monellin<br />

T1R2/T1R3<br />

מחקרים רבים נעשו בשנים אחרונות במטרה להסביר את יכולתו של הקולטן<br />

לקשור מגוון כה רחב של מולקולות מתוקות בעלות מבנים ומשקלים מולקולרים כה<br />

שונים.‏ בניגוד לקולטנים לטעם המר<br />

של<br />

,(T2Rs)<br />

קולטני ה-‏ T1Rs הינם בעלי קצה N‏-טרמינלי ארוך ולכן<br />

אזור זה נחשב תחילה למרכזי בקשירת הליגנדים.‏ מיפוי אזורי הקשירה של הקולטן נעשה בעזרת כימרות<br />

T1R3 ו-‏ T1R2<br />

שונים.‏ למשל האזור הטרנסממברנלי TMD<br />

הממתיק<br />

מאדם ומעכבר והראה שטעמנים שונים נקשרים לקולטן ההטרודימרי באזורים<br />

domain) (transmembranal של<br />

,(74) cyclamate<br />

אשר אחראי לקשירת הממתיקים<br />

ציסטאין ב-‏<br />

לעומת האזור החוץ תאי VFTM<br />

T1R3 מעורב בקשירת<br />

של T1R2 (Venus flytrap module)<br />

ו-‏ neotame<br />

.(178 ,75) aspartame<br />

אזור עשיר בחומצת האמינו<br />

,TMD ל-‏ VFTM מקשר בין ה-‏ (cystein rich domain) CRD ומכונה T1R3<br />

חיוני לקשירת חלבונים מתוקים כגון<br />

.(75) brazzein או monellin<br />

מולקולת ה-‏<br />

,lactisole<br />

ונמצא<br />

הידועה<br />

13

בבני אדם כמעכבת את המתיקות של מגוון סוכרים טבעיים,‏ גליקוזודים וממתיקים,‏ נקשרת ל-‏ TMD של<br />

.(73) T1R3<br />

ממצא זה מסביר באותה עת את העובדה ש-‏ lactisole פועלת גם כמעכב לטעם האוממי.‏<br />

התייחסות לביטוי מקביל של T1R3 ו-‏ T1R1 תעשה בפרק הדן בטעם האוממי.‏<br />

T1R3/T1R2 ו -<br />

- 1.3 איור<br />

.T1R3/T1R1<br />

מיפוי אזורי הקשירה לתרכובות<br />

לקוח מתוך<br />

מתוקות<br />

שונות בהטרודימרים<br />

.(178)<br />

על בסיס מחקרים ביוכימיים ופיסיולוגיים רבים,‏ הוצעו מספר מודלים לטרנסדוקצית הטעם המתוק:‏<br />

לאחר גילוי קולטני ה-‏<br />

,T1Rs<br />

מפעיל גם הוא את מסלול העברת האותות המערב את<br />

knock-out בשני גנים אלו מבטל את תחושת הטעם המתוק<br />

מחקרים הראו שבדומה לקולטנים לטעם מר,‏ ההטרודימר<br />

T1R2/T1R3<br />

ו-‏ PLCβ2<br />

,131) TRPM5 ,(183 ,146 ו -<br />

.(183)<br />

למרות שמסלול ה-‏<br />

IP 3 נחשב היום<br />

למרכזי בחישת הטעם המתוק ‏(כמו לזו של הטעם המר),‏ מחקרים אחרים מראים מעורבות של מספר<br />

מסלולי העברת אותות נוספים ‏(איור<br />

סוכריים.‏<br />

,(1.2<br />

ואף על קיום מסלולים שונים לסוכרים טבעיים וממתיקים לא<br />

סוכרים טבעיים מעוררים מסלול העברת אותות בו מעורבים חלבון G מהסוג G, s שפעול האנזים אדניליל<br />

ציקלאז ויצירת השליח המשני<br />

תעלות יוניות תלויות נוקלאוטידים<br />

.(164 ,163 ,115) cAMP<br />

(109) (cNMPs - gated channels)<br />

אותו cAMP יכול מאוחר יותר להשפיע על<br />

או לגרום להפעלת<br />

PKA<br />

(protein kinase A)<br />

וזרחון תעלות אשלגן וכך לדפולריזציה של הממברנה<br />

.(4)<br />

לאחרונה,‏ פורסמו<br />

מחקרים המראים שהעלייה ברמות cAMP לאחר גירוי תאי טעם בסוכרוז אינה תלויה בנוכחות סידן חוץ<br />

או תוך תאי.‏ בנוסף,‏ ביטוי של איזופורמים ספציפיים לטעם של האדניליל ציקלאז נמצאו מקבילים<br />

לביטויו של<br />

.PLCβ2<br />

לאור התוצאות,‏ החוקרים מציעים שלאחר חשיפת תאי טעם לסוכרים טבעיים<br />

מתקיימים שני מסלולים מקבילים אך בלתי תלויים,‏ והם היווצרות<br />

תאיות דרך<br />

cAMP<br />

.(169 ,1) IP 3<br />

ועלייה ברמות סידן תוך<br />

14

במסלול העברת האותות של ממתיקים מלאכותיים כגון סכרין ו-‏ SC45647 מעורב חלבון G מסוג<br />

המפעיל פוספוליפאז C לשחרור<br />

Gq<br />

IP 3 ו-‏ .DAG שיטות של<br />

Calcium imaging בפקיעיות טעם מבודדות<br />

הראו שבניגוד לסוכרים הטבעיים הגורמים לחדירת יוני סידן מחוץ לתוך התא,‏ ממתיקים מלאכותיים<br />

גורמים לשחרור מאגרים תוך תאיים של יוני סידן,‏ כתוצאה מיצירת<br />

ממצאים נוספים מסבכים את התמונה:‏ לאחר שנמצא שמעכב ל-‏<br />

.(9) IP 3<br />

(H89) PKA<br />

לא ביטל את התגובה<br />

לטעם המתוק אלא הגביר אותה,‏ נראה ש-‏ PKA איננו מעורב במסלול העברת האותות אלא יותר בתופעת<br />

האדפטציה ‏(ירידה ברגישות לגירוי לאורך הזמן כאשר גירוי זה מופעל שוב ושוב)‏<br />

בתגובה התקבלה עבור ממתיקים טבעיים ומלאכותיים כאחד.‏ לעומת זאת עיכוב<br />

.(173)<br />

PKC<br />

ההגברה<br />

לא השפיע על<br />

התגובה לסוכרוז אבל ביטל את התגובה לממתיקים מלאכותיים:‏ ממצא זה מחזק את ההשערה על פיה<br />

מתקיימים מסלולים שונים לממתיקים טבעיים ומלאכותיים.‏ בנוסף,‏ בדיקת שליחים משניים בזמנים<br />

קצרים של מילישניות לאחר הפעלת הטעמן הראתה שהנוקלאוטיד cGMP משחק תפקיד בגירוי הראשוני<br />

ms) 75-250) של תהליך הטרנסדוקציה,‏ כאשר cAMP מופיע רק מאוחר יותר<br />

.(88)<br />

1.4.3<br />

- הטעם האוממי ‏(חומצות אמינו)‏<br />

‏"אוממי"‏ שמשמעותו ביפנית ‏"טעים מאוד",‏ הינו טעם דומיננטי במזונות המכילים חומצות אמינו ‏(מוצרי<br />

בשר וגבינות ישנות)‏ ובמיוחד L‏-מונוסודיום גלוטמאט<br />

.(MSG)<br />

המשמעות הביולוגית הרבה של הטעם<br />

הזה היא בכך שהוא מספק לגוף אינדיקציה על תכולת חומצות אמינו חיוניות במזון.‏ הוכח שנוכחות של<br />

‏'‏‎5‎‏-ריבונוקלאוטידים כמו IMP ו-‏ GMP מגבירה את עוצמת הטעם האוממי<br />

.(90 ,79)<br />

בעקבות גילוי הקולטנים לטעם המתוק,‏ נמצאו הקולטנים לטעם האוממי השייכים למשפחת ה-‏<br />

.T1Rs<br />

כפי שכבר צוין,‏ קולטנים ממשפחה זו מופעלים דרך הטרודימריזציה:‏ בניגוד לקולטן לטעם המתוק<br />

המורכב מ-‏<br />

,T1R2 ו-‏ T1R3<br />

הקולטן לטעם האוממי מורכב מ-‏<br />

זה הינו ספציפי לחומצות האמינו בעלות מבנה איזומרי<br />

,(118) T1R1 ו-‏ T1R3<br />

.L<br />

והוכח שצירוף<br />

מיפוי אזורי הקשירה של הקולטן<br />

T1R1/T1R3 אשר נעשה במקביל לזה של הקולטן למתוק,‏ גילה שקשירת חומצות האמינו מתבצעת ככל<br />

הנראה באזור החוץ תאי<br />

בנוכחות<br />

של (VFTM)<br />

.(178) T1R1<br />

,(90) IMP<br />

נמצא כי התגובה לחומצות האמינו מוגברת<br />

אפילו בריכוזים נמוכים ביותר של הריבונוקלאוטיד.‏ ההשערה היא ש-‏<br />

IMP נקשר<br />

אף הוא לקולטן באזור שאינו מתחרה על קישור חומצת האמינו ומגביר את זמינות הליגנד (167) או את<br />

האפיניות שלו<br />

על פי (91).<br />

,(178) Xu et al.<br />

לא השפיעה על עוצמת התגובה של הקולטן המתוק<br />

זמן רב לפני גילוי קולטן ה-‏<br />

IMP צפוי להיקשר ל-‏<br />

,T1R1<br />

T1R2/T1R3 לציקלמאט.‏<br />

,T1R1/T1R3<br />

לאור העובדה שנוכחותו<br />

חוקרים חשדו במעורבות של קולטנים יונוטרופיים<br />

(ligandgated<br />

ionic channels)<br />

ומטבוטרופיים ‏(קולטנים ממשפחת ה-‏<br />

(G-protein-coupled receptors<br />

בחישת הטעם האוממי.‏ הקולטן הראשון שהוכחה מעורבותו בטעם האוממי היה קולטן מטבוטרופי בשם<br />

(25) mGluR4<br />

המשתייך למשפחת ה-‏<br />

mGluR<br />

הידועה זמן רב בתאי העצב<br />

.(30)<br />

קולטנים<br />

יונוטרופיים,‏ המאפשרים זרימת יונים לאחר קישור ספציפי של ליגנד,‏ מתבטאים אף הם בלשון,‏ אך לא<br />

15

הוכח עד היום שביטוי זה הינו ספציפי לתאי טעם ולכן מעורבותם בחישת הטעם האוממי נשארה<br />

מעורפלת.‏ בדומה לטעם המר וטעם המתוק,‏ מסלול הטרנסדוקציה העיקרי בחישת הטעם האוממי הינו<br />

מסלול ה-‏<br />

IP 3 ,PLCβ2<br />

ו-‏<br />

האמינו מעלה את רמות ה-‏<br />

.(183) TRPM5<br />

cAMP<br />

תעלות יוניות,‏ ביניהן תעלות סידן.‏<br />

במקביל ל-‏<br />

למרות זאת,‏ מחקרים אחרים מראים שחלק מחומצות<br />

,IP 3<br />

לעומת חומצות אחרות אשר מפעילות ישירות<br />

1.4.4<br />

- הטעם המלוח<br />

הטעם המלוח והטעם החמוץ מאופיינים בכך שהם נובעים מנוכחות יונים במזון.‏ חישת הטעם המלוח<br />

מספקת אינפורמציה על תכולת NaCl ומינרלים נוספים במזון ולכן משרתת את שימור ההומאוסטאזיס<br />

של יונים ומים בגוף.‏ למרות שמספר מלחים מעוררים את הטעם המלוח<br />

,(NaCl, KCl, LiCl, NH 4 Cl)<br />

המלח NaCl הוא האופייני ביותר ליונקים,‏ בגלל הרעב הספציפי כלפיו.‏ כיום ידועים שני מנגנונים לחישת<br />

הטעם המלוח:‏ מסלול ספציפי לנתרן<br />

(Na + -specific pathway)<br />

ומסלול שאינו ספציפי<br />

(Na + -<br />

.nonspecific pathway)<br />

במנגנון הראשון,‏ שנחקר בהרחבה,‏ מתרחשת כניסה של יוני נתרן דרך תעלות נתרן הרגישות ל-‏<br />

(Amiloride sensitive sodium channels) amiloride<br />

הנקראות בשם מקוצר<br />

ASSC or EnaC<br />

.(58 ,40)<br />

תעלות אלה הינן אפיקליות ומורכבות משלוש תת-יחידות כאשר אחת מהן לפחות מושפעת<br />

מההורמון הסטרואידי אלדוסטרון<br />

.(95)<br />

התעלה מתפקדת כקולטן לטעם המלוח ע"י כך שהיא נפתחת<br />

באופן ספציפי בנוכחות יוני נתרן בחלל הפה ומאפשרת זרימת נתרן פנימה ועקב כך לדפולריזציה של<br />

הממברנה הבזולטרלית הגוררת אירועים סינפטיים נוספים.‏ למרות שמעורבות ה-‏ ASSCs בחישת הטעם<br />

המלוח ברורה,‏ הרגישות לאמילורייד בבני אדם מוגבלת ופחות משמעותית,‏ דבר המרמז על מעורבות של<br />

מסלול נוסף שאיננו רגיש לאותו מעכב.‏ הסברים אפשריים הם נוכחות תעלות יוניות בלתי ספציפיות<br />

בממברנה האפיקלית של תאי הטעם (41) או דיפוזית יוני נתרן דרך ה-‏<br />

נתרן בצד הבזולטרלי של התאים<br />

tight junctions והפעלת תעלות<br />

,(181 ,157)<br />

דבר הגורם לדפולריזציה.‏ מחקרים פיזיולוגיים מראים<br />

שתעלות ASSCs חדירות ליוני נתרן,‏ ליתיום ופרוטונים אך לא לאשלגן.‏ לעומת זאת,‏ חישת מלחי אשלגן<br />

ואמוניום מתרחשת באופן מקביל למסלול הלא ספציפי לחישת מלחי נתרן<br />

.(162)<br />

למרות שחישת הטעם<br />

המלוח נחקרה בהרחבה כבר עשרות שנים,‏ עדיין אין לנו הבנה מלאה של כלל התהליכים המתרחשים<br />

והתורמים לה.‏<br />

1.4.5<br />

- הטעם החמוץ<br />

הטעם החמוץ,‏ המאפשר בטבע לזהות מזונות מקולקלים ולמנוע צריבה ע"י חומצות,‏ יכול להיות נעים או<br />

נסבל כאשר הוא חלש אך נהיה דוחה כאשר הוא חזק.‏ הגירוי העיקרי האחראי על הטעם החמוץ הינו<br />

כניסת פרוטונים לתוך תא הטעם,‏ דבר המשפיע על ה-‏<br />

pH<br />

וגורם כך לפוטנציאל פעולה<br />

שני (84).<br />

מסלולים אפשריים מעורבים בחישת הטעם החמוץ:‏ במסלול הראשון כניסת פרוטונים לתוך התא<br />

16

מתאפשרת הודות לפתיחת תעלות רגישות אמילורייד<br />

(ASSCs)<br />

(51) ובמסלול השני מעורבות תעלות<br />

תלויות פרוטונים הנפתחות רק בנוכחות פרוטונים בסביבה,‏ ביניהן תעלות אשלגן בסלמנדרה האמריקנית<br />

,(84) Necturus<br />

תעלות קטיונים בלתי ספציפיות ממשפחת ה-‏<br />

קטיונים המופעלות ע"י דפולריזציה ונפתחות ע"י קשירת נוקלאוטידים<br />

,(171) ENaC/Deg channels<br />

ותעלות<br />

(Hyperpolarized-activated<br />

.(161) nucleotide-gated cation channel)<br />

junctions וכך למלא את החלל של פקיעית הטעם<br />

בנוסף,‏ נראה שפרוטונים יכולים לחדור דרך ה-‏<br />

tight<br />

.(39)<br />

כתוצאה מתנועת הפרוטונים מחלל הפה לתוך<br />

הפקיעית,‏ ובהמשך לתאי הטעם,‏ השינויים ב-‏ pH יכולים להשפיע על מערכות תוך תאיות רבות ביניהן<br />

תעלות יוניות שונות ומספר מסלולי טרנסדוקציה.‏ לאחרונה,‏ מחקרים הראו כי לתעלה<br />

חשיבות רבה בחישת הטעם החמוץ<br />

PKD2L1<br />

.(65)<br />

מאלה המבטאים את הקולטנים לטעם המר<br />

מהונדסים גנטית הראה כי<br />

תעלה זו מתבטאת בכל סוגי פקיעיות הטעם אך בתאים שונים<br />

(T2Rs)<br />

או לטעם המתוק<br />

.(T1Rs)<br />

knock-out<br />

שימוש בעכברים<br />

של תעלה זו בעכברים במטל באופן ספציפי את חישת הטעם<br />

החמוץ ולא אף טעם אחר.‏ המגוון הרחב של מסלולים שנמצאו עבור הטעם החמוץ מדגיש את מורכבות<br />

מסלול טרנסדוקצית הטעם החמוץ.‏<br />

1.5<br />

1.5.1<br />

- העברת אותות בין-תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית<br />

- העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם<br />

עד לפני כמה שנים,‏ סברו החוקרים שלאחר גירוי קולטן הטעם והפעלת מסלול העברת האותות,‏ תא<br />

הטעם מעביר את המידע אל סיב עצב ע"י קיום סינפסה ושחרור נוירוטרנסמיטור,‏ בדומה למערכות<br />

עצביות ידועות אחרות כגון חוש הריח<br />

מורכבת הרבה יותר.‏<br />

.(113)<br />

מחקרים אשר נערכו בשנים האחרונות מציירים תמונה<br />

מבחינה היסטורית,‏ התאים בפקיעית הטעם מוספרו מ-‏ I עד IV על פי מאפיינים ציטולוגיים.‏ התאים מסוג<br />

I הינם תאי ‏"תמיכה",‏ ותאים מסוג ,IV הנקראים גם ‏"תאים בזלים",‏ מהווים מקור לשאר סוגי התאים<br />

שבפקיעית הטעם.‏ שני סוגי תאים אלו אומנם חשובים לתפקוד מלא של פקיעית הטעם אך תפקידם<br />

בעיבוד המידע לא נחקר עד כה.‏ התאים מסוג<br />

לטעם והתאים הסינפטיים,‏ בהתאמה<br />

II ו-‏<br />

.(143)<br />

III מהווים את תאי הטעם המבטאים את הקולטנים<br />

שני מחקרים אשר פורסמו במקביל הראו שתאי הטעם המבטאים את הקולטנים לטעם אינם מבטאים<br />

חלבונים אשר ממוקמים במערכות אחרות באזור הפרסינפטי של תא עצב.‏ החוקרים הראו שהחלבונים<br />

synaptin II ,SNAP25<br />

,NCAM ו-‏<br />

אשר מעורבים במנגנון שחרור ווסיקולות מלאות<br />

נוירוטנסמיטורים לחלל הסינפטי אינם מתבטאים בתאים מסוג II אלא בתאים מסוג<br />

.(180 ,36 ,28) III<br />

ממצאים אלו מציעים מנגנון בו תאי הטעם עצמם אינם מקיימים תקשורת ישירה עם תאי עצב אלא עם<br />

התאים מסוג<br />

,III<br />

ואלה הם המעבירים את המידע לתאי העצב<br />

‏(איור 1.4).<br />

בעקבות מחקרים אשר הראו שחרור של הנוירוטרנסמיטור סרוטונין לאחר גירוי תאי טעם<br />

וביטוי ספציפי של הקולטן לסרוטונין<br />

(67-69)<br />

(5-hydroxytryptamine) 5-HT<br />

בתאי הטעם<br />

,(81 ,80)<br />

17

סרוטונין הוצע להיות אחד הנוירוטרנסמיטורים המעורבים בהעברת האינפורמציה אל תאי העצב.‏ אך<br />

לאור העובדה שעכברי knock-out ל-‏ 5-HT לא הראו שינוי התנהגותי כלשהו<br />

משחק תפקיד שונה.‏ לעומת זאת,‏<br />

,(45)<br />

(45) Finger et al.<br />

נראה שסרוטונין<br />

הראו שמולקולת ה-‏ ATP מהווה נוירוטרנסמיטור<br />

אשר מעורר ישירות את תאי עצב הראשוניים המעצבבים את פקיעית הטעם<br />

(primary afferent<br />

.nerves)<br />

אלו<br />

בנוסף,‏ הקולטנים היונוטרופיים ל-‏<br />

,P2X3 ו-‏ P2X2<br />

,ATP<br />

(12) ו-‏<br />

מתבטאים ספציפית בתאי עצב<br />

knock-out בהם מחליש באופן דרמטי את התגובה לטעמנים מרים,‏ מתוקים ואוממים<br />

.(45)<br />

הגילוי ש-‏ ATP משוחרר מתאים מסוג II וששחרור סרוטונין מתבצע בתאים מסוג III הביא למודל בו<br />

לאחר גירוי הקולטנים לטעם ע"י טעמנים,‏ תאי הטעם משחררים ATP בצורה פרה-קרינית אשר יהווה<br />

מצד אחד נוירוטרנסמיטור ישיר לתאי העצב,‏ אך ייתכן גם לתאים מסוג<br />

זאת,‏ משחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו<br />

.III<br />

התאים מסוג<br />

,III<br />

‏(איור 1.4).<br />

לעומת<br />

איור 1.4<br />

– דרכי תקשורת בין תאים בתוך פקיעית הטעם.‏<br />

לאחר גירוי הקולטנים לטעם אשר בקצה האפיקלי של תאי הטעם ‏(תאים מסוג משוחרר בצורה פרה-‏<br />

קרינית ומהווה נוירוטרנסמיטור לתאי העצב fibers) (sensory afferent אך גם לתאים מסוג בתגובה,‏ התאים<br />

מסוג III משחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו.‏ לקוח מתוך<br />

ATP ,(II<br />

.III<br />

.(143)<br />

1.5.2<br />

בשם<br />

- תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים<br />

ישנה מחלוקת בספרות לגבי יכולתו של תא טעם בודד לחוש במקביל במספר טעמים ‏(תופעה הקרויה<br />

,(multiple modalities broadly tuned cells<br />

תאים,‏ כאשר כל אחת רגישה לטעם אחר<br />

או שמא מתקיימות תתי אוכלוסיות שונות של<br />

.(single taste modalities tuned cells)<br />

בנוסף,‏ מנגנון<br />

העברת המידע מתא הטעם אל המוח מהווה גם הוא נושא לדיון מדעי:‏ אפשרות ראשונה הינה שסיבי העצב<br />

מעצבבים באופן ייחודי תאים אשר רגישים לאותו הטעם ולכן מעבירים מידע עבור אחד מן טעמים בלבד,‏<br />

וזהות הטעם נקבעת על פי העצב המעוצבב<br />

.(labeled-line model)<br />

מודל מנוגד מציע שסיבי עצב<br />

18

מעצבבים ללא הבחנה תאי טעם שונים ולכן מעבירים את המידע עבור כל הטעמים (across fiber<br />

,model)<br />

וזיהוי הטעם עצמו טמון בעיבוד מידע נוסף אשר טרם פוענח.‏<br />

איור 1.5<br />

– קידוד הטעם בפריפריה.‏<br />

כאן מוצגים שני מודלים מנוגדים לקידוד הטעמים בפקיעית הטעם.‏ - במודל זה,‏ התאים מתוכננים להגיב לטעם<br />

אחד בלבד ומעוצבבים ע"י סיב עצבי ייחודי לכל טעם.‏ במקרה זה,‏ אין כל חפיפה בין הטעמים השונים.‏<br />

אפשרויות למודל בו סיבי העצב מעבירים מידע עבור מספר טעמים.‏ ייתכן ותאי הטעם רגישים לכל הטעמים<br />

השונים וכל תא טעם מעוצבב ע"י סיב עצב אחר או שכל תא טעם רגיש לטעם אחד בלבד וסיבי העצב<br />

מעצבבים ללא הבחנה תאים בעלי אופי שונה במקרים אלו,‏ ההבחנה הסופית בין הטעמים השונים תיעשה ע"י<br />

סיבי העצב או המוח בדרך ייחודית.‏ לקוח מתוך<br />

מספר מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וניסויי<br />

– c ,b שתי<br />

a<br />

(b)<br />

.(c)<br />

.(23)<br />

calcium-imaging<br />

הראו שתאי טעם מבודדים מסוגלים<br />

להגיב ליותר מטעם אחד והציעו מודל בו תאי הטעם עצמם מגיבים למספר טעמים וההבחנה בין הטעמים<br />

נעשית ברמת העברת המידע לסיבים עצביים<br />

ב-‏<br />

.(152 ,141 ,52 ,19)<br />

בנוסף,‏ מחקר בו נעשה<br />

knock out<br />

gustducin<br />

הראה ירידה בתגובה לתרכובות מרות וגם מתוקות<br />

.(176)<br />

מחקרים מראים שהקולטנים למר ולמתוק אינם מתבטאים באותם תאים.‏ כבר ב-‏<br />

מצד שני,‏ מספר רב של<br />

Hoon et al. ,1999<br />

(62)<br />

הראו שבשלושת סוגי הפפילות,‏<br />

T1Rs<br />

ו-‏ T2Rs מתבטאים בתתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם.‏<br />

בשנים האחרונות,‏ שימוש מרובה בחולדות מהונדסות גנטית אפשר לשפוך אור על נושא זה.‏ ניסוי בו<br />

חולדות הונדסו באופן כזה שהגן PLCβ2 יבוטא אך ורק בתאים המבטאים את הקולטנים למר,‏ הראה<br />

שבאופן סלקטיבי מאוד הטעם המר בלבד חודש ‏(למרות ש-‏ PLCβ2 מעורב בחישת הטעמים מר,‏ מתוק<br />

ואוממי),‏ ומתוך כך הוסק שהטעמים השונים אינם תלויים באותם תאי הטעם<br />

.(183)<br />

במחקר אחר,‏ קולטן<br />

לאופיואידים RASSL) (κ-opioid receptor בוטא בתאי טעם תחת הפרומוטור של הקולטנים למתוק.‏<br />

החוקרים הראו שהמולקולה spiradoline אשר מהווה ליגנד ל-‏ RASSL וחסרת טעם בדרך כלל,‏ הפכה<br />

למולקולה מתוקה.‏ לעומת זאת כאשר<br />

RASSL<br />

spiradoline למרה .(114)<br />

כמו כן,‏<br />

Huang et al.<br />

בוטא תחת הפרומוטור לקולטנים מרים,‏ הפכה<br />

(65) הראו שהרס ספציפי של תאים אשר מבטאים<br />

את הקולטנים לאחד הטעמים ‏(מר,‏ מתוק או אוממי)‏ מבטל ייחודית את הטעם עצמו מבלי לפגוע בטעמים<br />

19

האחרים.‏ מחקרים אלו ביחד עם רבים נוספים מהווים עדויות יותר ויותר מבוססות התומכות במודל ה-‏<br />

.labelled line<br />

- 1.6<br />

מסוג GPCR<br />

1.6.1<br />

משפחת ה-‏<br />

מנגנון סיום העברת האותות ‏(דסנסיטיזציה)‏ של קולטנים<br />

- תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

GPCRs<br />

,(G-protein-coupled receptors) GPCRs<br />

לה משתייכים קולטני הטעם,‏ הינה המשפחה<br />

הגדולה ביותר של קולטנים המתבטאים על פני הממברנה הפלסמטית של התא.‏ לאחר קשירת הליגנד<br />

לקולטן,‏ קיימים מספר מסלולי העברת אותות אפשריים,‏ התלויים בסוג חלבון ה-‏<br />

G<br />

המוצמד לקולטן<br />

עצמו,‏ ומערבים שפעול ‏(או עיכוב)‏ של אנזימים ציטוזוליים ‏(אדניליל ציקלאז,‏ פוספודיאסטראזות,‏<br />

פוספוליפאזות ועוד)‏ אשר מעבירים את ה"מידע"‏ הלאה בתוך ציטוזול התא.‏ כל המערכות בהן מעורבים<br />

קולטנים מסוג GPCR מראות הסתגלות בעוצמת תגובתן לסביבה:‏ רגישות התא לסיגנל מסוים בדרך כלל<br />

משתנה על פי העוצמה ומשך הסיגנל.‏ מטרת מנגנון אדפטציה זה הינו למנוע תגובת יתר לסיגנל אינטנסיבי<br />

או ממושך מדי באופן המסכן את מערכות הגוף.‏ כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית לליגנד או חשיפה<br />

לריכוזי ליגנד גבוהים,‏ קולטני ה-‏<br />

GPCR<br />

עוברים תהליך מורכב הנקרא ‏"דסנסיטיזציה"‏<br />

(desensitization) אשר מוריד את רגישותו של הקולטן ואת יכולתו להגיב לליגנדים סביבתיים.‏ אחד<br />

השלבים העיקריים של תהליך זה הינו זרחון הקולטן בקצה ה-‏ C טרמינלי וב-‏ loop השלישי התוך-תאי<br />

שלו ע"י קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

(G-protein-coupled GRKs הנקראות serine/threonine kinases<br />

kinases) receptor ‏(איור .(1.5<br />

בעקבות זרחון הקולטן ע"י ה-‏<br />

,GRKs<br />

החלבון β-arrestin מונע אל<br />

הממברנה ונקשר ספציפית לאתרים המזורחנים של הקולטן:‏ קשירה זו תמנע מנקודה זו ואילך כל<br />

אפשרות לשפעל חלבוני<br />

G<br />

נוספים,‏ ובכך מסמנת את תחילת כיבוי מסלול העברת האותות.‏ על מנת<br />

להרחיק סופית את הקולטן מן הממברנה הפלסמטית וכך למנוע ממנו כל שפעול אפשרי נוסף,‏ מתקיים<br />

תהליך נוסף הקרוי בשם אינטרנליזציה<br />

מספר רב של חלבונים נוספים,‏ כגון<br />

.(internalization)<br />

,clathrin ו-‏ AP2<br />

של הקולטן לתוך ציטוזול התא דרך יצירת ווסיקולה בשם<br />

לקומפלקס קולטן/‏β-arrestin נקשרים עתה<br />

היוצרים יחד קומפלקס ענק אשר גורם להחדרתו<br />

.clathrin-coated pit<br />

לאחר האינטרנליזציה,‏<br />

הקולטן יכול לעבור תהליך של מחזור לממברנה הפלסמטית,‏ או לחילופין עיכול אנזימטי לאחר איחוי<br />

ווסיקולת ה-‏<br />

clathrin-coated pit עם ליזוזום.‏<br />

הוכח במספר מחקרים שביטול או פגיעה בפעילותם של ה-‏<br />

(142 ,47 ,46) GRKs<br />

-β וכן של ה-‏<br />

,14) arrestin<br />

לאחר גירוי.‏<br />

זרחון של קולטן ה-‏<br />

15) גורמים לפעילות יתר של הקולטן ולחוסר יכולת של המערכת הנחקרת ‏"להירגע"‏<br />

GPCR ע"י GRKs<br />

לאחר שפעולו ע"י ליגנד נקרא בספרות ‏"דסנסיטיזציה<br />

הומולוגית"‏ ונבדל מ-"הדסנסיטיזציה ההטרולוגית"‏ אשר מתארת זרחון של הקולטן ע"י הקינאז ,PKA<br />

20

ובמקרים מסוימים גם ע"י<br />

PKA .(150 ,38 ,26) PKC<br />

PKC ו-‏<br />

serine/threonine kinases<br />

שונות משל ה-‏<br />

.GRKs<br />

משתייכים אף הם למשפחת ה -<br />

אך מזרחנים קולטנים גם כאשר הם אינם תפוסים ע"י ליגנד ובעמדות<br />

מעבר לתפקידו בשיתוק הקולטן והרחקת הקולטן מהממברנה הפלסמטית,‏ לזרחון הקולטן ע"י<br />

GRKs ו -<br />

PKA השלכות רבות לגבי מסלולי העברת אותות המשופעלים מאוחר יותר,‏ אשר יפורטו בפרק 1.6.4.<br />

,(∗<br />

איור 1.5<br />

– בקרת פעילותו של קולטן GPCR ע ‏"י תהליך הדסנסיטיזציה ואינטרנליזציה.‏<br />

משתחררות ומשפעלות את מסלול העברת<br />

תת-היחידות של חלבון ה-‏ לאחר קשירת הליגנד ‏(מסומן ב-‏ האותות ‏(שלב 1). לאחר מכן,‏ GRKs מזרחנים את הקולטן התפוס ע"י ליגנד וגורמים כך לקשירת<br />

הקומפלקס קולטן/‏β-arrestin הופך מטרה לקשירה למספר חלבונים ביניהם<br />

לקצה ה-‏ C‏-טרמינלי שלו ‏(שלב אשר גורמים להחדרת הקולטן לציטוזול<br />

(AP-2) ו-‏ פוספואינוזיטידים לאחר האינטרנליזציה,‏ הקומפלקס קולטן/‏β-arrestin הינו אחראי לשפעול של מספר מסלולי<br />

התא ‏(שלב או מחזור חזרה לממברנה הפלסמטית ‏(שלב<br />

ולאחר מכן יכול לעבור דגרדציה ‏(שלב העברת אותות ‏(שלב 5b). לקוח מתוך<br />

β-arrestin<br />

G<br />

,(PIP2)<br />

(5a<br />

.(2<br />

adapter protein 2 ,clathrin<br />

.(3<br />

(4<br />

.(112)<br />

21

1.6.2<br />

משפחת ה-‏<br />

- מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

GRKs<br />

GRKs<br />

מורכבת משבע קינאזות אשר מזהות באופן ייחודי קולטנים תלויי חלבון<br />

G<br />

(GPCRs) ומזרחנות באופן ספציפי את חומצות האמינו סרין וטראונין.‏ משפחה זו מחולקת לשלוש תת<br />

משפחות:‏ א)‏ לתת המשפחה הראשונה משתייכים<br />

,GRK7 ו-‏ GRK1<br />

אשר מתבטאים יחודית במערכת<br />

הראייה,‏ ב)‏ לתת המשפחה השנייה,‏ אשר מכונה גם משפחת הקינאזות של הקולטן הבטא-אדרנרגי<br />

(βARK)<br />

משתייכים<br />

GRK2 ו-‏ ,GRK3<br />

ולבסוף ג)‏ משפחת ה-‏<br />

GRK4<br />

לה משתייכים<br />

,GRK4<br />

GRK5<br />

∼270)<br />

ו-‏<br />

משפחת ה-‏<br />

.GRK6<br />

חומצות<br />

GRKs ל-‏<br />

השונים מבנה שמור למדי המורכב משלושה אזורים:‏ מרכז החלבון<br />

אמינו)‏ בעל הפעילות הקטליטית ‏(זרחון חומצות אמינו סרין וטראונין)‏ שמור בתוך<br />

∼45%) serine/threonine kinases הומולוגיה).‏<br />

הקצוות ה-‏ N ‏-טרמינליים<br />

(185∽ חומצות<br />

אמינו)‏ מעורבים בזיהוי חלבון המטרה ‏(הסובסטרט)‏ ומראים הומלוגיה נמוכה בין האנזימים השונים<br />

.(∼27%)<br />

הקצוות ה-‏ C‏-טרמינליים אינם מראים כלל הומולוגיה,‏ הם בעלי אורך משתנה באנזימים שונים<br />

(105-230∽ חומצות אמינו),‏ וקובעים את מיקום האנזים ותנועתו בתא בכך שהם מקיימים אינטראקציה<br />

עם ליפידים ו/או חלבונים ממברנליים שונים.‏ הקצה ה-‏ C‏-טרמינלי של<br />

הנקרא<br />

GRK2 ו-‏<br />

(PH) pleckstrin homology domain<br />

היחידות βγ של חלבוני ה-‏ G. מכיוון ש-‏<br />

אשר מאפשר קשירה לפוספוליפיד<br />

GRK3 מכיל אזור<br />

PIP2 ולתת -<br />

GRK2 ו-‏<br />

שמטרתן של אינטראקציות מסוג זה לאפשר הימצאות של חלק מן ה-‏<br />

הופעל הקולטן.‏<br />

GRK3 הינם בעיקר חלבונים ציטוזוליים נראה<br />

GRKs<br />

GRK4 ו-‏<br />

הקבועה בממברנה הפלסמטית.‏ לעומתם,‏<br />

קרוב לממברנה בטרם<br />

GRK6 עוברים פלמיטואילציה (palmitoylation) אשר גורמת להימצאותם<br />

GRK1 ו-‏<br />

(farnesylation)<br />

בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי שלהם.‏<br />

GRK7 הינם בעיקר ממברנליים הודות לפרנזילציה<br />

GRK5<br />

נמצא אף הוא קשור לממברנה באופן קבוע<br />

הודות לאתר בקצה ה-‏ N‏-טרמינלי שלו הקושר PIP2 ולאתר בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי הקושר פוספוליפידים<br />

באופן קונסטיטוטיבי.‏<br />

לעומת<br />

,GRK4 ,GRK1<br />

ו-‏<br />

GRK7 מתבטאים אך ורק ב-‏<br />

GRK7<br />

הצרבלום במוח,‏ בכליה ובאשכים),‏<br />

הגוף<br />

אשר מתבטאים באופן יחודי ברקמות ספציפיות<br />

GRK1)<br />

,retinal cones ו-‏ retinal rods<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ו-‏<br />

.(ubiquitously expressed)<br />

הרחב ביותר של מערכות פיזיולוגיות<br />

ו-‏<br />

כאשר GRK4 נמצא בעיקר ברקמות<br />

GRK6 מתבטאים בכמעט כל רקמות<br />

מסיבה זו,‏ ארבעת הקינאזות האלו הינן אחראיות על וויסות המגוון<br />

.(135)<br />

1.6.3<br />

- בקרה על פעילות<br />

GRK2<br />

GRK2<br />

הינו האיזופורם הנחקר ביותר בספרות מכל משפחת ה-‏<br />

knock-out בו גורם ל-‏ 100% מוות עוברי<br />

המגוון הרחב ביותר של קולטני<br />

.GRKs<br />

GRK זהו ה-‏<br />

,(70)<br />

,GPCR<br />

היחיד אשר<br />

כאשר הוא נמצא מעורב בתהליך הדסנסיטיזציה של<br />

שהידוע מביניהם הינו הקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי<br />

(β2-<br />

.adrenergic receptor – β2AR)<br />

GRK2 נמצא מעורב בתפקוד תקין של המערכת הקרדיווסקולרית,‏<br />

22

המערכת האימונית,‏ מערכת העצבים,‏ התפתחות העצם ועוד<br />

.(135)<br />

בקרת פעילותו של<br />

הינה GRK2<br />

תהליך מורכב המשלב אינטראקציות תוך-מולקולריות,‏ קשירה לחלבונים ציטוזוליים שונים ‏(כגון תת-‏<br />

היחידה<br />

G) של חלבון βγ<br />

וזרחון על ידי קינאזות אחרות<br />

.(140)<br />

איור 1.6<br />

– משפחת ה-‏<br />

קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

החלבון בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי<br />

לקוח מתוך<br />

.GRKs<br />

GRKs<br />

עבור GRK4 palmitoylation לעומת GRK7 ו-‏ עבור GRK1 farnesylation)<br />

.(128)<br />

ו-‏ .(GRK6<br />

חולקו לתתי משפחות על פי הומולוגיה בין הרצפים והשינויים שלאחר תרגום<br />

אחד ממנגנוני הבקרה על ה-‏ GRKs מתווך על ידי קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

.serine/threonine kinases<br />

זרחון GRK2 בעמדות של סרינים ספציפיים יכול,‏ במצבים שונים,‏ לגרום לעיכוב או להגברת פעילות<br />

האנזים.‏ מחקרים הראו שזרחון<br />

GRK2 בעמדת<br />

לעיכובו,‏ ע"י כך שאינו מאפשר את קשירתו ל-‏<br />

Ser670 ע"י הקינאז ERK ממשפחת ה - MAPK גורם<br />

.(43) Gβγ<br />

לעומת זאת זרחון בעמדת<br />

PKA גורם להגברת הפעילות,‏ על ידי כך שנחשפים אזורים המעורבים בקשירה ל-‏<br />

מנגנון בקרה נוסף אשר התגלה לאחרונה מתווך על ידי קינאז בשם<br />

Ser685<br />

.(29) Gβγ<br />

,c-Src<br />

ממשפחת ה-‏<br />

ע"י<br />

tyrosine<br />

,kinases<br />

ומערב זרחון של GRK2 בעמדות טירוזינים שונות בקצה ה-‏ N‏-טרמינלי<br />

הראו שזרחון מסוג זה מגדיל את האפיניות של<br />

ציטוזוליים כגון<br />

.(151 ,44)<br />

GRK2<br />

.Gα 11 ו-‏ Gα q<br />

הוכח שאינטראקציה מסוג<br />

מחקרים<br />

כלפי חלבונים ממברנליים ‏(קולטנים)‏ וכן<br />

Gα q /GRK2<br />

.(35) Gq<br />

גורמת לעיכוב של חלבון ה-‏<br />

לכן,‏ זרחון ה-‏ GRK ע"י c-Src גורם לדיכוי מזורז של מסלול העברת האותות ע"י עיכוב<br />

23

מסלול ה-‏<br />

Gαq/PLCβ2<br />

ספציפית ל-‏ GRK2 ולא נמצאה ב-‏<br />

במקביל לדסנסיטיזציה מוגברת של קולטן ה-‏ .GPCR בקרה מסוג זה הינה<br />

או .GRK6 אחרים כגון GRK5 GRKs<br />

1.6.4<br />

- שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

GPCRs<br />

במשך תקופה ארוכה,‏ נחשב תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏ GPCRs לתהליך אשר מטרתו היחידה<br />

הייתה כיבוי העברת האותות לאחר שפעול הקולטן.‏ בשנים האחרונות,‏ מחקרים רבים הראו שלא כך<br />

המצב:‏ ישנן היום ראיות מוצקות לכך שתהליך הדסנסיטיזציה מעורר בעצמו מסלולי העברת אותות<br />

מאוחרים יותר,‏ כאשר העיקרי מביניהם הינו מסלול ה-‏<br />

(Mitogen-activated protein MAPK<br />

.(100 ,99 ,92) kinases)<br />

ישנן שתי דרכים דרכן קולטן ה-‏ β2AR ‏(לגביו נעשו רוב המחקרים בנושא)‏ גורם לשפעול של מסלול ה-‏<br />

:MAPK<br />

אחת התלויה בזרחון הקולטן ע"י (PKA dependent) PKA והשנייה התלויה בזרחון הקולטן<br />

ע"י GRK וקשירת β-arrestin אליו<br />

גירוי הקולטן ה-‏<br />

.(β-arrestin dependent)<br />

β2AR<br />

גורם לשפעול ושחרור חלבון<br />

G s<br />

וכך לשפעול אדניליל ציקלאז,‏ היווצרות<br />

השליח המשני cAMP ושפעול PKA .PKA עצמו יכול לזרחן בחזרה את הקולטן ה-‏ β2AR ‏(כמתואר<br />

בפרק<br />

לחלבון<br />

ה-‏<br />

בשם<br />

.(1.6.1<br />

,32)<br />

G i<br />

,Ras<br />

כתוצאה מזרחון זה,‏ האפיניות של הקולטן לחלבון G s יורדת לטובת אפיניות גדולה יותר<br />

182). נמצא שתת-היחידה βγ המשתחררת מחלבון ה-‏ G i מסוגלת לשפעל את מולקולת<br />

אשר משפעל את c-Src ומכאן את מסלול ה-‏<br />

,MAPK<br />

עד לקינאזות<br />

,p42/44<br />

.(98 ,13) ERK1/2<br />

שפעול זה של<br />

ERK1/2 דרך<br />

הידועות גם<br />

PKA הינו מהיר למדי וקורה בפחות מ-‏<br />

2<br />

דקות.‏<br />

בנוסף,‏ נמצא שהקומפלקס של הקולטן המזורחן ע"י GRK יחד עם ה-‏ β-arrestin מסוגל לשפעל גם הוא<br />

את c-Src ולכן גם הוא גורם לשפעול מסלול ה-‏ MAPK<br />

.(97)<br />

שפעול של ERK1/2 בדרך זו נראה<br />

מאוחר יותר יחסית לשפעול ע"י PKA ‏(היות וזרחון הקולטן ע"י GRK וקשירת β-arrestin אליו הינו<br />

תהליך ארוך יותר)‏<br />

,<br />

אך קיים לזמן ארוך הרבה יותר ‏(עד<br />

ERK1/2 בדרך זו הינה תלויה בחוזק האינטראקציה בין הקולטן ל-‏<br />

בזהות חומצות האמינו המזורחנות ע"י ה-‏<br />

30-45 דקות)‏ .(155)<br />

β-arrestin<br />

GRKs השונים .(155)<br />

מחקרים הראו ששפעול<br />

(87) אשר תלוי בעצמו<br />

- חשיבות המחקר ומטרת העבודה<br />

1.7<br />

בשנים האחרונות עלתה בעולם המערבי צריכת הסוכר בצורה ניכרת,‏ דבר המגביר את הסיכון והרגישות<br />

למחלות כגון השמנה,‏ יתר לחץ דם,‏ סכרת וכו'.‏ פתרון אפשרי לבעיה זו הוא מציאת ממתיק מלאכותי בעל<br />

טעם זהה לסוכר טבעי אך במהותו חסר קלוריות.‏ טרם נמצא ממתיק מלאכותי כזה שמתיקותו וטעמו יידמו<br />

לאלה של סוכרים כגון סוכרוז,‏ הנחשב לממתיק אופטימלי.‏ בנוסף,‏ צריכת ירקות ופירות מסוימים בעלי<br />

טעם מר כגון חסה,‏ ברוקולי,‏ כרוב,‏ כרובית,‏ אשכוליות איננה עולה עקב טעם חזק הנתרם ע"י פנולים<br />

24

ותרכובות אחרות ‏(חלקן הגדול בעלות ערך תזונתי או בריאותי).‏ בנוסף,‏ התפתחות מנגנוני עיבוד המזון<br />

בתעשייה הביאה במקרים מסויימים להיווצרות תרכובות מרות ‏(חלקן בעלות תרומה תזונתית)‏ אשר<br />

עלולות לגרום לדחייה של מוצרים אלו.‏ לכן,‏ על מנת למסך את המרירות במזונות המעובדים,‏ מוסיפות<br />

חברות המזון ממסכי מרירות הכוללים לעיתים סוכר,‏ דבר הגורם להשקעת כסף רב והפיכת המוצרים<br />

לעתירי קלוריות.‏<br />

1.7<br />

איור – מבנים מולקולריים של מספר תרכובות מרות ומתוקות אמפיפטיות ‏(המרות מוצגות בצד<br />

שמאל,‏ המתוקות בצד ימין)‏ אשר שימשו במחקר הנוכחי.‏<br />

ידוע כי תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מעוררים תחושות ‏"מוזרות"‏ של טעמי לוואי כגון הטעם<br />

המתכתי.‏ תופעה ידועה נוספת הינה תופעת ה-"טעם המים המתוקים"‏<br />

,(water sweet aftertaste)<br />

המתארת מצב בו מים מורגשים כמתוקים כאשר הם נבלעים לאחר טעימת ממתיקים כגון סכרין או<br />

אצסולפאם-‏K‏.‏ במשך שנים,‏ לא נמצא הסבר לתופעה זו עד שלאחרונה פורסם מחקר אשר מציע מנגנון<br />

חדש בו הממתיק עצמו יכול,‏ בריכוזים גבוהים,‏ לפעול כמעכב לקולטן למתוק על ידי קשירה לאזור<br />

25

הטרנסממברנלי של .T1R3 שטיפה של הטעמן ע"י בליעת המים משחררת את הקולטן מהמעכב שלו וכך<br />

המים מורגשים כמתוקים<br />

.(49)<br />

בנוסף,‏ ידוע כי בניגוד לסוכרים טבעיים המורגשים מיד לאחר הטעימה ולמשך זמן קצר,‏ הטעם של<br />

תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגיע לשיא לאחר זמן ממושך,‏ תופעה הידועה בשם<br />

ונשאר זמן רב בפה,‏ תופעה המכונה שאריתיות או<br />

,slow onset<br />

.lingering aftertaste<br />

תופעת השאריתיות גורמת<br />

לתחושה לא נעימה לאורך זמן ‏(לעתים עשרות דקות)‏ לאחר סיום צריכת מוצר המזון,‏ ובכך מהווה גורם<br />

מגביל לצריכה רחבה יותר של מוצרים הכוללים תרכובות מסוג זה.‏ המנגנון המולקולרי של תופעת<br />

השארתיות אינו ידוע.‏<br />

תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגוונים מאוד במבנה שלהם אך לרובם תכונה משותפת בהיותם<br />

תרכובות אמפיפטיות,‏ כלומר מולקולות בעלות חלק הידרופובי וחלק הידרופילי ‏(איור<br />

.(1.7<br />

לפני מספר שנים,‏ הועלתה ההשערה לפיה תכונת האמפיפטיות מקנה לתרכובות אלו אפשרות להיצמד<br />

לממברנת התא,‏ לחדור דרכה לתוך הציטוזול,‏ ושם להשפיע על פעילותם של מרכיבים תוך תאיים.‏ בעבר<br />

נמצא שתרכובות אמפיפטיות מרות יכולות לחדור ממברנות ליפוזומים<br />

אינטראקציה ישירות עם חלבוני G<br />

אנזימים כגון פוספודיאסטראזות<br />

,(133 ,132 ,22)<br />

,(116)<br />

לעכב או ולהפעיל תעלות מסוגים שונים<br />

,(170 ,31)<br />

(132) Peri et al. .(144)<br />

,cyclo(Leu-Trp)<br />

לעבור<br />

או לעכב<br />

הראו שתרכובות מרות כמו כינין ו-‏<br />

ותרכובות מתוקות כמו סכרין ו-‏ D‏-טריפטופן אכן חודרות לתוך תאי טעם בפפילה<br />

מבודדת ‏(המופרדת מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז)‏ וגם לתוך תאי טעם בפקיעיות מבודדות.‏<br />

השערת העבודה הינה שבמקביל לקשירה לקולטן והפעלת מסלול העברת האותות,‏ תרכובות מרות<br />

ומתוקות אמפיפטיות מסוגלות לחדור את ממברנת תאי הטעם ומרגע שנמצאות בתוך ציטוזול התא,‏<br />

משבשות את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן<br />

.GRKs<br />

(desensitization)<br />

עיכוב פעילותן של ה-‏ GRKs תגרום לעיכוב<br />

ולכן למסלול העברת האותות להימשך זמן רב<br />

יותר.‏ תופעה כזו,‏ אם תוכח,‏ תהווה מנגנון אפשרי לתופעת השאריתיות ‏(איור 1.8).<br />

ד"ר מירב צוברי-סמואלוב הראתה בעבודת הדוקטור שלה כי טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים מסוגלים<br />

לעכב<br />

in-vitro<br />

את פעילותן של<br />

הדסנסיטיזציה של מגוון קולטני GPCR<br />

,PKA ו-‏ GRK5 ,GRK2<br />

.(186)<br />

שלוש קינאזות אשר אחראיות על מנגנון<br />

26

איור<br />

(T)<br />

– 1.8<br />

.GPCRs<br />

השערת העבודה:‏ טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

המודל מתאר מצב בו טעמנים מרים ומתוקים אמפיפטיים משפעלים מצד אחד את הקולטן שלהם אך (R)<br />

במקביל חודרים לתוך ציטוזול תאי הטעם ושם מעכבים את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה-‏ ,GRK ובדרך זו<br />

של הקולטן.‏ במקרה כזה,‏ הקולטן צפוי להראות פעילות<br />

מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה<br />

ממושכת מהרגיל.‏<br />

(desensitization)<br />

מטרה ראשונה של עבודת המחקר הנוכחית הייתה להוכיח את יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור<br />

באופן טבעי לתוך תאי הטעם ‏(דרך הצד האפיקלי,‏ בהתאם לתנאים פיזיולוגיים).‏ לשם כך נעשה בשלב<br />

ראשון בעזרת מיקרוסקופיה קונפוקלית מעקב דינמי אחר חדירתם של טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים<br />

לפפילת<br />

(CV) circumvallate<br />

שלמה ‏(שלא הופרדה מהלשון).‏ ניסויים נוספים נערכו בחולדות<br />

מורדמות במטרה להעריך את ריכוז הטעמנים בתוך תאי פקיעית הטעם לאחר צריכתם.‏ בשלב הבא,‏<br />

נבדקה נוכחותם של<br />

GRKs<br />

בתאי פקיעית הטעם מפפילת<br />

CV<br />

במטרה לזהות קיום מנגנון של<br />

דסנסיטיזציה הומולוגית לקולטני GPCRs בתאים אלו.‏ בנוסף,‏ נבחנה השפעתם של טעמנים אמפיפטיים<br />

מרים ומתוקים על מנגנון הדסנסיטיזציה המתווך ע"י<br />

,GRKs<br />

(β2AR)<br />

כמודל לקולטנים ממשפחת ה-‏<br />

,GPCRs<br />

ע"י שימוש בקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי<br />

לה משתייכים הקולטנים לטעם.‏ לשם כך נבחנה<br />

השפעתם של טעמנים חודרי ממברנות על שלושת הקריטריונים האופייניים לדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏<br />

(1 :β2AR<br />

דסנסיטיזציה של האותות ‏(סיגנל)‏ המועברים על ידי הקולטן;‏<br />

(2<br />

מידת זרחון הקולטן;‏<br />

(3<br />

אינטרנליזציה של הקולטן לציטוזול התא.‏ בנוסף,‏ נבחנה השפעה אפשרית של הטעמים האמפיפטיים על<br />

שפעול ERK אשר תלוי בדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏ β2AR עצמו.‏<br />

27

2. חומרים ושיטות<br />

- 2.1 חומרים<br />

- 2.1.1 רשימת חומרים<br />

Acetic acid<br />

Acetic anhydride<br />

Acrylamide-bis<br />

Adenosine 3’5’ cyclic monophosphate (cAMP)<br />

[ 125 -I]- cAMP (Adenosine 3’5’ cyclic phosphoric<br />

acid, 2’-O-succinyl [ 125 -I] iodotyrosine methyl ester<br />

Agarose<br />

Aprotinin<br />

Anti cAMP-BSA serum<br />

Benzamidine<br />

Bovine serum albumin (BSA)<br />

Caffeine<br />

Calcium chloride<br />

Collagenase D<br />

Coomassie brilliant blue G<br />

Cyclo (Leu-Trp)<br />

Deoxycholic acid sodium salt<br />

1,4-Diazabicyclo[2.2.2] octane (DABCO)<br />

Dimethylsulfoxide (DMSO)<br />

Dithiothreithol (DTT)<br />

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)<br />

Ether<br />

Ethidium bromide<br />

Ethyl alcohol<br />

Ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA)<br />

Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)<br />

-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)<br />

Fetal bovine serum (FBS) heat inactivated<br />

Glucose<br />

Glutamine solution<br />

Glycerol<br />

β-Glycerophosphate<br />

Glycine<br />

N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-<br />

N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)<br />

3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)<br />

Isopentane<br />

(−)-Isoproterenol hydrochloride (ISO)<br />

Leupeptin<br />

Magnesium chloride<br />

Frutarom, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Serva, Germany<br />

Sigma, USA<br />

NEN, USA<br />

Gibco, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Boehringer, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Bachem, Switzerland<br />

Fluka, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Gadot, Israel<br />

Tamar, Israel<br />

Bio-Lab, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Gibco, USA<br />

Merck, Germany<br />

Biological Industries,<br />

Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

28

Magnesium sulfate<br />

Neohesperidin dihydrochalcone (NHD)<br />

Naringin<br />

Optimal Cutting Temperature (OCT)<br />

Opti-MEM® I<br />

Orthovanadate<br />

Paraformaldehyde (PFA)<br />

Penicillin-Streptomycin<br />

Pepstatin A<br />

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)<br />

Potassium carbonate<br />

Potassium chloride<br />

Potassium dihydrogen phosphate<br />

Potassium iodide<br />

Propidium iodide<br />

Protein G PLUS-Agarose beads<br />

Pyruvic acid<br />

Quinine hydrochloride<br />

Sodium acetate<br />

Sodium bicarbonate<br />

Sodium chloride<br />

Sodium dodecyl sulfate (SDS)<br />

Sodium fluoride (NaF)<br />

di- Sodium hydrogen phosphate heptahydrate<br />

Sodium hydroxide<br />

Sodium phosphate<br />

Sodium saccharin<br />

Trichloroacetic acid (TCA)<br />

Tricine<br />

Triethylamine<br />

Tris (Tris [hydroxymethyl]aminomethane)<br />

Triton X-100<br />

Trypsin-EDTA solution C<br />

Trypsin inhibitor (type П-S: soybean)<br />

D-Tryptophan<br />

Tween-20<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Menzel-Glazer,<br />

Germany<br />

Gibco, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Biological Industries,<br />

Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Frutarom, Israel<br />

Frutarom, Israel<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Santa-Cruz, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Merck, Germany<br />

Frutarom, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Frutarom, Israel<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Biological Industries,<br />

Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

- 2.1.2 נוגדנים,‏ אנזימים,‏ חומצות גרעין וערכות<br />

GRK2, GRK5, GRK6, HA probe, β2AR and<br />

antiphosphoSer(355-356) β2AR first antibodies<br />

ERK and phosphoERK first antibodies<br />

HRP/FITC-conjugated secondary antibodies<br />

ECL luminescence kit<br />

all Santa-Cruz, USA<br />

Sigma, USA<br />

Jackson, USA<br />

Santa-Cruz, USA<br />

29

Rneasy Protect Starter kit<br />

PCR purification kit<br />

Reverse-iT 1 st strand synthesis kit<br />

ReddyMix PCR Master kit<br />

Red Load Taq Master<br />

Primers<br />

pcDNA3 plasmid containing human β2AR gene<br />

pcDNA3 plasmid containing HA tagged-β2AR gene<br />

MaxFect<br />

Qiagen, Germany<br />

Qiagen, Germany<br />

ABgene, UK<br />

ABgene, UK<br />

Larova GmbH, Germany<br />

HyLabs, Israel<br />

Dr. Lefkowitz, R.J.,<br />

Howard Hughes Medical<br />

Institute, Durham, NC,<br />

USA<br />

Missouri S&T cDNA<br />

Resource Center, USA<br />

(www.cdna.org)<br />

Molecula Research Labs,<br />

USA<br />

(www.molecula.com)<br />

- 2.1.3 בופרים ותמיסות<br />

Phosphate buffered saline (PBS X1): NaCl 120 mM, KCl 2.5 mM, EGTA 1 mM and<br />

Tris 2.0 mM titrated with HCl to pH 7.4.<br />

Bradford solution: Coomassie brilliant Blue G 10% (w/v), ethanol 4.75% (v/v) and<br />

phosphoric acid 8.5% (v/v) in DDW.<br />

Buffer A: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA<br />

1 mM, DTT 1 mM with HCl to pH 7.3.<br />

Buffer H: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA<br />

1 mM, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, aprotinin 10 μg/ml, leupeptin 10 μg/ml,<br />

pepstatin A, 2 μg/ml.<br />

Hank's buffer: NaCl 137 mM, KCl 5.3 mM, Na 2 HPO 4 0.3 mM, MgSO 4 0.4 mM,<br />

MgCl 2 0.5 mM, Hepes 5 mM, Tricine 6.5 mM, glucose 30 mM, NaHCO 3 4 mM.<br />

Mounting solution: Glycerol 90% (v/v), Tyrode 10% (v/v), DABCO 3% (w/v),<br />

sodium azide 0.1% (w/v).<br />

RIPA buffer: Tris 20 mM, NaCl 137 mM, Glycerol 10%, SDS 0.1%, Deoxycholate<br />

0.5%, Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Leupeptin 20 μM.<br />

Running buffer: Tris 25 mM, Glycine 192 mM and SDS 0.1% (w/v).<br />

Sample buffer X4: Tris 0.2 M, glycerol 40% (v/v), SDS 0.08% (w/v), DTT 0.1 M,<br />

bromophenol blue for blue color.<br />

TBST: Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.05% (v/v).<br />

30

Tyrode Buffer: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, Hepes 10 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 1 mM<br />

fixed to pH 7.4 with tris.<br />

TGPP: Tyrode buffer containing pyruvic acid 10 mΜ and glucose 10 mM.<br />

TAE buffer: Tris- acetate 40 mM, EDTA 1 mM.<br />

Transfer buffer: Tris 15 mM and Glycine 120 mM.<br />

31

2.2 שיטות<br />

2.2.1<br />

- הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות CV שלמות תוך מעקב דינמי<br />

במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי<br />

חולדות נקבות מזן<br />

(in situ)<br />

,Sprague-Dawley<br />

במשקל של<br />

150-175<br />

גרם,‏ התקבלו מבית החיות<br />

האוניברסיטאי.‏ החיות הוחזקו בכלובים בגודל 40×25 ס"מ עם מזון ומים ללא הגבלה,‏ בטמפרטורה של<br />

23±2°C ובמחזור הארה של 12 שעות אור,‏ 12 שעות חושך.‏ ביום הניסוי,‏ החולדות הורדמו ע"י אתר<br />

והומתו ע"י הסרת ראש .(decapitation)<br />

על מנת לעקוב אחר תנועה והצטברות של הטעמנים לתוך רקמת הפפילה,‏ ניצלנו את התכונות<br />

הפלואורסצנטיות שלהם תוך שימוש בשיטת מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית.‏ בעזרת מספריים<br />

עדינות וללא טיפול בקולגנאז,‏ הוצא מלשון החולדה משטח רקמת אפיתל בגודל של<br />

ובמרכזו פפילת ה-‏<br />

2X2X2<br />

circumvallate<br />

מ"מ<br />

(CV) ביחד עם רקמות השומן והשריר שבצד הבזולטרלי,‏ כך שהצד<br />

האפיקלי בלבד של הפפילה נמצא חשוף לסביבה,‏ בדומה למצב פיזיולוגי.‏ משטח זה הונח על זכוכית נושא<br />

בתוך 5 μL של בופר .TGPP<br />

של הטעמנים היה:‏ סכרין<br />

לאחר מכן,‏ הוספו 5 μL של תמיסה מרוכזת של טעמן כך שהריכוז הסופי<br />

,10 mM - D‏-טריפטופן ,10 mM -<br />

נרינגין<br />

,1 mM - CLT ,1 mM -<br />

.10 mM - וקפאין 1 mM -<br />

הצילומים התמקדו בתעלה הפנימית של הפפילה<br />

היכן שפקיעיות הטעם מרוכזות.‏ זמן הוספת הטעמן הוגדר כזמן<br />

כינין<br />

,(inner trench circle)<br />

,0<br />

כאשר רמת הפלואורסצנציה הותאמה<br />

לרמת הרקע.‏ לאחר מכן,‏ תמונות נוספות צולמו כל שתי דקות.‏ כביקורת,‏ צולמה הפפילה בתוך תמיסת<br />

TGPP<br />

בהיעדר טעמן.‏ לאחר<br />

6<br />

דקות של הדגרה עם הטעמן,‏ הוספה תמיסה של אשלגן יודיד<br />

בריכוז סופי של 0.5 M למשך שתי דקות נוספות.‏ KI הינו מלח מדעיך פלואורסצנציה<br />

(KI)<br />

(quencher)<br />

אשר אינו חודר ממברנות של תאים ולכן מטרתו בניסוי זה לגרום לדעיכת הפלואורסצנציה של מולקולות<br />

הטעמנים אשר נספחו על פני שטח ממברנת הפפילה.‏ על פי אותו היגיון,‏ מולקולות הטעמנים אשר חדרו<br />

דרך ממברנות התאים פנימה,‏ לתוך הציטוזול,‏ תהינה מוגנות מפני השפעת ה-‏KI‏.‏ כביקורת חיובית<br />

לפעילות המדעיך ולחיותם של תאי הטעם השתמשנו בפרופידיום יודיד<br />

,(50 μg/mL) PI<br />

תרכובת<br />

פלואורסצנטית אשר נקשרת לחומצות הגרעין אך אינה חודרת ממברנות של תאים חיים ולכן משמשת<br />

במחקרים רבים לזיהוי תאים מתים ע"י צביעת הגרעין שלהם.‏ התמונות נשמרו בפורמאט<br />

בעזרת התוכנות<br />

TIFF ועובדו<br />

.Adobe Photoshop ו-‏ Image-Pro Plus Media Cybernatics<br />

לפני שבוצעו ניסויים במיקרוסקופ הקונפוקלי,‏ נקבע כושרו של KI בהדעכת פלואורסצנציה של הטעמנים<br />

הנבדקים ופרופידיום יודיד מומסים בתמיסת<br />

TGPP<br />

בעזרת ספקטרופוטומטר מסוג<br />

Carry Eclipse<br />

.(Variant Australia PTY LTD, Australia) fluorescence spectrophotometer<br />

32

2.2.2<br />

- הפרדת פפילת ה-‏ CV בחולדה<br />

רקמת פפילת ה-‏ CV הופרדה מהלשון לפי<br />

(163) ‏(איור .(2.1<br />

החיות הורדמו בעזרת אתר והומתו ע"י<br />

הסרת ראש.‏ הלשון הוצאה ונשטפה מיד בבופר TGPP קר.‏<br />

במטרה להפריד בין רקמת הפפילה לבין רקמת החיבור בלשון,‏ הוזרקו מסביב לפפילה ומתחתה<br />

500 μl<br />

מתמיסה המורכבת מקולגנאז בריכוז של 4 mg/ml ומעכב טריפסין שמקורו מסויה בריכוז 4. mg/ml<br />

ההזרקה נעשתה בשש נקודות שונות<br />

) 5 מסביב,‏<br />

1 מתחת לפפילה)‏ תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.‏ לאחר<br />

תהליך ההזרקה,‏ הלשון הודגרה בתמיסת TGPP תוך בעבוע אוויר במשך 15 דקות בטמפרטורה של<br />

30<br />

. °C<br />

לאחר מכן ריבוע של אפיתל הכולל את הפפילה נגזר בעזרת מספריים עדינות,‏ הופרד ע"י משיכה<br />

עם פינצטה עדינה<br />

‏(מספר 5)<br />

ונשטף בתמיסת TGPP קרה<br />

.(4°C)<br />

ריבוע האפיתל הונח על צלחת בתוך תמיסת TGPP קרה כך שצינורות ההפרשה<br />

(von Ebner gland<br />

ducts) פונים כלפי מעלה.‏ הצינורות הוסרו בעזרת מספריים עדינות והפפילה הופרדה מרקמת האפיתל<br />

הלא סנסורי ע"י גזירה,‏ כך שהתקבל מבנה פרסה המכיל את פקיעיות הטעם והוא הפפילה ‏(איור<br />

.(2.1<br />

2.1<br />

- בידוד פפילת CV מלשון חולדה.‏<br />

איור אפיתל הלשון עם פפילת ה-‏ CV לאחר<br />

א-‏ טיפול בקולגנאז והסרתה מן הלשון השלמה.‏<br />

הסרת צינורות ההפרשה.‏<br />

ב-‏ חיתוך פפילת ה-‏ CV משטח האפיתל.‏<br />

אשר מכילה את<br />

פפילת ה-‏ ד-‏ האיברונים הסנסוריים מופרדת מן האפיתל<br />

הלא-סנסורי.‏<br />

לקוח מתוך (163).<br />

CV<br />

ג -<br />

2.2.3<br />

- הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CV וקביעת כמות חלבון<br />

פפילות CV אשר בודדו כמתואר בסעיף<br />

2.2.2 עברו<br />

הדגרה עם הטעמנים השונים,‏ נשטפו בבופר TGPP<br />

חמש פעמים,‏ ופוצצו ע"י סידרה של ארבע הקפאות והפשרות ב-‏ 20°C-. ממברנות התאים הושקעו ע"י<br />

סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב-‏ 20,000g בטמפרטורה של 4°C למשך<br />

45 דקות.‏<br />

הנוזל העליון שהכיל<br />

33

את תוכן התאים הופרד,‏ הוקפא,‏ יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של 20°C- עד לקביעה כמותית ב-‏<br />

.HPLC<br />

המשקע שהתקבל אחרי סרכוז הכיל את ממברנות תאי הפפילה ושימש לקביעת כמות החלבון בשיטת<br />

.(17) Bradford<br />

למשקע הוספו<br />

בטמפרטורה של 60°C. לאחר מכן הוספו<br />

של<br />

50 μl של תמיסת NaOH 5 M והתמיסה הודגרה במשך 45<br />

450 μl מים מזוקקים,‏<br />

50 μl לבדיקה.‏<br />

לכל דוגמא הוסף נפח של<br />

קריאת בליעה באורך גל של 595 nm<br />

BSA שימש לעקום כיול.‏<br />

,Bradford מתמיסת 250 μl<br />

דקות<br />

התמיסה עורבבה ונלקחו שלוש דגימות<br />

וכמות החלבון נקבעה בעזרת<br />

במכשיר ,(Bio-Tek®Instruments, Inc., USA) Elisa<br />

כאשר<br />

2.2.4<br />

- חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת CV<br />

חולדות הורדמו ע"י הזרקת<br />

vivo) (in בחולדות מורדמות<br />

0.5 mL פנטוברביטל mg/kg) 60 משקל גוף)‏<br />

לתוך חלל הבטן והונחו על<br />

משטח מיוחד שאיפשר הטיה נוחה של הגוף בזווית של 30° כלפי מטה,‏ כך שניתן היה לשמור על חלל<br />

הפה פתוח בעזרת פינצטה ‏(איור<br />

(2.2<br />

ולהזרים לסירוגין נפח של 10 מ"ל של הטעמן בעזרת פיפטת פסטר<br />

למשך 90 שניות ללא גרימת חנק לחיה.‏ ריכוזי הטעמנים היו כדלקמן:‏ D‏-טריפטופן<br />

- CLT ,30 mM -<br />

כינין ,2 mM<br />

קולגנאז ‏(כמתואר בסעיף<br />

מזוקקים פעמיים<br />

.10 mM - וקפאין 2 mM -<br />

.(2.2.2<br />

(DDW)<br />

CV נעשתה כמתואר בסעיף<br />

לאחר מכן החיות הומתו ופפילת ה-‏ CV הופרדה בעזרת<br />

הפפילה המופרדת העשירה בפקיעיות טעם הוכנסה ל-‏ 100 μL מים<br />

ונשמרה ב 70°C- עד להמשך הטיפול.‏ הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ה-‏<br />

.2.2.3<br />

הפה של החיה לא כללה את הטעמן.‏<br />

מאחר והטיפול בקולגנאז להוצאת פפילת ה-‏ CV מן הלשון ארך כ-‏<br />

כמות הטעמן אשר זרמה החוצה מתאי הטעם<br />

נוספים בהם פפילות<br />

חיות הביקורת טופלו באופן דומה,‏ אך התמיסה שהוזרמה לתוך חלל<br />

25 דקות,‏<br />

(efflux)<br />

CV<br />

הודגר בשלב ראשון 2 דקות ב<br />

שניות באותה טמפרטורה.‏ בתום<br />

הופרדו כמתואר בסעיף<br />

,2.2.2<br />

100 μL<br />

תמיסת<br />

נעשה ניסיון להעריך את<br />

במהלך טיפול זה.‏ למטרה זו,‏ בוצעו ניסויים<br />

נחתכו לשני חצאים שווים וכל חצי פפילה<br />

30°C ב-‏ TGPP<br />

ולאחר מכן עם טעמן למשך<br />

30<br />

30<br />

השניות,‏ חצי פפילה אחד נשטף 5 פעמים בתמיסת<br />

,TGPP הוכנס<br />

ל 100 μL<br />

מים מזוקקים והוקפא ב-‏ 70°C-. לעומתו,‏ חצי הפפילה השני הועבר לתוך 100 μL תמיסת<br />

30°C, למשך 25 דקות ב-‏ TGPP<br />

קולגנאז לאחר ניסויי ה-‏<br />

.in vivo<br />

בניסיון לחקות את זמן ההמתנה אותו עוברת פפילת ה-‏ CV בטיפול<br />

רק לאחר המתנה זו חצי הפפילה נשטף ונשמר בדומה לחצי הפפילה<br />

הראשון עד להמשך הטיפול של הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CV ‏(סעיף 2.2.3).<br />

לאחר הפרדת תוכן התאים כמתואר בסעיף<br />

בסעיף<br />

,2.2.3<br />

כמות הטעמן נקבעה בשיטת ה-‏<br />

HPLC<br />

.2.2.5<br />

כמתואר<br />

שיעור בריחת הטעמן החוצה בזמן הטיפול בקולגנאז הוערך ע"י השוואת כמות הטעמן<br />

שנמצאה בחצי הפפילה אשר נשטף 25 דקות לאחר הדגרה עם הטעמן יחסית לכמות הטעמן שנמצאה<br />

בחצי הפפילה שלא עבר את שלב ‏"ההמתנה".‏ לניסוי זה שימשו טעמנים בעלי אופי פלואורסצנטי או<br />

לחילופין בעלי בליעה גבוהה באור UV אשר אפשרה סף זיהוי נמוך במערכת ה-‏HPLC‏.‏<br />

34

איור 2.2<br />

- הזרמת תמיסת טעמנים לתוך פיה של חולדה מורדמת לצורכי בחינת יכולתם של טעמנים<br />

אמפיפטיים לחדור לתוך פפילת CV בתנאי<br />

.in vivo<br />

2.2.5<br />

- קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת CV בעזרת שיטת HPLC<br />

לאחר ייבוש תוכן התאים כמתואר בסעיף<br />

כרומטוגרפיה נוזלית<br />

,2.2.3<br />

.HPLC<br />

הבדיקה נעשתה במערכת מתוצרת<br />

כמות הטעמן שנכנסה לתוך תאי הטעם נמדדה בעזרת<br />

Merck-Hitachi (Darmstadt,<br />

Germany)<br />

המצוידת במשאבה<br />

, L-7100<br />

גלאי פלואורסצנטי<br />

F-1050<br />

וגלאי<br />

L-7455 UV<br />

(UltraViolet-visible diode-array)<br />

המחוברים בטור.‏ ההפרדה נעשתה בקולונה ארוכה<br />

(LiChroCart® או בקולונה קצרה (LiChroCart® 250-4 LiChrospher® 100 RP-18 (5 μm))<br />

.(186 ,132) בתוספת פרקולונה מתאימה של RP-18 55-4 Purospher Star RP-18 (3 μm))<br />

הטעמנים המתוקים סכרין ו-‏<br />

ונרינגין הופרדו בקולונה ארוכה וזוהו בגלאי<br />

,(NHD) neohesperidin dihydrochalcone<br />

.UV<br />

והטעמנים המרים קפאין<br />

לעומתם,‏ שלושת הטעמנים D‏-טריפטופן,‏ כינין<br />

והפפטיד (Leu-Trp) cyclo הופרדו בקולונה קצרה ונבדקו בגלאי הפלואורסצנטי כל אחד לפי אורכי גל<br />

עירור ופליטה מתאימים.‏ הטעמנים זוהו על פי זמני שהייה של כל אחד מהם בקולונה<br />

(RT - Retention<br />

, Time)<br />

וכומתו על בסיס עקומת כיול והשוואת שטחי פיקים שהתקבלו בדוגמאות לאותה עקומה.‏<br />

הפרדת סכרין נעשתה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת ממתנול ומחומצה אצטית 1.5%<br />

ביחסים של<br />

(v/v)<br />

(v/v) 20:80 בהתאמה,‏<br />

בקצב זרימה של<br />

.0.45 ml/min<br />

.268 nm<br />

בליעת סכרין נמדדה באורך גל של<br />

D‏-טריפטופן הופרד בקולונה קצרה ביחסים משתנים של חומצה אצטית (v/v) 1.5% ומתנול בגרדיאנט:‏<br />

יחסם של שני הסולבנטים<br />

(v/v) בזמן 0 היה ,5:95<br />

השתנה תוך 4 דקות ל-‏<br />

,25:75<br />

חזר תוך<br />

4 דקות<br />

35

ליחס התחלתי של 5:95 ונשאר כך עוד<br />

4 דקות,‏<br />

אורך הגל לעירור היה 280 nm ולפליטה 345. nm<br />

סה"כ 12 דקות הרצה.‏ קצב הזרימה היה<br />

.1 ml/min<br />

NHD<br />

הופרד בהרצה איזוקרטית בעזרת פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ומחומצה אצטית<br />

0.5% ביחסים של<br />

(v/v)<br />

(v/v) 65:35 בהתאמה,‏<br />

בקצב זרימה של<br />

.0.75 ml/min<br />

בליעת ה-‏ NHD נמדדה<br />

באורך גל של 282. nm<br />

נרינגין הופרד בקולונה ארוכה בהרצה איזוקרטית בסולבנט המורכב מאצטוניטריל ומים ביחסים של<br />

(v/v) 80:20 בהתאמה,‏<br />

בקצב זרימה של<br />

.1.0 ml/min<br />

הפאזה הנעה ששימשה להפרדת קפאין הייתה מורכבת ממתנול ומים ביחסים של<br />

בקצב זרימה של<br />

בליעת הנרינגין נמדדה באורך גל של 280. nm<br />

(v/v) 50:50 בהתאמה,‏<br />

.0.7 ml/min<br />

בליעתו של הקפאין נמדדה באורך גל של 268. nm<br />

כינין הופרד בקולונה קצרה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ובופר פוספאט<br />

שהכיל SDS 25 mM ,tetrabutylammonium bromide 3 mM ו-‏ KH 2 PO 4 10 mM והותאם ל-‏<br />

pH 2.3 ע"י חומצה אורתוזרחתית.‏ שני הסולבנטים היו ביחסים של (v/v) 50:50 וקצב הזרימה היה<br />

0.6<br />

.ml/min<br />

אורך הגל לעירור היה 343 nm ולפליטה 395. nm<br />

הפאזה הנעה אשר שימשה להפרדת הפפטיד<br />

ומים אשר הכילו<br />

של<br />

(CLT) cyclo (Leu-Trp)<br />

הייתה מורכבת מאצטוניטריל<br />

(v/v) 1% אצטוניטריל ו-‏ (v/v) 0.02% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) ביחסים<br />

(v/v) 70:30 בהתאמה,‏<br />

בהרצה איזוקרטית,‏ בקצב זרימה של<br />

.0.4 ml/min<br />

.345 nm ולפליטה 280 nm<br />

זמני שהייה (RT) של הטעמנים היו<br />

5.0 ,5.8 ,4.5 ,10.2 ,4.25 ,4.39 ,7.05<br />

טריפטופן,‏ ,NHD<br />

נרינגין,‏ קפאין,‏ כינין ו-‏ CLT בהתאמה.‏<br />

אורך הגל לעירור היה<br />

דקות עבור סכרין,‏ D-<br />

RT-PCR - 2.2.6<br />

2.2.6.1<br />

CV פפילות<br />

- הפקת רנ ‏"א כללי RNA) (total מתוך פפילת CV ואפיתל לא סנסורי<br />

מ-‏ 7 חולדות הופרדו מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז כמתואר בסעיף<br />

אוחדו 2.2.2,<br />

והוקפאו במבחנת אפנדורף ב-‏ 80- C° עד להפקת הרנ"א.‏ דגימות מן האפיתל הלא-סנסורי אשר בסמוך<br />

לפפילת ה-‏<br />

,CV בגודל 1x1x1<br />

מ"מ בקירוב<br />

‏(שטח דומה לזה של הפפילה),‏<br />

בתנאים זהים.‏ הרנ"א הכללי הופק בסביבה סטרילית ככל האפשר בעזרת<br />

נלקחו גם כן ואוחסנו<br />

Rneasy Protect Starter kit<br />

,(Qiagen, Germany)<br />

2.2.6.2<br />

על פי הוראות היצרן.‏<br />

Reverse Transcription (RT) -<br />

שלב ה-‏ RT נעשה מיידית לאחר הפקת הרנ"א הכללי בעזרת<br />

Reverse-iT 1 st Strand Synthesis Kit<br />

(ABgene)<br />

על פי הוראות היצרן:‏ בשלב הראשון,‏<br />

למבחנת אפנדורף ביחד עם<br />

0.5 μg של RNA<br />

מתוך ה-‏<br />

total RNA<br />

הוספו<br />

oligo-dT ומים והודגרו למשך 5 דקות ב-‏ 70°C ולאחר מכן הועברו לקרח.‏<br />

36

ד-‏<br />

dNTPs<br />

למבחנות הוספו ,first standard buffer<br />

והאנזים<br />

.Reverse Transcriptase<br />

התבצעה ב-‏ 47°C למשך 50 דקות וסיום התגובה נעשתה ע"י הדגרה ב-‏ 75°C למשך<br />

הסופי במבחנה היה<br />

10 דקות.‏<br />

.20 μl<br />

תוצרי ה-‏<br />

cDNA<br />

נשמרו ב<br />

-80°C<br />

.PCR<br />

הראקציה<br />

הנפח<br />

עד שישמשו כתבנית בריאקצית ה-‏<br />

דוגמת RNA מקורית ללא שלב ה-‏ RT נשמרה על מנת להוכיח בשלב מאוחר יותר כי לא נותרו<br />

שאריות DNA בעת הפקת ה-‏ RNA ‏(ביקורת שלילית).‏<br />

Polymerase Chain Reaction (PCR) -<br />

2.2.6.3<br />

תגובת ה-‏<br />

PCR<br />

להגברת מקטעי ה-‏<br />

DNA<br />

ReddyMix PCR Master Mix (ABgene)<br />

מראש כל המרכיבים הדרושים ל-‏<br />

ייחודים לאותו גן<br />

ב'‏<br />

.(PCR<br />

של הגנים השונים אשר ביטוים נבדק נעשתה בעזרת<br />

‏(ערכה מוכנה ל-‏PCR אשר מכילה בופר ובו הוכנסו<br />

עבור כל גן נבדק עורבבו<br />

1 μl<br />

,cDNA 2.5 µl<br />

,10 μM מכל אחד בריכוז 0.5 µl)<br />

ראה סעיף<br />

(2.2.6.4<br />

תחלים<br />

ו-‏ 12.5 μl של בופר ה-‏<br />

ReddyMix והנפח הושלם ל-‏ 25 μl עם מים סטריליים.‏ תוכנית ה-‏ PCR כללה 5 שלבים.‏ שלב א':‏<br />

5<br />

דקות ב-‏ 94°C, שלב ב':‏ דנטורציה של גדילי התבנית דקה ב-‏ 94°C, שלב ג':‏ היברידיזציה של התחל<br />

עם התבנית דקה ב-‏ 52°C, טמפרטורה שהינה נמוכה מטמפרטורת ההיתוך של התחלים ושלב ד':‏ סינטזה<br />

של התוצר על ידי הדגרה למשך דקה ב-‏ 72°C ואז חזרה לשלב ב'‏ לשלושים מחזורים נוספים ‏(שלבים<br />

'), שלב ה':‏<br />

על ידי הפרדת<br />

10 דקות ב-‏ 72°C.<br />

10 μl<br />

300-800 בסיסים),‏<br />

בתום שלב זה,‏ הדוגמאות נשמרו ב-‏ 4°C. תוצרי ה-‏ PCR<br />

נבדקו<br />

מכל דוגמה בג'ל אגרוז (w/v) 1.5% ‏(צפיפות המתאימה לגודל המקטעים של<br />

כאשר הבופר להכנת הג'לים היה TAE בתוספת אתידיום ברומיד.‏<br />

ביקורת לשלילת זיהום דנ"א גנומי לתוך הרנ"א המופק נעשה ע"י ביצוע תגובת PCR כפי שתואר קודם<br />

לכן על דגימת רנ"א אשר לא עברה את שלב ה-‏ ,RT בנוכחות התחלים של .GRK2<br />

2.2.6.4<br />

- בחירת תחלים<br />

התחלים ששמשו לקבלת תבנית ה-‏ DNA עבור ה-‏ GRKs והקולטנים לטעם הוזמנו מחברת<br />

HyLabs<br />

‏(רחובות,‏ ישראל).‏ התחלים עבור GAPDH התקבלו מהמעבדה של דר'‏ אורן תירוש.‏ הרצפים מבוססים<br />

על רצפי mRNA מחולדה המפורסמים בבנק הגנים<br />

עבור הקצה ה-‏<br />

.GenBank<br />

5'<br />

(sense) והשני עבור הקצה ה-‏<br />

עבור כל גן תוכננו שני תחלים,‏ אחד<br />

3' (antisense) ‏(ראה טבלה .(2.1<br />

(sequences)<br />

2.2.6.5<br />

- קביעת רצף חומצות הגרעין<br />

לאחר שנקבע כי גודלם של תוצרי ה-‏<br />

RT-PCR<br />

תואמים את הצפוי,‏ הדוגמאות נוקו בעזרת<br />

PCR<br />

Purification Kit (Qiagen, Germany)<br />

ונשלחו לקביעת רצף נוקלאוטידים בחברת<br />

השוואת רצפי האנליזה וזיהוי סופי של התוצרים בוצעו על ידי תוכנת<br />

הנתונים של<br />

.HyLabs<br />

BLAST<br />

.GenBank<br />

תוך שימוש במאגר<br />

37

טבלה מס - רשימת התחלים הייחודיים,‏ גודל התוצר הצפוי וקוד הרצף ב-‏ GenBank לגנים<br />

שביטוים בפפילת ה-‏ CV נבחן בשיטת ה-‏ .RT-PCR<br />

2.1<br />

Gene<br />

Primers<br />

Product<br />

size (bp)<br />

GenBank #<br />

GRK1<br />

Sense 5' TTTCCTGCGGTTTCTTCAGT 3'<br />

Antisense 5' CACGTTCTCTGGCTTGAGGT 3'<br />

460<br />

NM_031096<br />

GRK2<br />

Sense 5’ CTTTGACATTGGCTCCTTTGA 3’<br />

Antisense 5' GTGGCTTGTTCTTCATCTTGG 3'<br />

559<br />

NM_001619<br />

GRK3<br />

Sense 5'ACTGGCTTTGAACGAGAGGA 3'<br />

Antisense 5' GTCGATGCCCTTGAAGAAGA 3'<br />

670<br />

NM_012897<br />

GRK5<br />

Sense 5’CTGGCTTTGAGGAAGAACGA 3’<br />

Antisense 5' GTTTTGATGCTGACGCCTGA 3'<br />

841<br />

NM_030829<br />

GRK6<br />

Sense 5'AGGTGACCCCAGATGAGAAA 3'<br />

Antisense 5' TCTCGGCAGCATAGAAGACA 3'<br />

612<br />

NM_031657<br />

T2R4<br />

Sense 5’ CCACACATACTTACCTTTGGA 3’<br />

Antisense 5' GAGTAGGTTGTTTTGTGGCAG 3'<br />

560<br />

AF227142<br />

T1R3<br />

Sense 5’ CATGACCTCTCACCCAAGGTA 3’<br />

Antisense 5' CATAGCAGCAGGAATGAAAGC 3'<br />

705<br />

AF456324<br />

GAPDH<br />

Sense 5' TCCGCCCCTTCCGCTGATG 3'<br />

Antisense 5' CACGGAAGGCCATGCCAGTGA 3'<br />

350<br />

NM_017008<br />

- קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה-‏ GRK בפפילת CV ע ‏"י צביעת חתכים<br />

, in-vivo fixation<br />

2.2.7<br />

מרקמות לשון ‏(אימונוהיסטוכימיה)‏<br />

- הכנת חתכים מלשון<br />

2.2.7.1<br />

חולדות הורדמו כמתואר בסעיף 2.2.1 ועברו תהליך של<br />

הכולל פרפוזיה דרך חדר-‏<br />

הלב השמאלי,‏ הזרמת כ-‏ 50 מ"ל בופר פזיולוגי Hank’s לשטיפת הדם החוצה ומניעת קרישה,‏ ולאחר מכן<br />

כ-‏ 40 מ"ל של תמיסת (w/v) 3% paraformaldehyde<br />

לקיבוע כללי של גופת החיה<br />

אשר הומס בבופר פוספט בריכוז של 0.1 M ו-‏<br />

(77). לאחר הפרפוזיה,‏ הלשון הוצאה והודגרה למשך 16 שעות<br />

סוכרוז (w/v) 20%<br />

,pH 7.4<br />

בתמיסת<br />

בבופר פוספט בריכוז של 0.1 M ב-‏ 4°C, במטרה למנוע נזקי קור בהמשך<br />

הטיפול ולשמור על רקמות הלשון גם בתנאי הקפאה.‏ לאחר מכן לשון החולדה הוקפאה ב-‏ 70°C- בתוך<br />

(Optimal Cutting<br />

OCT<br />

איזופנטן עד להמשך הטיפול.‏<br />

הלשונות הקפואות נעטפו בחומר<br />

38

Temperature) ונחתכו באזור פפילת CV במכשיר קריוסטט לחתכים בעובי של 10. μm החתכים הונחו<br />

על זכוכיות נושאות מסוג<br />

,(Menzel-Glazer, Germany) SuperFrost Plus<br />

כאשר חתכים עוקבים<br />

הונחו על זכוכיות שונות על מנת שחתכי הביקורת וגם אלו שעברו טיפול ייצגו את אותו אזור של הפפילה.‏<br />

החתכים יובשו באוויר במשך 30 דקות והוקפאו ב-‏ 20°C- עד להמשך הטיפול.‏<br />

2.2.7.2<br />

- צביעת חתכי פפילת CV בעזרת נוגדנים<br />

החתכים שהתקבלו כמתואר בסעיף הקודם הודגרו למשך שעה אחת עם תמיסת Blocking אשר הכילה<br />

0.3% Triton X-100 ו-‏ (v/v) 10% goat serum<br />

0.1 M בתוך בופר פוספט בריכוז של (v/v)<br />

pH<br />

7.3 בטמפרטורת החדר,‏ כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדן.‏ לאחר מכן,‏ הודגרו החתכים עם נוגדן<br />

ראשוני ספציפי כנגד<br />

הנוגדנים נמהלו ביחס<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2 או GRK6 למשך<br />

.PBS X1 ב-‏ 1:100<br />

הראשוני ביחד עם החלבון החוסם הייחודי לו<br />

הנושאות נשטפו<br />

24 שעות בתא סגור ולח ב-‏ 4°C. כל<br />

לבדיקת ספציפיות הצביעה,‏ חתכים נוספים נחשפו לנוגדן<br />

.(25 µg/ml)<br />

פעמים עם 3<br />

הקשור למולקולה פלואורסצנטית<br />

PBS X1<br />

לאחר תגובה עם נוגדנים ראשוניים הזכוכיות<br />

ונחשפו לשעה אחת נוספת בטמפרטורת החדר לנוגדן שניוני<br />

,(FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)) FITC מהול<br />

1:200 ב-‏ .PBS X1<br />

החתכים נשטפו שוב 3 פעמים עם<br />

, PBS X1<br />

וטיפה מתמיסת<br />

mounting<br />

טופטפה<br />

על החתכים אשר כוסו בזכוכית מכסה.‏ נוכחות פלואורסצנציה נבדקה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי.‏<br />

התמונות נשמרו בפורמאט<br />

TIFF<br />

ועובדו בעזרת התוכנות<br />

Image-Pro Plus Media Cybernatics<br />

ו-‏ .Adobe Photoshop<br />

2.2.7.3<br />

- בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת<br />

מוחות של חולדות שימשו כמקור ל-‏<br />

למשך<br />

Western blot<br />

GRKs השונים.‏<br />

המוחות הומגנו בבופר RIPA וסורכזו ב-‏<br />

20,000g<br />

15 דקות ב-‏ 4 o C בצנטריפוגת אפנדורף.‏<br />

הנוזל העליון אשר התקבל מהסרכוז הורתח עם<br />

sample<br />

buffer ב-‏ 95 o C למשך 5-10 דקות.‏<br />

לקביעת כמות חלבון כמתואר בסעיף<br />

ג'ל<br />

עשרה מיקרוליטרים מן הנוזל העליון נלקחו לפני הרתחה ושימשו<br />

.2.2.3<br />

SDS‏-אקרילאמיד 12%,<br />

עשרים מיקרוגרם חלבונים מן המיצוי הוטענו בכל באר של<br />

ולאחר ההרצה הועברו לממברנת ניטרוצלולוז.‏ הממברנות הודגרו עם תמיסת<br />

TBST מומס בבופר 2% (w/v) BSA אשר הכילה blocking<br />

נוספת בטמפרטורת החדר עם הנוגדן ראשוני כנגד<br />

GRK2<br />

‏(מיהול<br />

במשך שעה ובהמשך הודגרו למשך שעה<br />

,(1:5000 GRK5 או GRK6 ‏(מיהול<br />

(1:1000<br />

בהיעדר או בנוכחות<br />

blocking peptide (1µg/ml)<br />

יחודי לנוגדן הנבדק.‏ הממברנות נשטפו<br />

שלוש פעמים,‏ 20 דקות כל פעם,‏ בבופר TBST נקי והודגרו שעה בטמפרטורת החדר עם הנוגדן השניוני<br />

.Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)<br />

כל אחת,‏ הממברנות נחשפו לתמיסת<br />

לאחר שלוש שטיפות נוספות של<br />

20 דקות<br />

ECL<br />

במשך 2 דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

Fuji, ) X-ray<br />

.(Japan<br />

39

2.2.8<br />

- קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי<br />

HeLa<br />

2.2.8.1<br />

תאי<br />

- החזקת תאים<br />

10% Fetal בתוספת (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle's Medium גודלו במצע HeLa<br />

,2 mM glutamine ,Bovine Serum (FBS)<br />

ושתי אנטיביוטיקות<br />

100 U/ml penicillin ו-‏ 100<br />

.10% DMEM אשר ייקרא להלן - µg/ml streptomycin<br />

לצפיפות של 90%) ע"י שטיפה עם<br />

התאים פוצלו כל<br />

3 ימים<br />

PBS X1 סטרילי,‏<br />

‏(או לאחר שהגיעו<br />

הוספת טריפסין ‏(אנזים אשר מנתק את התאים<br />

מצלחת הגידול)‏ והעברת התאים לצלחות חדשות לצפיפות הרצויה.‏ התאים הוחזקו באינקובטור בתנאים<br />

של 37 °C ו-‏ .5% CO 2<br />

2.2.8.2<br />

– הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי<br />

HeLa<br />

התאים פוצלו לצלחות בקוטר 60 mm בצפיפות של 50-60% וגודלו ל-‏ 24-48 שעות נוספות.‏<br />

שעות לפני הניסוי,‏ הוחלף המצע למצע ‏"הרעבה"‏ אשר הכיל<br />

16-18<br />

0.1% FBS בלבד<br />

– ייקרא להלן<br />

0.1%<br />

.DMEM<br />

חשיפת התאים לטעמנים השונים נעשתה ע"י הוספת תמיסה מרוכזת ‏(סטוק)‏ של כל טעמן ישירות אל<br />

מצע התאים.‏ הטעמנים סכרין,‏<br />

D-TRP<br />

מהריכוז הסופי לו נחשפו התאים.‏ הטעמן<br />

וקפאין הומסו במדיום<br />

DMEM<br />

נקי,‏ בריכוז הגבוה פי<br />

10<br />

NHD<br />

הומס אף הוא ב-‏ ,DMEM אך בריכוז גבוה פי<br />

2<br />

מהריכוז הסופי.‏ הטעמנים כינין ונרינגין הומסו קודם באתנול ו-‏ DMSO בהתאמה,‏ ורק לאחר מכן ב-‏<br />

.DMEM<br />

ריכוזי הסטוקים חושבו כך שהתאים לא נחשפו לאחוזי ממס ‏(אתנול או (DMSO העולים על<br />

0.1%. כל הסטוקים הובאו ל-‏ pH 7-7.5 לפני הוספתם לתאים.‏<br />

התאים הודגרו עם הטעמנים השונים באינקובטור למשך<br />

התאים נשטפו 5 פעמים עם<br />

10 דקות<br />

‏(חוץ מכינין<br />

– 3 דקות).‏<br />

PBS X1 קר,‏<br />

בתום זמן זה,‏<br />

250 µl של מים הוספו לכל צלחת והתאים נקצרו והועברו<br />

למבחנה קרה.‏ התאים פוצצו ע"י סידרה של שלוש הקפאות והפשרות ב-‏<br />

-20°C<br />

הושקעו ע"י סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב-‏ 20,000g בטמפרטורה של 4°C למשך<br />

העליון שהכיל את תוכן התאים הופרד,‏ הוקפא,‏ יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של<br />

וממברנות התאים<br />

30 דקות.‏<br />

-20°C<br />

הנוזל<br />

עד<br />

לקביעה כמותית ב-‏ ,HPLC כמתואר בסעיף 2.2.5. ריכוז הטעמנים בתאים חושב על פי מספר התאים<br />

בכל דוגמא ונפח תאי ה-‏ HeLa שחושב להיות בממוצע 0.7 pL ‏(מכיוון שלתאי HeLa אין צורה אחידה,‏<br />

נפח התאים חושב עבור מספר ‏"צורות"‏ על בסיס מדידות שנלקחו במיקרוסקופ קונפוקלי).‏<br />

40

2.2.9<br />

- מדידת שינויים ברמות cAMP<br />

- 2.2.9.1 ביטוי מלאכותי ‏(טרנספקציה)‏ של הקולטן ה - β2AR בתאי HeLa<br />

HeLa תאי<br />

גודלו כמתואר בסעיף<br />

.2.2.8.1<br />

למטרות טרנספקציה,‏ התאים פוצלו ביום אשר קדם לה<br />

לצפיפות של 60-70% בצלחות בקוטר 100. mm הטרנספקציה בוצעה בעזרת החומר<br />

MaxFect<br />

USA) (Molecula Research Labs, בעיקר על פי הוראות היצרן.‏ בקצרה,‏ הפלסמיד עורבב ביחד עם<br />

החומר MaxFect ביחסים<br />

25 µl) 1:2.5<br />

(100 mm<br />

בופר 400 µl בתוך<br />

MaxFect עורבבו עם 10 µg פלסמיד עבור צלחת בקוטר<br />

(Gibco, USA) Opti-MEM® I<br />

וניתנה השהייה של<br />

דקות 25<br />

בטמפרטורת החדר.‏ תאי ה-‏ HeLa נשטפו פעמיים עם מדיום DMEM נקי ונפח מינימלי של מצע זה<br />

(5.5-6 מ"ל,‏<br />

מספיק על מנת לכסות את התאים)‏ הוסף לצלחת.‏ בתום ה-‏ 25 דקות השהייה,‏ הפלסמיד<br />

ביחד עם ה - MaxFect טופטפו מעל המצע והתאים הוחזרו לאינקובטור ל-‏<br />

מצע המכיל<br />

5-7 שעות,‏<br />

,20% FBS<br />

בסופן הוסף<br />

על מנת להגיע למצב של 10%. DMEM לאחר שמונה עשרה שעות,‏ המצע<br />

הוחלף ל-‏ 10% DMEM חדש או שהתאים פוצלו לצלחות חדשות.‏ התאים ‏"הורעבו"‏ במשך<br />

שעות לפני כל ניסוי על ידי החלפת מצע התאים<br />

16-18<br />

ל-‏ .0.1% DMEM<br />

2.2.9.2<br />

- הכנת הדוגמאות<br />

תאי HeLa עברו טרנספקציה עם פלסמיד pcDNA3 המכיל את הקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי<br />

‏(להלן (β2AR<br />

24<br />

כמתואר בסעיף 2.2.9.1. שמונה עשרה שעות לאחר סיום הטרנספקציה,‏ התאים פוצלו לתוך פלטות של<br />

בארות בצפיפות של כ-‏ 60% וגודלו ל-‏<br />

30-36<br />

שעות נוספות.‏ שמונה עשרה שעות לפני ביצוע<br />

הניסוי הוחלף המצע מ-‏ 10% DMEM ל-‏ 0.1% DMEM ‏(מצע הרעבה).‏ ביום הניסוי התאים הודגרו<br />

למשך 10 דקות בנוכחות או בהיעדר טעמן ולאחר מכן עם<br />

(ISO) 10 μM isoproterenol לזמנים שבין<br />

30 שניות<br />

הוספו<br />

5 דקות,‏ ל-‏<br />

לגירוי הקולטן האדרנרגי.‏ סיום הראקציה והמשך הניסוי בוצעו לפי<br />

:(185 ,56)<br />

450 μl חומצת (v/v) 5% TCA קרה לכל באר,‏<br />

מבחנות זכוכית קרות והוספו<br />

ולאחר<br />

30 דקות ב-‏ ,4ºC<br />

TCA 5% 450 μl<br />

נוספים לכל באר.‏ לאחר<br />

30<br />

הנוזלים נאספו לתוך<br />

דקות הדגרה נוספות,‏<br />

אוחדו הנוזלים מכל דוגמא וסילוק החומצה אשר בתוכם נעשה ע"י שתי הוספות של 4.5 ml של אתר קר,‏<br />

ערבוב חזק ושאיבת האתר במשאבת וואקום.‏ הדוגמאות הוקפאו ויובשו בליופילייזר תחת וואקום.‏ לאחר<br />

הייבוש כל דוגמא הורחפה ב-‏<br />

250-500 μl<br />

בופר סודיום אצטט<br />

,pH 6.2 ,0.05 M<br />

.cAMP<br />

לשם קביעת חלבון הוספו מייד לאחר הוצאת ה-‏ 5% TCA האחרון<br />

לקביעת רמות<br />

של NaOH 0.1 500 μl<br />

-20ºC לכל באר למשך שעה.‏ בתום זמן זה,‏ הועברו הדוגמאות למבחנת אפנדורף,‏ הוקפאו ונשמרו ב-‏ M<br />

עד לקביעת חלבון.‏<br />

41

2.2.9.3<br />

- קביעת כמות cAMP בשיטת ה-‏<br />

כל שלבי הניסוי בוצעו בקרח לפי<br />

אצטילציה ע"י הוספת<br />

(RIA) radioimmunoassay<br />

,56)<br />

,triethylamine של 20 μl<br />

185). ראשית הדוגמאות המומסות בבופר סודיום אצטט עברו<br />

ערבוב בעזרת וורטקס והוספה מידית של<br />

10 μl של<br />

.acetic anhydride<br />

של<br />

acetyl-cAMP לנוגדן<br />

במבחנות פוליסטירן שהכילו<br />

תהליך האצטילציה נועד להגדיל את הרגישות של שיטת ה-‏ RIA מאחר והאפיניות<br />

הינה פי 20 גבוהה יותר בהשוואה ל-‏ cAMP עצמו.‏ קביעת<br />

cAMP נעשתה<br />

50 μl של<br />

.(w/v) 0.1% BSA<br />

200 μl של תמיסת<br />

הדוגמא הנבדקת ו-‏ 50 μl של נוגדן כנגד cAMP המומס ב-‏<br />

לאחר ערבוב,‏ המבחנות הועברו להשהיה בקור למשך 4 שעות ובתום זמן זה הוספו<br />

[ 125 I]-cAMP אשר נמהלה בעזרת בופר אצטט בריכוז<br />

,pH 6.2 0.05 M<br />

קריאה של 3000-4000. cpm<br />

של 100 μl<br />

,10% (w/v) BSA<br />

לקבלת<br />

לאחר הדגרה של 18-22 שעות בקור,‏ סיום התגובה בוצע ע"י הוספת<br />

ערבוב כפול בוורטקס והשקעת הקומפלקס ע"י הוספת<br />

אתנול קר.‏ הדוגמאות עורבבו פעמיים בוורטקס וסורכזו למשך 15 דקות במהירות של<br />

הסרכוז הנוזל העליון נשאב במשאבת וואקום והמשקע נמנה במונה גמא.‏ חישוב כמות ה-‏<br />

2<br />

.4,000g<br />

כנגד עקומת כיול של נוקלאוטיד נקי אשר הוכנה באותם תנאים.‏ הערכים בוטאו ביחידות של<br />

מ"ל של<br />

בתום<br />

cAMP נעשה<br />

fmole<br />

.cAMP/μg protein<br />

2.2.9.4<br />

- קביעת חלבון בשיטת ברדפורד<br />

חמישים מיקרוליטרים מן הדוגמה המהולה ב-‏ 0.1 M NaOH הועברו לפלטה בעלת 96 בארות להם<br />

הוספו 250 μl של תמיסת ברדפורד.‏ כל באר עורבבה היטב ולאחר 15 דקות השהיה בטמפרטורת החדר<br />

נמדדה הבליעה במכשיר<br />

595. nm באורך גל של Bio-Elisa<br />

סטנדרט של BSA אשר הוכנה באותם תנאים.‏<br />

חישוב כמות החלבון נעשה מול עקומת<br />

2.2.10<br />

2.2.10.1<br />

HeLa תאי<br />

- קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי<br />

- הכנת הדוגמאות<br />

אשר גודלו בצלחות בקוטר 100 mm עברו טרנספקציה עם פלסמיד pcDNA3 המכיל את<br />

הקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי הקשור לסמן<br />

HA<br />

‏(להלןβ2HA‏),‏ כמתואר בסעיף<br />

.2.2.9.1<br />

48 שעות לאחר<br />

הטרנספקציה,‏ התאים הורעבו ע"י החלפת המדיום מ-‏ 10% DMEM ל-‏ 0.1% DMEM למשך שמונה<br />

עשרה שעות לפני ביצוע הניסוי.‏<br />

ביום הניסוי,‏ התאים הודגרו קודם בהיעדר או בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם ISO<br />

שבין<br />

μM) (10 לזמנים<br />

25 דקות.‏ ל-‏ 5<br />

לאחר השטיפה,‏ הוספו לתאים<br />

בתום הגירוי המדיום נשאב והתאים נשטפו פעמיים עם PBS X1 קר על קרח.‏<br />

,NaF 25 mM אשר מכיל בנוסף RIPA של בופר 400 μl<br />

.serine phosphatases<br />

הפועל כמעכב<br />

התאים נקצרו והנוזלים הועברו לתוך מבחנות אפנדורף קר.‏ המבחנות סורכזו<br />

42

דקות ב-‏ 15<br />

ב-‏ 15,000g<br />

והנוזל העליון הועבר למבחנת אפנדורף נפרדת<br />

אשר הכילה חרוזים<br />

,4ºC<br />

הקשורים לנוגדן כנגד הסמן .HA<br />

2.2.10.2<br />

- קשירת החרוזים לנוגדן כנגד HA<br />

כל הכמויות המפורטות בסעיף זה הותאמו לטיפול ב-‏<br />

6<br />

.2.2.10.1<br />

צלחות בהן התאים טופלו כמתואר בסעיף<br />

מאה עשרים מיקרוליטרים של חרוזים מסוג אגרוז אליהם קשור חלבון G<br />

(proteinG-plus<br />

agarose beads, Santa-Cruz)<br />

בסרכוז של דקה ב-‏<br />

נשטפו שלוש פעמים עם<br />

PBS X1<br />

4ºC ב-‏ 12,000g<br />

500 μl של PBS X1 ו-‏<br />

קור,‏ החרוזים נשטפו פעמיים ב-‏<br />

קר כאשר כל שטיפה הסתיימה<br />

ושאיבת הנוזל העליון.‏ בסוף הסרכוז האחרון החרוזים הורחפו ב-‏<br />

12 μl של נוגדן הוספו.‏ לאחר ערבוב בצורה של end-to-end כל הלילה בחדר<br />

PBS X1<br />

RIPA וחולקו ל-‏‎6‎ מנות שוות במבחנות אפנדורף קרות.‏<br />

קר,‏ פעם נוספת בבופר ,RIPA ולבסוף הורחפו ב-‏<br />

300 µl<br />

2.2.10.3<br />

- השקעה אימונית (immunoprecipitation) של הקולטן הבטא-אדרנרגי<br />

הנוזל העליון שהתקבל לאחר סרכוז תמצית התאים ‏(כמתואר בסעיף<br />

המכילה את החרוזים הקשורים לנוגדן כנגד HA ‏(כמתואר בסעף<br />

(2.2.10.1<br />

.(2.2.10.2<br />

4ºC<br />

הועבר למבחנת אפנדורף<br />

המבחנות עורבבו בצורה של<br />

end-to-end למשך שעתיים בקור.‏ בסוף זמן זה,‏ החרוזים הושקעו ע"י סרכוז למשך דקה ב-‏ 10,500g ב-‏<br />

ונשטפו פעמיים עם<br />

תמיסת LiCl 0.5 mM<br />

וואקום.‏ לאחר השאיבה האחרונה הדוגמאות הורחפו ב-‏<br />

למשך<br />

ע"י סרכוזים זהים ושאיבת הנוזל העליון במשאבת<br />

95ºC והורתחו ב-‏ sample buffer של 50 μl<br />

5 דקות.‏<br />

הדוגמה כולה הורצה לבסוף בג'ל<br />

SDS‏-אקרילאמיד 10%.<br />

הועברו לממברנת ניטרוצלולוז ע"י אלקטרוטרנספר.‏ לאחר קיבוע הממברנה בעזרת<br />

מהול ב-‏<br />

לאחר סיום ההרצה,‏ החלבונים<br />

2% (w/v) BSA<br />

,TBST<br />

1:1000 ב-‏ .TBST<br />

זוהתה נוכחות הקולטן ה-‏ β2HA ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד הפפטיד ,HA מהול<br />

לעומת זאת,‏ נוכחות של קולטן מזורחן נבדקה ע"י שימוש בנוגדן ראשוני יחודי,‏ בשם<br />

,anti-phosphoSer(355-356) β2-adrenergic receptor<br />

המזורחנות ספציפית ע"י<br />

למשך<br />

.GRK2/5<br />

המכוון כנגד שתי חומצות אמינו סרין<br />

הממברנות טולטלו עם נוגדן ראשוני זה,‏ מהול<br />

1:600 ב-‏ ,TBST<br />

18<br />

שעות בחדר קור.‏ לאחר שלוש שטיפות של<br />

הודגרה שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדן שניוני<br />

20<br />

דקות כל אחת עם בופר<br />

,TBST<br />

הממברנה<br />

Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG<br />

(H+L)<br />

נחשפו לתמיסת<br />

אשר נמהל 1:10,000 ב-‏ .TBST לאחר שלוש שטיפות נוספות של 20 דקות כל אחת,‏ הממברנות<br />

ECL במשך<br />

טיפול נקבעה ע"י שימוש בתוכנת<br />

2 דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

.X-ray<br />

.ImageJ<br />

עוצמת הכתמים היחסית בכל<br />

43

2.2.11<br />

ע"י<br />

- מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי<br />

תאי HeLa אשר עברו טרנספקציה לביטוי הקולטן ה-‏ β2AR ‏(סעיף<br />

(2.2.9.1<br />

הטרנספקציה לתוך פלטות של 12 בארות שבתוכן הוכנסו זכוכיות מכסות בקוטר<br />

פוצלו 24 שעות לאחר<br />

18 מ"מ.‏<br />

לאחר<br />

שעות נוספות התאים הורעבו ע"י החלפת המצע מ-‏ 10% DMEM ל-‏ 0.1% DMEM ל-‏<br />

30-36<br />

18 שעות<br />

נוספות.‏ ביום הניסוי,‏ התאים עברו פראינקובציה בנוכחות או היעדר טעמן למשך 10 דקות ולאחר מכן<br />

גירוי הקולטן האדרנרגי ע"י 10). μM) ISO בתום הגירוי התאים נשטפו פעמיים עם<br />

תמיסת<br />

PBS X1<br />

(w/v) PFA 3% למשך 20 דקות.‏<br />

PFA ה-‏<br />

blocking<br />

פוספט בריכוז<br />

אשר הכילה<br />

3% (w/v) BSA<br />

ו-‏<br />

וקובעו<br />

נשטף 3 פעמים עם PBS X1 והתאים הודגרו עם<br />

0.3% (v/v) Triton X-100<br />

pH 7.3 0.1 M<br />

למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.‏<br />

הנוגדן הראשוני כנגד הקולטן הבטא-אדרנרגי הומס בתמיסת ה-‏<br />

הנושאות נעשתה ל-‏<br />

blocking<br />

18<br />

המומסים בבופר<br />

והדגרה עם הזכוכיות<br />

שעות בקור בתא לח.‏ לאחר מכן התאים נשטפו שלוש פעמים עם<br />

PBS X1<br />

והודגרו עם נוגדן שניוני הקשור לסמן הפלואורסצנטי FITC לעוד שעה בטמפרטורת החדר.‏ לבסוף<br />

התאים נשטפו שלוש פעמים עם<br />

PBS X1<br />

.mounting<br />

והועברו לזכוכית נושא עליה טופטפה טיפה של תמיסת<br />

הפלואורסצנציה נמדדה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי (BioRad) בעזרת עדשה<br />

שמן מינרלי,‏ ותמונות נלקחו בעזרת תוכנת<br />

נעשה בעזרת תוכנת Photoshop 7.0<br />

×60<br />

.LaserSharp 2000 software (BioRad)<br />

.(Adobe)<br />

המצריכה<br />

עיבוד התמונות<br />

להשוואת מידת האינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי בהיעדר מול נוכחות טעמן אמפיפטי נעשתה<br />

ספירה של מספר התאים בהם הקולטן נראה על הממברנה הפלסמטית מול מספר התאים בהם הקולטן<br />

נראה אך ורק בווסיקולות תוך תאיות.‏<br />

- 2.2.12 מידור<br />

‏(פרקציונציה)‏ של התא<br />

שיטת מידור התאים התבססה לרוב על<br />

‏(סעיף<br />

.(37)<br />

לאחר טרנספקציה של הקולטן ה-‏ β2HA בתאי<br />

HeLa<br />

0.1%<br />

,(2.2.9.1<br />

DMEM למשך 16-18 שעות.‏<br />

‏(חוץ מכינין,‏<br />

התאים גודלו בצלחות בקוטר 60 mm ל-‏ 48 שעות נוספות בסופן הורעבו ב-‏<br />

ביום הניסוי,‏ התאים הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן במשך<br />

10 דקות<br />

3 דקות)‏<br />

והקולטן גורה עם ISO<br />

בתום זמן הגירוי,‏ התאים נשטפו עם<br />

µM) (10 לזמנים שונים ,0) 15 ,10 ,5 ו-‏ 20 דקות).‏<br />

PBS X1 קר פעמיים,‏<br />

H של בופר 150 µl<br />

ב-‏<br />

לאחר מכן עם בופר A קר פעם אחת,‏ ולבסוף<br />

אשר הכיל סוכרוז בריכוז של 0.25 M הוספו לכל צלחת.‏ התאים נקצרו ביחד עם<br />

הבופר,‏ וכל דוגמא ‏(צלחת)‏ הועברה למבחנת סרכוז קרה נפרדת וסורכזה בשלושה שלבים:‏ סרכוז ראשון<br />

3,000g<br />

דקות ב-‏ 10 למשך<br />

;4 °C<br />

הועבר למבחנת סרכוז קרה חדשה וסורכז ב-‏<br />

הכיל אורגנלות גדולות<br />

המשקע אשר הכיל את גרעיני התאים הושלך והנוזל העליון<br />

4 °C למשך 10 דקות ב-‏ 10,000g<br />

‏(גולג'י,‏ (...ER<br />

הושלך והנוזל העליון הועבר למבחנת סרכוז עבות<br />

; המשקע החדש אשר<br />

(Beckman,<br />

44

Germany)<br />

וסורכז בצנטריפוגת<br />

Ultra<br />

במהירות של<br />

100,000g<br />

דקות ב-‏ 45 למשך<br />

העליון מכל דוגמא,‏ אשר הכיל את התוכן הציטוזולי,‏ הועבר למבחנה חדשה ולאחר הוספת<br />

הנוזל .4 °C<br />

sample<br />

buffer הורתח ב-‏ 95 C° ל-‏ 5 דקות.‏<br />

ב-‏<br />

120 µl בופר RIPA ולאחר הוספת<br />

מכל דוגמה הורצו בג'ל SDS‏-אקרילאמיד<br />

באלקטרוטרנספר.‏<br />

המשקע מכל דוגמא,‏ אשר הכיל את הממברנה הפלסמטית,‏ הומס<br />

sample buffer הורתח אף הוא ב-‏ 95 C° ל-‏<br />

5 דקות.‏ 60 µl<br />

12% (v/v)<br />

לאחר קיבוע עם (w/v) BSA 2%,<br />

1:1000<br />

16-18 למשך<br />

שעות ב-‏<br />

4 °C<br />

והחלבונים הועברו לממברנת ניטרוצלולוז<br />

הממברנה הודגרה עם נוגדן כנגד HA במיהול<br />

ולאחר מכן עם נוגדן שניוני קשור ל-‏<br />

בטמפרטורת החדר.‏ הממברנות נחשפו לתמיסת ECL והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

HRP<br />

.X-ray<br />

במשך שעה<br />

2.2.13<br />

- קביעת שפעול של ERK<br />

לאחר טרנספקציה של הקולטן ה-‏<br />

בתאי β2AR<br />

נוספות בסופן הורעבו ב-‏ 0.1% DMEM למשך<br />

בנוכחות טעמן במשך<br />

‏(סעיף HeLa<br />

,(2.2.9.1<br />

התאים גודלו ל-‏<br />

48<br />

16-18 שעות.‏<br />

10 דקות<br />

‏(חוץ מכינין,‏<br />

3 דקות)‏<br />

שעות<br />

ביום הניסוי,‏ התאים הודגרו בהיעדר או<br />

והקולטן גורה עם ISO<br />

µM) 10) לזמנים שונים<br />

,0) 20 ,10 ,5 ,2 או 30 דקות).‏<br />

בתום זמן הגירוי,‏ התאים נשטפו עם PBS X1 קר פעמיים ונקצרו על<br />

קרח בנוכחות בופר .RIPA התאים ביחד עם הבופר הועברו למבחנות סרכוז קרות וסורכזו בצנטריפוגת<br />

אפנדורף במהירות<br />

17,000g למשך<br />

הוצאת דגימה לצורכי קביעת חלבון,‏ הוסף<br />

15 דקות ב-‏<br />

.4 °C<br />

הנוזל העליון הועבר למבחנה חדשה,‏ ולאחר<br />

sample buffer והדוגמה הורתחה ב-‏ 95 °C ל-‏ 5 דקות.‏ 25<br />

µg<br />

מכל דוגמה הורצו בג'ל SDS‏-אקרילאמיד<br />

ניטרוצלולוז באלקטרוטרנספר.‏ לאחר קיבוע עם<br />

12% (v/v)<br />

,2% (w/v) BSA<br />

ולאחר מכן החלבונים הועברו לממברנת<br />

זיהוי חלבון ה-‏<br />

ERK<br />

ERK<br />

וזיהוי ה-‏<br />

המזורחן נעשו ע"י שימוש בשני נוגדנים שונים:‏ זיהוי הכמות הכללית של ERK בכל דוגמה נעשה<br />

ע"י נוגדן אשר מזהה את הקצה ה-‏ C טרמינלי של ERK<br />

.TBST ונמהל 1:40,000 ב-‏ (gERK)<br />

זאת זיהוי ה-‏ ERK המזורחן נעשה ע"י נוגדן מכוון כנגד אתרי טירוזין מזורחנים ב-‏ ERK<br />

ונמהל<br />

לעומת<br />

,(pERK)<br />

ב-‏ 1:30,000<br />

.(154) TBST<br />

ממברנות הניטרוצלולוז נחשפו למשך שעה בטמפרטורת החדר<br />

לאחד מן הנוגדנים האלו,‏ ולאחר שלוש שטיפות של 20 דקות כל אחת,‏ נחשפו לנוגדן שניוני הקשור ל-‏<br />

HRP במשך שעה בטמפרטורת החדר.‏ לאחר שלוש שטיפות נוספות,‏ הממברנות נחשפו לתמיסת<br />

והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

ECL<br />

.X-ray<br />

.ImageJ<br />

עוצמת הכתמים היחסית בכל טיפול חושבה ע"י שימוש בתוכנת<br />

- 2.2.14<br />

ניתוח סטטיסטי של התוצאות<br />

ניתוח סטטיסטי של התוצאות וקביעת מובהקות סטטיסטית בין הטיפולים השונים בכל ניסויי המחקר נעשו<br />

בעזרת תוכנת<br />

(SAS Institute, Cary, NC) JMP statistical software<br />

Student's t-test<br />

זוגי דו-‏ כיווני.‏<br />

ע"י שימוש במבחן<br />

45

3. תוצאות<br />

3.1<br />

3.1.1<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות CV שלמות<br />

- מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי<br />

לאחר הוצאתה של פפילת ה-‏ CV בצורה שלמה מתוך הלשון,‏ הפפילה הונחה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי<br />

כך שבתמונות אשר צולמו כפי שנראה באיור 3.1 מתגלה הצד הדורסלי שלה.‏ החיצים באיור מציינים את<br />

מיקומה של התעלה הפנימית של הפפילה<br />

(inner trench)<br />

שם ממוקמות רוב פקיעיות הטעם.‏ בתנאי<br />

הניסוי הנוכחיים,‏ הצד האפיקלי בלבד של תאי פקיעיות הטעם נחשף לסביבה ‏(במקרה זה לטעמנים<br />

הפלואורסצנטים)‏ בדומה לתנאים פיזיולוגיים.‏ ניתן לראות באיור 3.1 שלאחר חשיפה של פפילות ה-‏ CV<br />

לטעמנים אמפיפטיים שונים,‏ סכרין<br />

,(SACC)<br />

הפפטיד המר<br />

(CLT)<br />

וקפאין<br />

,(CAFF)<br />

מבחינים<br />

בהופעתה של פלואורסצנציה בעיקר באזור התעלה,‏ ובהתעצמותה עם הזמן.‏ פלואורסצנציה נראתה לעין<br />

כבר לאחר דקה של חשיפה,‏ אך זמני חשיפה מ-‏<br />

0 עד<br />

6 דקות נבחרו על מנת להראות את התגברותה של<br />

רמת הפלואורסצנציה עם הזמן.‏ תוצאות אלו מעידות לכאורה על חדירה והצטברות של אותם הטעמנים<br />

לתוך פקיעיות הטעם עצמן.‏ על מנת להוכיח שאכן העלייה ברמת הפלואורסצנציה נבעה מחדירת הטעמנים<br />

לתוך תאי הפקיעיות ולשלול ספיחה חיצונית לאפיתל הלשון,‏ נעשו שני ניסויים נוספים.‏ ראשית,‏ נעשה<br />

שימוש במלח אשלגן יודיד<br />

(KI)<br />

3.1<br />

אשר פועל כמדעיך פלואורסצנציה:‏ משמעות הדבר שחומר זה גורם<br />

לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר יפגוש.‏ KI איננו חודר ממברנות שלמות של תאים ולכן<br />

צפוי לגרום לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר נמצאת מחוץ לתאי הפפילה.‏ ניתן לראות באיור<br />

KI שהוספת<br />

לפפילת ה-‏<br />

6 לאחר CV<br />

דקות חשיפה לטעמנים לא גרמה לירידה בעוצמת<br />

הפלואורסצנציה שהתקבלה.‏ תוצאות אלו מעידות על חדירה עמוקה של הטעמנים האמפיפטיים לתוך<br />

ציטוזול תאי פקיעיות הטעם או לכל הפחות לצד הפנימי של הממברנה הפלסמטית,‏ שם אין ל-‏<br />

כביקורת נוספת,‏ נעשה ניסוי דומה כאשר הפעם פפילת ה-‏ CV נחשפה לפרופידיום יודיד<br />

KI גישה.‏<br />

חומר ,(PI)<br />

אשר משמש בניסויים ביולוגיים רבים כמולקולה פלואורסצנטית החודרת ממברנות מפורקות של תאים<br />

מתים.‏ מכיוון שתאי הפפילה נשארים חיים במהלך ניסוי זה,‏ PI אינו צפוי לחדור לתוכם.‏ באיור,‏ ניתן<br />

לראות שכתוצאה מחשיפת פפילת ה-‏<br />

CV ל-‏ PI<br />

התגלתה הופעה של פלואורסצנציה אשר התגברה<br />

במידה מסוימת עם זמן החשיפה,‏ אך הוספת KI גרמה לדעיכה כמעט מוחלטת שלה.‏ תוצאה זו מעידה על<br />

כך שמולקולות ה-‏<br />

,PI<br />

בניגוד לטעמנים האמפיפטיים,‏ לא חדרו לתוך תאי הפפילה אך נספחו חיצונית אל<br />

האפיתל,‏ ולכן חשיפתן ל-‏ KI גרמה במקרה זה לדעיכת הפלואורסצנציה שלהן.‏<br />

46

3.1<br />

איור – הסתכלות במיקרוסקופ קונפוקלי על הצטברותם של טעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים<br />

בתעלה הפנימית של פפילת .CV<br />

פפילות CV שלמות הונחו מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי ונחשפו לטעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים.‏ תמונות של<br />

הצד הדורסלי של הפפילה מאפשרות לעקוב אחר הופעת פלואורסצנציה בתעלה הפנימית ‏(מצויינת ע"י חיצים)‏ בה<br />

ממוקמות רוב פקיעיות הטעם של הפפילה.‏ התמונות נלקחו לאחר חשיפת הפפילות לתמיסות של 10 mM סכרין<br />

(CAFF) או בהיעדר טעמן במקרה של הביקורת<br />

בזמן 0 תמיסת הטעמנים טופטפה על הפפילה ורמת הפלואורסצנציה נמדדה כל דקה ‏(כאן הזמנים<br />

צורף לתמיסה לאחר 6 דקות ותמונות נלקחו 2 דקות לאחר מכן.‏ ניתן<br />

6 דקות מוצגים).‏ המלח<br />

לראות שהוספת לא השפיעה על רמת הפלואורסצנציה שהתקבלה לאחר חשיפתה של הפפילה לטעמנים<br />

שימש כביקורת חיובית לניסוי.‏ כל תמונה מייצגת חזרה מתוך<br />

השונים.‏ פרופידיום יודיד<br />

ורוחב הפפילה נמצא קרוב ל-‏ 0.6 mm ‏(נעשה<br />

חזרות שנעשו לאותו ניסוי.‏ ה-‏<br />

בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו).‏<br />

2 ,0 ו-‏<br />

4<br />

,(SACC) 10 mM ,(CLT) cyclo(Leu-Trp) 1 mM קפאין<br />

.(CON)<br />

,(500 mM) KI<br />

KI<br />

,(50 µg/ml) (PI)<br />

100 µm הינו של scale bar<br />

3.1.2<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות<br />

על מנת לבחון את יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים לחדור לתוך פפילות טעם בתנאי<br />

ניסוי בו טופטפו לסירוגין תמיסות טעמנים שונות לפיהן של חולדות מורדמות במשך<br />

ניתוח להוצאת פפילת ה-‏<br />

,in-vivo<br />

90 שניות,‏<br />

CV<br />

בשיטת .HPLC<br />

נעשה<br />

ולאחר<br />

מתוך אפיתל הלשון,‏ נבחנו נוכחות וכמות הטעמנים בציטוזול התאים<br />

על מנת לאמוד את הריכוז התוך תאי של הטעמנים השונים בתוך תאי פקיעיות הטעם,‏<br />

47

נעשה בנוסף חישוב בו נלקחה בחשבון בריחתם של הטעמנים החוצה מן הפפילה במשך<br />

טיפול הקולגנאז להוצאת הפפילה מתוך אפיתל הלשון,‏ כמתואר בסעיף<br />

25<br />

.2.2.4<br />

כפי שרואים בטבלה<br />

הדקות של<br />

,3.1<br />

השטף של הטעמנים השונים החוצה נאמד בין 64% ל-‏ 86%. ניתן לראות שהריכוז התוך תאי הסופי של<br />

הטעמנים הגיע לרמות גבוהות של מילימולרים<br />

(mM)<br />

הריכוזים עבור כינין וקפאין,‏ תופעה אשר תוארה גם בתאי טעם מבודדים<br />

ואף נראתה תופעה של הצטברות כנגד מפל<br />

.(132)<br />

CV<br />

-<br />

טבלה מס'‏ 3.1<br />

שלמה.‏<br />

חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך פקיעיות טעם של פפילת<br />

90 שניות,‏<br />

שבסופן החיות<br />

תמיסת הטעמנים בריכוזים המצויינים טופטפה לתוך פיהן של חולדות מורדמות במשך במטרה לזהות נוכחות טעמנים אלה ולקבוע<br />

הוקרבו.‏ תוכן התאים הופרד והורץ ב-‏ HPLC ‏(כמתואר סעיף את ריכוזם התוך תאי.‏ דליפת הטעמנים החוצה מן התאים שהתרחשה במשך הוצאת הפפילה מן הלשון שימשה<br />

ו-‏<br />

כפקטור תיקון לחישוב הריכוז התוך תאי הסופי.‏ הערכים הינם ממוצע ± שגיאת תקן של<br />

בהתאמה)‏ ‏(נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר<br />

ו-‏ מציינות ערכים מובהקים סטטיסטית אלילויקו).‏<br />

**<br />

Tastant<br />

4-9 חזרות.‏ *<br />

Extracellular conc.<br />

(mM) during 90 s of<br />

oral stimulation<br />

(2.2.5<br />

,p

דנ"א גנומי במערכת.‏ כל התוצרים של ריאקצית ה-‏ RT-PCR הובאו ל-‏ sequencing לזיהוי וודאי של<br />

התוצרים.‏<br />

CV<br />

GRKs<br />

-<br />

3.2<br />

איור זיהוי ביטוין של קינאזות ממשפחת ה-‏ בפפילת ה-‏ ובאפיתל הלא-סנסורי<br />

בלשון בשיטת ה-‏ .RT-PCR<br />

cDNA סונתז מרקמת פפילת CV ומאפיתל לא-סנסורי מן הלשון (EP) וביטוי הגנים השונים נבחן ע"י שימוש<br />

בפריימרים יחודיים.‏ GAPDH שימש כביקורת חיובית.‏ כביקורת שלילית (CON) שימשה דוגמא שעברה PCR<br />

ללא שלב ה-‏ .RT תוצרי ה-‏ RT-PCR הורצו בג'ל אגרוז ‏(כמתואר בסעיף גודלם הצפוי של התוצרים<br />

היו<br />

מעקובת הבסיסים של<br />

עבור<br />

כל התוצרים נקבעה על מנת לוודא את זהותם.‏<br />

.(2.2.6.3<br />

612 bp עבור ,GRK5 841 bp עבור ,GRK3 670 bp עבור ,GRK2 559 bp עבור ,GRK1 460 bp<br />

.GAPDH עבור 350 bp ו-‏ עבור T1R3 705 bp עבור ,T2R4 560 bp ,GRK6<br />

3.2.2<br />

– קביעת מיקומם של ה-‏ GRKs השונים בשיטת<br />

immunostaining<br />

על מנת לבחון את מיקום התבטאותם של ה-‏ GRKs השונים בתוך הפפילה,‏ משמע בתאי פקיעיות הטעם<br />

עצמם או בתאי האפיתל שבה,‏ לשון של חולדה נחתכה לרוחב באזור פפילת ה-‏<br />

קריוסטט,‏ והחתכים בעובי של 10 µm הודגרו עם נוגדנים ספציפיים כנגד כל אחד מה-‏<br />

CV<br />

בעזרת מכשיר<br />

.GRKs<br />

באיור 3.3A ניתן לראות בבירור בחתכים את פקיעיות הטעם בעלות צורת אגס ‏(מודגשות ע"י חיצים).‏<br />

ניתן לראות שלאחר הדגרה של החתכים עם נוגדנים כנגד<br />

או ,GRK6 GRK5 ,GRK2<br />

התקבלה צביעה<br />

חזקה של החתכים,‏ כאשר GRK2 נראה גם בתוך פקיעיות הטעם אך גם בתאי האפיתל הלא סנסוריים<br />

העוטפים אותן,‏<br />

GRK5<br />

נראה בעיקר בפקיעיות הטעם עצמן ו-‏<br />

GRK6<br />

נראה בעיקר באפיתל הלא<br />

סנסורי.‏ נוגדן כנגד GRK3 גרם לצביעה חלשה במיוחד ולכן התוצאות אינן מופיעות כאן.‏ צביעת החתכים<br />

נמנעה כמעט לחלוטין בנוכחות החלבון החוסם µg/ml) 25), דבר אשר מעיד על הספציפיות של הנוגדנים<br />

והצביעה.‏<br />

במטרה לבחון בדרך נוספת את הספציפיות של כל אחד מהנוגדנים אשר שימשו בניסוי זה,‏ מיצוי של מוח<br />

חולדה הורץ בג'ל אקרילאמיד,‏ החלבונים הועברו לממברנת ניטוצלולוז וכל פס הודגר עם נוגדן אחר,‏<br />

בהיעדר או בנוכחות חלבון חוסם.‏ כפי שנראה באיור 3.2B, התקבלו פסים יחידים וספציפיים בעלי משקל<br />

מולקולרי צפוי GRK2) בעל משקל של ∼<br />

.(65 kDa ∼ בעלי משקל של GRK6 ו-‏ GRK5 ו-‏ 80 kDa<br />

49

בנוסף,‏ קשירתם של הנוגדנים השונים נחסמה לחלוטין ‏(במקרה של GRK2 רק נחלשה)‏ בנוכחות החלבון<br />

החוסם הספציפי<br />

.(1 µg/ml)<br />

A<br />

B<br />

איור 3.3<br />

– מיקום התבטאות של ה-‏ GRKs בפפילת ה-‏ CV בחולדה.‏<br />

חתכים של פפילת<br />

(A) צביעת חתכים של פפילת CV ע"י נוגדנים ספציפיים כנגד<br />

המכוון כנגד כל אחד מן<br />

CV בעובי של 10 µm הודגרו בבופר בהיעדר (CON) או בנוכחות נוגדן ספציפי מיקומן של פקיעיות הטעם מצויין ע"י חיצים לבנים.‏ קשירתם של הנוגדנים נבחנה גם בנוכחות חלבון<br />

ה-‏ יחודי לכל נוגדן.‏<br />

העברת החלבונים<br />

(B) ספציפיותם של הנוגדנים השונים נבחנה ע"י הרצת מיצוי ממוח חולדה ב-‏<br />

או<br />

והגבה עם אותם הנוגדנים אשר שימשו ב-‏<br />

לממברנת ניטרוצלולוז ‏(כמתואר בסעיף חלבון חוסם.‏ ‏(נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו).‏<br />

בנוכחות .GRK6 ו-‏ GRK5 ,GRK2<br />

(Ab)<br />

,SDS-PAGE<br />

,(A) בהיעדר (-)<br />

.20 µm של Bar scale<br />

(2.2.7.3<br />

.GRKs<br />

חוסם protein) (BP - binding<br />

(+)<br />

50

3.3- חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

HeLa בעזרת מודל בתאי GPCRs<br />

3.3.1- חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי<br />

HeLa<br />

ישנן עדויות בספרות על יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור לתוך ציטוזול של תאי טעם מבודדים<br />

ותאי מלנוציטים בתרבית<br />

.(185 ,132)<br />

לאחר בדיקת מספר שורות תאים בתרבית ,HeLa)<br />

,HEK293<br />

,(HCT/116<br />

נמצא ששלושת הטעמנים המתוקים ‏(סכרין,‏<br />

(NHD ו-‏ D-TRP<br />

ושלושת הטעמנים המרים<br />

‏(קפאין,‏ נרינגין וכינין),‏ אמפיפטיים כולם,‏ חדרו לציטוזול התאים במידה הרבה ביותר בתאי<br />

ריכוזי הטעמנים להם נחשפו התאים תאמו ריכוזים המצויים במזון<br />

.HeLa<br />

.(172 ,158 ,129 ,27 ,7)<br />

זמני<br />

החשיפה היו לרוב 10 דקות חוץ מאשר לכינין,‏ עבורו זמן החשיפה קוצר ל-‏ 3 דקות על מנת שלא לפגוע<br />

בחיות התאים.‏ ניתן לראות בטבלה 3.2 שלאחר החשיפה התקבלו עבור כל הטעמנים ריכוזים תוך תאיים<br />

גבוהים מאוד,‏ אשר הגיעו במקרה של קפאין,‏ סכרין ו-‏ D-TRP לרמות של עשרות מילימולרים.‏ שוב<br />

נראתה כאן תופעה של הצטברות כנגד מפל הריכוזים,‏ בדומה למה שנצפה בניסויי ה-‏<br />

in vivo ‏(סעיף<br />

,(3.1.2<br />

תופעה אשר תוארה בתאי טעם מבודדים אך גם בסוגי תאים נוספים.‏<br />

טבלה 3.2<br />

– חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך תאי .HeLa<br />

תאי HeLa הודגרו עם כל אחד מחמשת הטעמנים הראשונים במשך 10 דקות או במשך 3 דקות עם הטעמן המר<br />

כינין ‏(כמתואר בסעיף בסוף החשיפה,‏ התאים נשטפו נקצרו ופוצצו במטרה לבודד את התוכן<br />

התוך-תאי.‏ נוכחות וריכוז הטעמנים בציטוזול נקבעו בעזרת מכשיר התוצאות מייצגות את הממוצע<br />

שגיאת התקן של 3 חזרות של ניסוי אשר בוצע פעמיים.‏<br />

±<br />

3 פעמים,‏<br />

.HPLC<br />

.(2.2.8.2<br />

3.3.2- השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני cAMP לאחר גירוי<br />

הקולטן ה-‏ β2AR<br />

על מנת להעריך את השפעת הטעמנים חודרי ממברנות על פעילות הקולטן ה-‏ ,β2AR תאי<br />

HeLa אשר<br />

ביטאו את הקולטן הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן,‏ בריכוזים שונים ולזמנים שונים,‏ ואח"כ גורו ע"י<br />

51

,10 µM isoproterenol (ISO)<br />

ליגנד ספציפי ל-‏ ,β2AR לזמנים שונים.‏ מסלול העברת האותות של<br />

הקולטן ה-‏ β2AR כולל הפעלה של חלבון G מסוג G s ושפעול האנזים אדניליל ציקלאז<br />

.cAMP אשר מייצר את השליח המשני cyclase)<br />

(Adenylyl<br />

3.3.2.1- הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה-‏ cAMP בתגובה לגירוי<br />

הקולטן ה-‏ β2AR עי"‏<br />

ISO<br />

מתוך התוצאות ‏(איור 3.4A), ניתן לראות שגירוי הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO גורם להיווצרות מהירה<br />

מאוד של cAMP שמגיעה לשיא תוך<br />

הפוספודיאסטראזות<br />

30 שניות,‏<br />

.(PDE)<br />

אחריהן נצפית ירידה הדרגתית,‏ בעיקר הודות לשפעול<br />

הדגרה מוקדמת של התאים עם טעמנים השונים למשך<br />

3 דקות ‏(או 10<br />

דקות עבור כינין)‏ גרמה לעלייה מובהקת סטטיסטית ברמת ה-‏ cAMP כבר לאחר 30 שניות של גירוי<br />

‏(עלייה של פי<br />

,1.3-1.8<br />

בהתאם לטעמן).‏ ניתן היה לצפות בהבדלים מובהקים גם לאחר 2 דקות של גירוי,‏<br />

ואף לאחר 5 דקות בחלק מן המקרים.‏<br />

עקומת ה-‏ cAMP מתנהגת שונה במקרה של קפאין<br />

,(CAFF)<br />

IBMX למערכת.‏<br />

אחר,‏<br />

בשל הוספת מעכב הפוספודיאסטראזות<br />

קפאין ידוע ומשמש במחקרים רבים כמעכב פוספודיאסטראזות,‏ ובשל כך,‏ מעלה את<br />

רמות ה-‏ cAMP בהקשר שונה מזה הנידון במחקר הנוכחי.‏ על מנת לנטרל השפעה זו בניסויים שלנו<br />

ולבחון את השפעת הקפאין על פעילות הקולטן עצמו,‏ הודגרו תאי ה-‏ HeLa עם מעכב פוספודיאסטראזות<br />

,IBMX<br />

משמעותית ברמות ה-‏<br />

בטרם נחשפו לקפאין וגורו עם<br />

.ISO<br />

ההדגרה המוקדמת עם<br />

IBMX<br />

cAMP<br />

אשר הגיעו לאחר גירוי הקולטן למאות<br />

fmole/µg protein<br />

גרמה לעלייה<br />

לעומת<br />

עשרות בלבד בנוכחות הטעמנים האחרים.‏ ובכל זאת ניתן לראות שבנוכחות קפאין נצפתה עלייה מובהקת<br />

ברמת ה-‏ cAMP בהשוואה לביקורת שהכילה IBMX בלבד.‏ יכולתם של הטעמנים להגביר את רמות<br />

3.4B. לאחר גירוי הקולטן נמצאה גם תלוית ריכוז,‏ כפי שניתן לראות באיור cAMP<br />

3.3.2.2<br />

- הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים<br />

Zubare-Samuelov et al.<br />

וסכרין לשמש ליגנדים לקולטנים שונים מסוג<br />

(185) דיווחו בעבר על יכולתם של מספר טעמנים אמפיפטיים כגון נרינגין<br />

,GPCR<br />

לשלול בעבודה זו אפשרות של גירוי קולטנים אנדוגניים ב-‏<br />

ובכך להשפיע על רמות<br />

cAMP בתא.‏<br />

,HeLa<br />

על מנת<br />

ושל הקולטן ה-‏ β2AR בפרט,‏ ע"י<br />

הטעמנים,‏ נבחנו רמות בסיסיות של cAMP בהיעדר ובנוכחות טעמן בלבד ללא גירוי של הקולטן ה -<br />

β2AR<br />

עצמו ע"י<br />

.ISO<br />

התוצאות באיור<br />

3.5A<br />

מראות שלטעמנים<br />

סכרין,‏ ,NHD<br />

,D-TRP<br />

נרינגין<br />

וכינין לא הייתה שום השפעה על הרמות הבסיסיות של .cAMP במקרה של קפאין התקבלה עלייה של כ-‏<br />

45%, שנגרמה בשל השפעתו על פעילות ה-‏ .PDE<br />

52

A<br />

B<br />

3.4 איור<br />

.ISO עי"‏ β2AR<br />

– טעמנים אמפיפטיים מגבירים את רמות השליח המשני cAMP לאחר גירוי הקולטן ה-‏<br />

HeLa<br />

.3.2<br />

(A) הגברת רמות ה-‏ cAMP ע"י הטעמנים השונים לאחר גירוי הקולטן ע"י ISO הינה תלויה בזמן.‏ תאי<br />

אשר ביטאו את הקולטן ה-‏ β2AR הודגרו בהיעדר ‏(סמנים מלאים)‏ או בנוכחות ‏(סמנים ריקים)‏ כל אחד מחמשת<br />

הטעמנים,‏ לזמנים וריכוזים המצוינים בטבלה במקרה של קפאין,‏ התאים הודגרו קודם לכן עם IBMX<br />

לזמנים<br />

20 דקות לעיכוב פוספודיאסטראזות.‏ בהמשך גורה הקולטן ה-‏<br />

שונים של עד בסופן ה-‏ cAMP התוך תאי מוצה וכומת בשיטת ה-‏ .RIA התוצאות הינן ממוצע<br />

התקן של לפחות 6 חזרות מתוך ניסוי אשר בוצע 2-3 פעמים.‏<br />

(B) השפעת הטעמנים על רמות cAMP הינה תלוית-ריכוז.‏ תאים נחשפו לריכוזים שונים של הטעמנים לזמנים<br />

כמות ה-‏ cAMP התוך תאי נקבעה כמתואר ב -<br />

המצויינים בטבלה 3.2 ולאחר מכן ל-‏ ISO<br />

20 דקות לפני שהודגרו עם קפאין.‏ התוצאות מובאות<br />

גם כאן,‏ התאים נחשפו ל-‏ IBMX<br />

כאחוז יחסי לביקורת המתאימה כאשר הביקורת מהווה 100%, ומייצגת רמות cAMP בהיעדר טעמנים.‏ התוצאות<br />

מציינות עלייה מובהקת<br />

הינן ממוצע ± שגיאת תקן של לפחות 6 חזרות של ניסוי אשר בוצע<br />

בהתאמה)‏ ברמות ה-‏ cAMP בין הביקורת לטיפול.‏<br />

סטטיסטית<br />

(150<br />

(10 µM) ISO עם β2AR<br />

± שגיאת<br />

2-3 פעמים.‏ * ו-‏ **<br />

µM) 10) במשך דקה.‏<br />

µM) (150 למשך<br />

ו-‏ 0.01>p,<br />

5 דקות,‏<br />

p

3.3.2.3<br />

- פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת cAMP בתגובה<br />

לגירוי הקולטן ה-‏ β2AR<br />

בהמשך,‏ נבחנה יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים להגביר את רמות ה-‏<br />

cAMP<br />

β2AR ע"י ISO<br />

לאחר גירוי הקולטן ה-‏<br />

כתלות בזמן החשיפה של התאים לאותם הטעמנים.‏ לשם כך התאים הודגרו עם<br />

הטעמנים השונים למשך דקה,‏ 5 דקות ו-‏<br />

10 דקות,‏<br />

בטרם גורו עם ISO למשך דקה.‏ על פי התוצאות<br />

המסוכמות באיור 3.5B, פראינקובציה של לפחות 5 דקות עם הטעמנים הייתה הכרחית על מנת לראות<br />

את השפעתם על רמות ה-‏ cAMP מאחר ולחלק ניכר מן הטעמנים לא נראתה כלל השפעה לאחר חשיפה<br />

של דקה בלבד ‏(חוץ מנרינגין).‏ בנוסף,‏ ככל שזמן החשיפה לטעמן היה ארוך יותר כך התעצמה השפעתו.‏<br />

A<br />

B<br />

β2AR<br />

(<br />

)<br />

– 3.5<br />

cAMP<br />

והשפעתם על רמות<br />

טעמנים אמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטני ה-‏ איור לאחר גירוי ה-‏ β2AR תלויה בחדירתם לתא.‏<br />

(A) הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטן ה-‏ .β2AR תאי HeLa אשר מבטאים את הקולטן ה -<br />

‏(מלבד<br />

הטעמנים השונים לזמנים וריכוזים המצויים בטבלה או בנוכחות הודגרו בהיעדר לאחר מיצוי תוכן התאים,‏ הרמות הבזליות של<br />

ללא גירוי נוסף ע"י בשיטת RIA ‏(כמתואר בסעיף 2.2.9.3).<br />

תלויה במשך ההדגרה המוקדמת<br />

לאחר גירוי הקולטן ה-‏ β2AR (B) השפעת הטעמנים על<br />

הודגרו בהיעדר ‏(ביקורת)‏ או בנוכחות<br />

של התאים עם הטעמנים.‏ תאים אשר מבטאים את הקולטן ה - לאחר גירוי הקולטן עם ISO למשך דקה,‏ תוכן התאים<br />

הטעמנים האמפיפטיים לזמנים שונים<br />

מוצה וכמות ה-‏ cAMP נקבעה בשיטת .RIA התוצאות הינן ממוצע ± שגיאת תקן של לפחות 6 חזרות בכל טיפול.‏<br />

בהתאמה)‏ ברמות ה-‏ cAMP יחסית לביקורת.‏<br />

מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית<br />

3.2<br />

cAMP נקבעו<br />

ב-‏ ISO<br />

β2AR<br />

ו-‏ 0.01>p,<br />

( )<br />

.ISO<br />

,1) 5 ו-‏ 10 דקות).‏<br />

p

3.3.2.4<br />

- השפעת הטעמנים איננה תלויה ב-‏ PDE<br />

או ב-‏ .PKA<br />

מטרה מרכזית בעבודה זו היא חקר יכולתם של טעמנים חודרי ממברנות להשפיע על מסלול<br />

הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏ .β2AR מאידך,‏ ייתכן והשפעת הטעמנים על רמות<br />

cAMP<br />

נובעת מעיכוב<br />

של פוספודיאסטראזות ע"י הטעמנים עצמם,‏ בדומה לקפאין,‏ וזאת למרות שבניגוד לקפאין,‏ הטעמנים<br />

סכרין,‏ ,NHD<br />

,D-TRP<br />

נרינגין וכינין לא השפיעו על הרמות הבסיסיות של<br />

פעילות PDE נצפה בעיקר לאחר גירוי הקולטן והיווצרות ה-‏ .cAMP<br />

.cAMP<br />

מצד שני,‏ עיכוב<br />

A<br />

B<br />

היווצרות cAMP<br />

3.6<br />

בעקבות גירוי ה-‏ β2AR אינה תלויה בפעילותם<br />

איור – השפעת הטעמנים על<br />

של פוספודיאסטראזות א)‏ ו ב-‏ .PKA<br />

השפעת הטעמנים אינה תלויה ב-‏ רמות ה-‏ הבזליות ולאחר גירוי הקולטן ע"י<br />

בהיעדר או בנוכחות מעכב פוספודיאסטראזות 150) µM) IBMX בשילוב עם היעדר או נוכחות טעמן.‏<br />

(B) השפעת הטעמנים אינה תלויה ב-‏ .PKA רמות ה-‏ cAMP לאחר גירוי הקולטן ע"י ISO נבחנו בהיעדר או<br />

בשילוב או בהיעדר טעמן.‏ * מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית<br />

בנוכחות מעכב ,PKA<br />

בהתאמה)‏ ברמות ה-‏ cAMP יחסית לביקורת המתאימה.‏<br />

ISO נבחנו<br />

ו-‏ **<br />

cAMP<br />

.PDE<br />

PDE)<br />

(A)<br />

,(20 µM) H89<br />

,p

במטרה לשלול את האפשרות הזו,‏ נבחנה השפעתם של הטעמנים בהיעדר ובנוכחות .IBMX תאי<br />

HeLa<br />

אשר ביטאו את הקולטן ה-‏ β2AR הודגרו עם 150) µM) IBMX למשך 20 דקות בטרם נחשפו למשך<br />

10 דקות לטעמן (3 דקות לכינין)‏ ואחר כך ל-‏ ISO במשך דקה.‏ מן התוצאות<br />

‏(איור 3.6A)<br />

ניתן לראות<br />

שבכל המקרים,‏ ההגברה ברמות ה-‏ cAMP ‏(לאחר גירוי הקולטן)‏ התקבלה גם בהיעדר וגם בנוכחות<br />

.IBMX<br />

נוכחותו של מעכב הפוספודיאסטראזות אומנם גרמה לקפיצה משמעותית ברמות ה-‏ ,cAMP אך<br />

מידת ההגברה שהתקבלה בעקבות חשיפת התאים לטעמנים האמפיפטיים נשארה דומה לזו שבהיעדר<br />

המעכב<br />

‏(פי 1.5-2).<br />

מכיוון שמסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏ β2AR מערב קינאזות מסוג<br />

GRKs<br />

אך גם ,PKA נשאלה<br />

השאלה אם לא מסתתר מאחורי השפעת הטעמנים עיכוב של קינאז ה-‏ .PKA על מנת לברר נקודה זו,‏<br />

נבחנה השפעתם של הטעמנים על רמות<br />

נוכחות<br />

cAMP<br />

בהיעדר ובנוכחות מעכב<br />

PKA בשם .H89<br />

H89<br />

כצפוי,‏<br />

µM) 20) גרמה לעלייה ברמות ה-‏ cAMP לאחר גירוי עם ISO ‏(איור 3.6B), בשל עיכוב<br />

מסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן,‏ אשר כולל בין היתר שפעול חלבון G i ועיכוב אדניליל ציקלאז<br />

,32)<br />

.(123<br />

למרות זאת הדגרה של התאים עם הטעמנים השונים גרמה להגברה ברמות ה-‏<br />

לגירוי הקולטן ע"י ,ISO בין אם H89 היה נוכח לבין אם לא.‏<br />

cAMP בתגובה<br />

3.3.3<br />

ISO<br />

- השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה-‏ β2AR ע ‏"י GRK2/5 בעקבות גירוי<br />

ע ‏"י<br />

על מנת לבחון את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מסלול הדסנסיטיזציה של<br />

קולטני GPCR ע"י עיכוב אינטרצלולרי של הקינאזות ממשפחת ה-‏<br />

נבדקה השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה-‏<br />

האחראיות על<br />

הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏<br />

,GRKs<br />

,GRK5 ו-‏ GRK2 .β2AR<br />

,β2AR<br />

מתבטאות<br />

אנדוגנית בתאי<br />

נעשו ניסויים נוספים בהם<br />

שתי הקינאזות העיקריות<br />

.HeLa<br />

בניסויים<br />

המתוארים להלן נעשה שימוש בקולטן ה-‏ β2AR אשר קשור לסמן HA ‏(להלן .(β2HA לאחר גירוי<br />

הקולטן ע"י<br />

ISO<br />

לזמנים שונים בהיעדר או בנוכחות טעמן,‏<br />

התאים נקצרו בבופר איזוטוני<br />

RIPA<br />

לשמירה על שלמותם של חלבונים ממברנליים ‏(כגון קולטנים).‏ לאחר השקעה אימונית של הקולטן,‏ זיהוי<br />

הקולטנים המזורחנים נעשה ע"י שימוש בנוגדן אשר מזהה ספציפית עמדות המזורחנות ע"י<br />

GRK2 ו -<br />

,3.7A באיור .GRK5<br />

כאשר שיא הזרחון נראה בערך לאחר<br />

ניתן לראות שקולטני ה-‏ β2HA מזורחנים בתנאים רגילים<br />

(CON) במהירות,‏<br />

5-10<br />

דקות לאחר תחילת הגירוי.‏ בהמשך נצפית ירידה ברמת<br />

הזרחון,‏ כנראה הודות לשפעול פוספטאזות,‏ כך שלאחר 20 דקות רוב הקולטנים נמצאים בצורה הלא-‏<br />

מזורחנת שלהם.‏ להפתעתנו,‏ חשיפה של התאים לכל אחד מששת הטעמנים השונים גרמה לא רק לירידה<br />

ברמת הזרחון של הקולטן אלא גם לאיחור בהופעתו.‏ זרחון הקולטן נצפה רק לאחר<br />

15 דקות<br />

,NHD<br />

סכרין,‏ כינין וקפאין ולאחר<br />

20 דקות<br />

בנוכחות D-TRP ונרינגין.‏<br />

עיבוד התוצאות ע"י תוכנת ImageJ לכימות עוצמת הכתמים בכל נקודת זמן<br />

‏(איור 3.7B)<br />

בנוכחות<br />

מראה בצורה<br />

גרפית את השהיית הופעת הזרחון מ-‏ 5 דקות עבור הביקורת ל-‏ 10-20 דקות בנוכחות ששת הטעמנים.‏<br />

56

3.7 איור<br />

.ISO<br />

(A)<br />

– טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הופעתו של זרחון הקולטן ה-‏ β2AR לאחר גירוי עם<br />

(β2HA) HA<br />

.(2.2.10.1<br />

,10%<br />

β2AR<br />

הודגרו בהיעדר או<br />

אשר קשור לחלבון מזהה<br />

תאים אשר מבטאים את הקולטן ה-‏ התאים נקצרו והקולטן<br />

בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם ISO לזמנים שונים ‏(כמתואר בסעיף הועברו לממברנת<br />

SDS‏-אקרילאמיד הדוגמאות הורצו בג'ל נוקה משאר חלבוני התאים.‏ בוצע ע"י שימוש בנוגדן מכוון כנגד עמדות סרינים המזורחנות<br />

ניטרוצלולוז וזיהוי הקולטנים המזורחנים זיהוי כמויות כלליות של β2HA נעשה ע"י<br />

‏(מיהול על ידי<br />

שימוש בנוגדן מכוון נגד HA ‏(מיהול 1:1000).<br />

בכל נקודת זמן עבור כל טיפול,‏ נעשה בעזרת תוכנת<br />

כימות עוצמת הכתמים מתוך הערכים הינם הממוצע<br />

לדמיין את העיכוב בהופעתו של הזרחון בנוכחות הטעמנים יחסית לביקורת שגיאת התקן ביחידות שרירותיות של שלוש חזרות של<br />

ה -<br />

ImageJ ומאפשר<br />

±<br />

.(CON)<br />

.(1:600<br />

.(A)<br />

β2HA<br />

(pβ2AR)<br />

,anti-phosphoSer(355-356) ,GRK2/5<br />

,(A)<br />

(B)<br />

57

3.3.4<br />

- השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה-‏ β2AR<br />

אם אכן טעמנים אמפיפטיים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י עיכוב<br />

,GRKs<br />

קיימת סבירות גבוהה<br />

שתהליכים ביולוגיים התלויים בזרחון זה יימצאו מעוכבים גם הם.‏ אחד מהם הינו מנגנון האינטרנליזציה<br />

של הקולטן אשר תלוי בקשירת β-arrestin לקולטן המזורחן.‏ במטרה לבחון את השפעת הטעמנים על<br />

תהליך האינטרנליזציה נעשתה טרנספקציה של β2AR בתאי<br />

,HeLa<br />

ולאחר הדגרה של התאים בהיעדר<br />

או בנוכחות טעמן,‏ הקולטן גורה עם ISO לזמנים שונים,‏ התאים קובעו ומיקומם של הקולטנים ‏(ממברנלי<br />

או ציטוזולי)‏ נבדק במיקרוסקופיה קונפוקלית.‏ ניתן לראות ‏(איור 3.8A) שלפני גירוי ‏(זמן<br />

β2AR נראה בצורה ברורה וחדה על גבי הממברנה הפלסמטית של התאים.‏<br />

,(0<br />

הקולטן ה -<br />

A<br />

B<br />

ISO<br />

β2AR<br />

מעוכב ע ‏"י קפאין<br />

בעקבות גירוי עם איור 3.8- מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה-‏ וסכרין.‏<br />

בהיעדר או בנוכחות קפאין<br />

(A) תאים אשר ביטאו את הקולטן ה-‏ ,β2AR הודגרו במשך ואז גורו עם ISO לזמנים שונים.‏ התאים צולמו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר קיבוע וצביעת<br />

סכרין התמונות מייצגות את מצבם של רוב<br />

‏(כמתואר בסעיף התאים עם נוגדן כנגד הקולטן ה-‏ ה-‏ התאים אשר נצפו בנקודת הזמן הספציפית.‏<br />

mM) (5 או<br />

10 דקות<br />

.(2.3.11<br />

β2AR<br />

(10 mM)<br />

58

ISO<br />

β2AR נחשפו<br />

15<br />

0<br />

לשני ריכוזים של קפאין או סכרין בטרם גורו ע"י<br />

(B) תאים אשר ביטאו את הקולטן ה-‏<br />

לזמנים שבין ל-‏ דקות.‏ לאחר קיבוע התאים,‏ מיקומם של הקולטנים ‏(ממברנלי או ציטוזולי)‏ נקבע תחת<br />

מיקרוסקופ קונפוקלי.‏ התוצאות מובאות כאחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי יחסית לביקורת ‏(זמן<br />

התוצאות הינן ממוצע ± שגיאת התקן של כל אחת של כ-‏ מתוך ניסוי אשר<br />

נעשה לפחות פעמיים.‏ * מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית ו-‏ בהתאמה)‏ באחוז התאים<br />

המכילים קולטן ממברנלי יחסית לביקורת המתאימה.‏<br />

(0<br />

300 תאים,‏<br />

,p

דרך נוספת להעריך את השפעתם של טעמנים אמפיפטיים על מנגנון האינטרנליזציה היא בעזרת<br />

פרקציונציה של התא.‏ בשיטה זו מופרדת הפרקציה הציטוזלית מן הפרקציה הממברנלית,‏ ונוכחות ו/או<br />

כמות חלבון מסוים ‏(במקרה זה הקולטן ה-‏<br />

ספציפי.‏ באיור<br />

(β2AR<br />

נבדקות בשיטת<br />

Western blot<br />

,3.10<br />

ניתן לראות בפרקציה הממברנלית של הביקורת<br />

(CON)<br />

ושימוש בנוגדן<br />

את הירידה ההדרגתית<br />

בכמות הקולטן ככל שמתארך הגירוי ע"י ,ISO לעומת עלייה הדגרתית מקבילה בפרקציה הציטוזולית.‏<br />

לעומת זאת,‏ הדגרה מוקדמת של התאים עם כל אחד מששת הטעמנים בטרם גורו עם ISO גרמה לירידה<br />

הרבה יותר מתונה בכמות הקולטן בפרקציה הממברנלית,‏ במיוחד במקרים של קפאין ונרינגין,‏ כך שלאחר<br />

20 דקות נוכחותו של הקולטן בפרקציה זו הייתה עדיין ברורה.‏<br />

A<br />

B<br />

(A)<br />

איור 3.10- הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את הופעתו של הקולטן ה-‏ β2AR בפרקציה הציטוזולית<br />

של התאים בעקבות גירוי עם .ISO<br />

לאחר הדגרה של התאים בהיעדר או בנוכחות טעמנים וגירוי הקולטן ה-‏ עם לזמנים שונים,‏<br />

הממברנה הפלסמטית של התאים הופרדה מן התוכן הציטוזולי בעזרת שרשרת של סרכוזים במהירויות שונות<br />

‏(כמתואר בסעיף בסוף הסרכוז האחרון הפרקציה הציטוזולית הופרדה והמשקע הורחף בבופר<br />

להמסת הממברנות.‏ שתי הפקרציות הורתחו בנוכחות sample buffer ודוגמה מכל פרקציה הורצה על ג'ל<br />

נוכחות הקולטן נקבעה ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד HA ‏(מיהול<br />

כימות עוצמת הכתמים מתוך בכל נקודת זמן עבור כל טיפול,‏ נעשה בעזרת תוכנת הירידה<br />

ההדרגתית בכמות הקולטן הממברנלי אשר נראית בביקורת (CON) ככל שמתארך הגירוי,‏ מעוכבת בנוכחות כל<br />

אחד מהטעמנים האמפיפטיים.‏ התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נעשו לפחות פעמיים.‏<br />

ISO<br />

RIPA<br />

- SDS<br />

1:1000 ב-‏ .(TBST<br />

.ImageJ<br />

β2HA<br />

,(A)<br />

.(2.2.13<br />

אקרילאמיד 12%.<br />

(B)<br />

60

3.3.5<br />

– השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ERK<br />

בתגובה לגירוי עם .ISO<br />

מחקרים רבים בשנים האחרונות מצביעים על יכולתו של הקולטן ה-‏ β2AR לעורר מספר מסלולי העברת<br />

אותות נוספים לזה העובר דרך החלבון<br />

,G s<br />

וביניהם מסלול ה-‏ (ERK) MAPK<br />

.(100 ,99 ,92)<br />

שתי דרכים בהן β2AR גורם לשפעול של :ERK לאחר זרחון ע"י PKA בטווח זמנים של<br />

ולאחר זרחון ע"י GRKs בטווח זמנים ארוך יותר של<br />

ישנן<br />

2-5 דקות<br />

10-30 דקות.‏<br />

הקודמים מצביעות על יכולתם של הטעמנים לעכב את פעילותן של<br />

של הטעמנים על שפעולו של<br />

מכיוון שהתוצאות שלנו מהניסויים<br />

,GRKs<br />

.ERK<br />

בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו ע"י ISO לזמנים שבין<br />

לאחר שתאים המבטאים את הקולטן<br />

בשלב זה נבחנה השפעתם<br />

β2AR<br />

2 ל-‏ 30 דקות,‏<br />

הודגרו בהיעדר או<br />

רמת הזרחון של ERK נבדקה<br />

בשיטת Western blot ע"י שימוש בנוגדן ספציפי.‏ כפי שנראה באיור 3.11A, הטעמנים לא השפיעו על<br />

רמת הזרחון הבסיסית של ERK ‏(ללא גירוי הקולטן),‏ חוץ מקפאין אשר נראה בעל השפעה מעכבת.‏ דבר<br />

זה מצביע על כך שלפחות לטעמנים סכרין,‏ ,NHD<br />

,D-TRP<br />

MAPK<br />

עצמו.‏ על מנת לוודא שחוסר התגובה של<br />

כלשהי בתאים,‏ תאי ה-‏<br />

האנדוגני<br />

ERK<br />

EGF גורו עם HeLa<br />

(EGF Receptor) EGFR<br />

נרינגין וכינין אין השפעה על מסלול ה-‏<br />

לטעמנים אינו נובע מחוסר תפקודו מסיבה<br />

Factor) (Epidermal Growth אשר משפעל את הקולטן<br />

בתאים אלה,‏ ו-‏<br />

ERK<br />

ידוע כאחד ממסלולי העברת האותות<br />

העיקרי שלו.‏ ואכן ניתן לראות באיור 3.11A את השפעול החזק של ERK בתגובה ל-‏<br />

גירוי הקולטן ה-‏<br />

.EGF<br />

β2AR ע"י ,ISO<br />

דקות)‏ ונמוך יותר בטווח הזמנים הארוך יותר<br />

התקבל שפעול חזק יחסית של<br />

ERK<br />

בטווח הזמנים הקצר<br />

לאחר<br />

2-5)<br />

30 עד 10)<br />

.(155)<br />

של<br />

בנוכחות הטעמנים,‏ השפעול של<br />

ERK<br />

בטווח הזמנים של<br />

דקות)‏ בדומה לדיווחים קודמים מהספרות<br />

2-5<br />

דקות לא נראה מושפע ‏(חוץ<br />

מקפאין).‏ לעומת זאת,‏ הדגרה של התאים עם כל ששת הטעמנים גרמה לעיכוב של ERK בטווח הזמנים<br />

10-30 דקות,‏<br />

אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י GRK ‏(איור 3.11B). קפאין עיכב בצורה משמעותית<br />

של השפעול של ERK גם בטווח הקצר וגם בטווח הארוך,‏ דבר אשר מעיד על יכולתו של טעמן זה לעכב<br />

את שני מסלולי הדסנסיטיזציה.‏<br />

61

3.11- איור<br />

.GRKs עי"‏ β2AR<br />

(A)<br />

הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את שפעול<br />

ERK<br />

HeLa .ERK<br />

– 3 דקות)‏<br />

,pERK) מזורחן ERK<br />

אשר תלוי בזרחונו של הקולטן ה -<br />

הטעמנים האמפיפטיים אינם משפעלים את תאי המבטאים את הקולטן ה-‏ נחשפו β2AR<br />

לטעמנים השונים במשך ‏(כינין ומיד לאחר מכן,‏ תוכן התאים מוצה.‏ 20 µg הורצו בכל באר<br />

מיהול מול כמות ה-‏<br />

של ג'ל SDS ‏-אקרילאמיד 12% וזיהוי נוכחות<br />

נעשה ע"י שימוש בנוגדנים ספציפיים.‏<br />

הכללית<br />

(B) הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את מסלול שפעולו של ERK אשר תלוי ב-‏ לאחר הדגרה של התאים<br />

בהיעדר או בנוכחות טעמן ושפעול הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO לזמנים שונים,‏ נמדדה רמת השפעול של ERK<br />

בכל נקודת זמן כמתואר ב-‏ A. התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נערכו לפחות שלוש פעמים.‏ בצד ימין,‏<br />

מוצגים גרפית ההבדלים בעוצמת הכתמים בכל נקודת זמן,‏ בהיעדר (□) או בנוכחות טעמן,‏ כאשר זמן<br />

שרירותית כ-‏‎1‎‏.‏ ו-‏ מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית במבחן דו-כיווני וחד כיווני,‏<br />

בהתאמה)‏ ברמות הזרחון של ERK יחסית לביקורת המתאימה.‏ ‏(נעשה בשיתוף עם גברת עינב מלאך).‏<br />

ERK<br />

0 הוגדר<br />

(1:40,000<br />

.GRKs<br />

(■)<br />

t-test<br />

,p

4. דיון ומסקנות<br />

תגליות חשובות בעשור האחרון הביאו לפריצת דרך אדירה בהבנת התהליכים הביולוגיים שמאחורי<br />

חישת הטעם.‏ הוכח שקולטנים ממשפחת ה-‏<br />

המתוקים והאוממים שבמזון<br />

GPCRs<br />

.(119 ,118 ,24)<br />

הינם אחראים על קשירת הטעמנים המרים,‏<br />

למרות שמסלולי העברת אותות אפשריים נחקרו שנים<br />

רבות קודם לכן,‏ שימוש בביולוגיה מולקולרית ועכברים מהונדסים גנטית אפשר לשפוך אור על<br />

המרכיבים החיוניים לחישת שלושת הטעמים האלו<br />

.(183)<br />

הלאה למערכת העצבית התגלה כשונה מרוב המערכות הידועות<br />

בנוסף,‏ מנגנון העברת המידע מתא הטעם<br />

.(143 ,28)<br />

בניגוד למנגנונים האחראים<br />

על העברת המידע מהקולטן הלאה,‏ מנגנון סיום העברת המידע לא נחקר כלל בספרות.‏ בנוסף,‏ לא הוסברו<br />

עד כה תופעות כגון השאריתיות המורגשת לאחר טעימת טעמנים מרים או ממתיקים לא סוכריים.‏ על<br />

בסיס מספר מחקרים שנערכו,‏ נראה שתופעת השאריתיות בטעם נובעת מהעברת אינפורמציה ממושכת<br />

מהרגיל מתאי הטעם אל תאי העצב<br />

.(160 ,59)<br />

ההשערה אשר הועלתה מציעה שמסיבה כלשהי מנגנון<br />

כיבוי העברת האותות של קולטני הטעם ‏(דסנסיטיזציה)‏ אינו מתפקד במלואו ולכן העברת האינפורמציה<br />

מתמשכת לתקופה ארוכה יותר.‏ טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים הינם מולקולות אמפיפטיות.‏<br />

השערת העבודה הנוכחית הינה שהודות לתכונת האמפיפטיות שלהן,‏ מולקולות אלו מסוגלות לעבור את<br />

הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם ומרגע שהגיעו לתוך ציטוזול התאים,‏ מעכבות את תהליך<br />

הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

מטרות:‏<br />

GPCRs<br />

(1<br />

כולל אלה של הטעם.‏ על מנת להוכיח השערה זו,‏ הוצבו שלוש<br />

להוכיח שטעמנים אמפיפטיים,‏ מרים ומתוקים,‏ מסוגלים לחדור לתוך ציטוזול תאי הטעם<br />

בתנאים פיזיולוגיים ‏(תנאי הכרחי על מנת שיוכלו להשפיע על תהליכים ציטוזוליים),‏<br />

נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

(2<br />

GRKs<br />

חיוני לקיום מנגנון הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני ה-‏<br />

לבחון את<br />

בתאי פקיעית הטעם,‏ בידיעה שקינאזות אלו מהוות מרכיב<br />

(3 ,GPCRs<br />

לבחון את השפעתם של<br />

טעמנים אמפיפטיים על תפקודה והתקדמותה של הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני ה-‏<br />

במערכת תאית אשר תהווה מודל לתאי הטעם וקולטני הטעם.‏<br />

GPCRs<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם<br />

4.1<br />

במחקרים קודמים הוכח שטעמנים אמפיפטיים חודרים ממברנות של ליפוזומים וגם לתוך תאי טעם<br />

מפקיעיות טעם מבודדות או פפילות טעם מבודדות<br />

של<br />

.(132)<br />

הבעיתיות המרכזית בניסויים אשר נערכו עד<br />

כה הינה שתנאי הניסוי אינם תואמים תנאים פיזיולוגיים.‏ כאשר פפילת הטעם מעוגנת בתוך הלשון,‏ הצד<br />

האפיקלי בלבד של תאי הטעם נמצא באינטראקציה עם הטעמנים,‏ דרך ה-‏<br />

.taste pore<br />

tight junctions<br />

בנוסף,‏ נוכחותם<br />

המחברים בין התאים בצד האפיקלי של הפקיעית מהווים מחסום,‏ כך שתאי<br />

הפקיעית אינם צפויים לפגוש בשום מקרה את מרכיבי המזון ‏(טעמנים)‏ בצד הבזולטרלי שלהם.‏ תנאים<br />

63

אלו אינם נשמרים כאשר פפילת הטעם מופרדת מרקמות חיבור ושריר לאחר טיפול אנזימטי.‏ לכן השלב<br />

הראשון של עבודה זו הוקדש לבחינת חדירתם של טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי פקיעית הטעם בתנאים<br />

פיזיולוגיים.‏ מעקב דינמי אחר חדירת טעמנים אמפיפטיים תוך כדי הדגרתם עם פפילת<br />

שלמה CV<br />

במיקרוסקופ קונפוקלי היתה אחת השיטות לחקור את מידת חדירתם לתוך פפילת הטעם.‏ העלייה עם הזמן<br />

ברמת הפלואורסצנציה בדיוק באזור ה-‏ inner trench של פפילת ה-‏ CV ‏(איור<br />

(3.1<br />

מעידה על חדירה<br />

והצטברות הדרגתית של הטעמנים לתוך תאי פקיעיות הטעם עצמן.‏ נוכחות פלואורסצנציה גם ברקמה<br />

האפיתליאלית המקיפה את פפילת הטעם מעידה על יכולתם של אותם הטעמנים לחדור גם לתוך תאים לא<br />

סנסוריים.‏ שימוש ב-‏<br />

ל-‏<br />

,KI<br />

אשר פועל כמדעיך פלואורסצנטי אך אינו חודר ממברנות,‏ הוכיח כי העלייה<br />

ברמת הפלואורסצנציה נובעת מחדירה אמיתית של הטעמנים לתוך פקיעיות הטעם ולא מתוך הצטברות<br />

חיצונית לתוך תעלת הפפילה או ספיחה חיצונית על פני האפיתל.‏ העובדה ש-‏ KI גרם לדעיכה מיידית<br />

ומוחלטת של PI ‏(אשר אינו חודר ממברנות)‏ אך לא שינה את רמת הפלואורסצנציה של הטעמנים הוכיחה<br />

שהטעמנים אכן נמצאים בתוך ציטוזול התאים או לפחות עמוק בתוך הממברנה הפלסמטית שלהם,‏ שם אין<br />

KI גישה.‏<br />

קינאזות ה-‏ ,GRKs שפעילותן בנוכחות טעמנים נחקרה בעבודה זו,‏ נמצאות חלקן מעוגנות<br />

בתוך הממברנה הפלסמטית הודות להוספת חומצות שומן בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי שלהן,‏ או לפחות ממוקמות<br />

בסמוך לצד הציטוזולי של המבברנה הודות לאפיניות שלהן לפוספוליפידים או חלבונים אחרים כגון תת -<br />

היחידה βγ של חלבון ה-‏ G. לכן ייתכן והטעמנים מסוגלים לבוא במגע עם אותן ה-‏ GRKs גם מבלי<br />

לחדור עמוק לתוך ציטוזול התא אלא גם כאשר הם פונים כלפי הצד הציטוזולי של הממברנה הפלסמטית.‏<br />

מנגנון חדירת הטעמנים לתוך תאי הטעם איננו ידוע.‏ בהיותם מולקולות אמפיפטיות,‏ ההשערה הראשונה<br />

שהועלתה הייתה שטעמנים אלו חודרים בעזרת דיפוזיה פסיבית דרך הממברנה הפלסמטית.‏ ייתכן שהודות<br />

לשילוב של קבוצות הידרופוביות וקבוצות הידרופיליות שבתוכן,‏ מולקולות הטעמנים מסוגלות להתקרב<br />

ולהיצמד לממברנה הפלסמטית ואף לנוע בתוכה ולעבור לצד הציטוזולי שלה.‏ תמיכה לתיאוריה זו מראה<br />

שטעמנים אמפיפטיים אכן מסוגלים לחדור לתוך ליפוזומים המורכבים מפוספוליפידים וכולסטרול בלבד<br />

.(132)<br />

למרות שתיאוריה זו אפשרית,‏ קצב חדירת הטעמנים נמצא מהיר יותר מזה שמאפשרת דיפוזיה<br />

פסיבית.‏ מצד שני,‏ נראה שלא מדובר גם כן בניצול של תעלה אקטיבית ע"י הטעמנים.‏ למרות שמעכב<br />

האנרגיה<br />

CCCP<br />

עיכב את כניסתם של סכרין ו-‏<br />

D-TRP<br />

לתוך תאי טעם מפפילה מבודדת,‏ נמצא<br />

שהסיבה לכך הייתה בגלל שינוי בפוטנציאל הממברנה ולא בגלל חוסר במולקולות<br />

מעכב האנרגיה<br />

ATP<br />

oligomycin<br />

לא עיכב את חדירתם של הטעמנים סכרין,‏<br />

,D-TRP<br />

.(117) cyclo(Leu-Trp)<br />

יחד,‏ תוצאות אלו פסלו את האפשרות של ניצול נשא אקטיבי<br />

בתא.‏ ואכן,‏<br />

כינין והפפטיד<br />

(transporter)<br />

להחדרת טעמנים אלו פנימה אל הציטוזול.‏<br />

ייתכן וחדירתם של הטעמנים דרך הממברנה מתאפשרת הודות לתופעה בה מספר מולקולות מתארגנות<br />

יחד ליצירת פורות<br />

,(pores)<br />

כאשר הקבוצות ההידרופיליות פונות לצד אחד והקבוצות ההידרופוביות<br />

פונות לצד שני.‏ כך,‏ מולקולות אמפיפטיות ‏"בונות"‏ לעצמן דרך מעבר בתוך הממברנה הליפידית ועוברות<br />

אותה.‏<br />

64

אם אכן הטעמנים חודרים לתוך תאי הטעם בכוחות עצמם ‏(דרך דיפוזיה או בניית פורות)‏ ולא דרך תעלה<br />

אקטיבית,‏ איך ניתן להסביר את הצטברות הטעמנים כנגד מפל הריכוזים אשר נראתה גם בעבודה זו<br />

בניסויי ה-‏<br />

בעבודות אחרות<br />

in-vivo<br />

עבור כינין וקפאין ‏(טבלה<br />

(3.1<br />

?(185 ,132)<br />

בתוך אורגנלות התא כגון הגרעין<br />

ותוארה גם עבור טעמנים אמפיפטיים אחרים<br />

ייתכן והסבר אפשרי טמון ביכולתם של הטעמנים לחדור ולהצטבר גם<br />

.(132)<br />

חדירת הטעמנים לתוך אורגנלות התא יכולה לגרום למצב בו<br />

הריכוז הציטוזולי עצמו אינו עולה על הריכוז החוץ תאי ולכן הטעמן ממשיך לחדור פנימה,‏ וכך מצטבר<br />

בהדרגתיות בתוך התא.‏<br />

מטרת ניסויי ה-‏<br />

in-vivo<br />

בחולדות מורדמות הייתה לחקות מצב של שתייה המתמשכת כ-‏<br />

שניות,‏ 90<br />

ולבחון בסופן נוכחות של טעמנים בתאי פפילת ה-‏ .CV על מנת להפריד את התוכן הציטוזולי של תאי<br />

הטעם בתום ה-‏<br />

90 שניות,‏<br />

בקולגנאז אשר ארך כ-‏<br />

בתמיסת<br />

25<br />

.TGPP<br />

מכיוון שה-‏<br />

היה צורך להפריד את פפילת ה-‏ CV מן הלשון בעזרת ניתוח וטיפול אנזימטי<br />

דקות.‏ לאורך כל זמן הניתוח,‏ הלשון ולאחר מכן הפפילה עצמה נמצאו<br />

TGPP<br />

לא הכיל בעצמו טעמן,‏ ניתן לצפות שחלק מהטעמנים אשר היו<br />

בתאי הפפילה ‏"יברחו"‏ החוצה כתוצאה מהפיכת מפל הריכוזים או ע"י שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה-‏<br />

.(multidrug resistance protein) mdr<br />

טרנספורטרים ממשפחה זו אחראים על הוצאת תרכובות זרות<br />

או רעילות מתוך ציטוזול התא,‏ ומחקרים הראו כי mdr1 מתבטא בפפילת ה-‏ CV<br />

.(71)<br />

לפיכך חושב<br />

עבור כל טעמן פקטור אשר יהווה אומדן למידת הבריחה של הטעמנים השונים בזמן הניתוח.‏ בריחה זו<br />

הוערכה בין<br />

64% ל-‏ ,86%<br />

ולפיה חושב הריכוז התוך תאי של הטעמנים לאחר<br />

90<br />

שניות שתייה.‏<br />

הריכוזים התוך תאיים אשר נמצאו בניסוי זה הרבה יותר נמוכים משל אלה אשר דווחו בניסויים שנערכו<br />

בפפילות מבודדות.‏ למשל,‏ ריכוזו התוך תאי של D-TRP הוערך כ-‏ 6.4 mM בניסוי ה-‏<br />

in-vivo במקום<br />

60-65 mM<br />

בפפילה מבודדת.‏ ריכוזו של כינין נמצא<br />

5.5 mM<br />

במקום<br />

20 mM<br />

0.96 mM cyclo(Leu-Trp)<br />

במקום<br />

.3.5 mM<br />

והפפטיד המר<br />

תוצאות אלו היו צפויות מאחר ובתנאי הניסוי<br />

הנוכחיים,‏ תאי הטעם אינם חשופים לתמיסת הטעמנים אלא מהצד האפיקלי בלבד,‏ דרך ה-‏<br />

אזור בעל שטח מצומצם מאוד.‏ מכל מקום,‏ ניסויי ה-‏<br />

,taste pore<br />

in-vivo<br />

הוכיחו כי טעמנים אמפיפטיים מסוגלים<br />

בתנאים פיזיולוגיים לחדור לתוך תאי פקיעית הטעם ואף להצטבר בהם כנגד מפל הריכוזים ‏(במקרה של<br />

כינין וקפאין).‏ מעבר לכך,‏ נראה שטעמנים חודרים לכל סוגי התאים ‏,סנסוריים או לא,‏ מאחר והם נמצאו<br />

גם בתאי האפיתל שמסביב לפפילת ה-‏<br />

.CV<br />

בנוסף,‏ יש להניח כי הטעמנים חודרים במידה שווה בכל<br />

התאים המרכיבים את פקיעית הטעם ולכן הריכוזים התוך תאיים שחושבו נחשבים לנכונים בכל סוגי<br />

התאים שבפקיעית הטעם,‏ וביניהם תאי הטעם עצמם<br />

.(taste receptor cells)<br />

65

4.2<br />

- איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

GRKs בתאי פפילת ה -<br />

CV בחולדה<br />

השערת העבודה הינה שמרגע הגעתם אל ציטוזול התאים,‏ הטעמנים האמפיפטיים משבשים את מהלך<br />

מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם,‏ ובכך גורמים למסלול העברת האותות להימשך זמן רב יותר.‏<br />

מכיוון שהקולטנים לטעם המר<br />

(T2Rs)<br />

והמתוק<br />

(T1Rs)<br />

משתייכים למשפחת ה-‏<br />

,GPCRs<br />

סביר להניח<br />

שמנגנון הדסנסיטיזציה שלהם יהיה דומה לזה של שאר הקולטנים ממשפחה זו,‏ כלומר באמצעות זרחון<br />

של הקצה ה-‏ C‏-טרמינלי ע"י לפחות אחת מהקינאזות ממשפחת ה-‏<br />

GRK5 זוהה באפיתל הלשון<br />

.GRKs<br />

.(136)<br />

,GRKs<br />

ידוע ממחקרים קודמים כי<br />

מכיוון שמטרתנו לחקור את השפעת הטעמנים על פעילותם של ה -<br />

נרצה קודם לאפיין אילו איזופורמים מהמשפחה הזו מתבטאים בתאי הטעם.‏<br />

ראשית,‏ נבדק ביטויים של<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,GRK1<br />

GRK6 ו-‏<br />

בפפילת ה-‏<br />

CV<br />

בשיטת ,GRK7 .RT-PCR<br />

לא נבדקו.‏ תוצאות ה-‏<br />

אשר אינו מתבטא בחולדה ו-‏<br />

,GRK4<br />

RT-PCR<br />

הראו שהקינאזות<br />

בפפילת ה-‏ ,CV אך גם באפיתל הלא סנסורי<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2<br />

מחולדה<br />

אשר מתבטא בעיקר במוח ואשכים,‏<br />

GRK6 ו-‏<br />

(EP)<br />

הסמוך לפפילת ה-‏ CV בלשון ‏(איור<br />

מתבטאות<br />

GRK1 .(3.2<br />

אשר מתבטא באופן ייחודי במערכת הראייה לא היה צפוי להתבטא בפפילת ה-‏ ,CV ואכן לא נמצא בה.‏<br />

על מנת לוודא כי פפילת ה-‏ CV אכן בודדה באופן נקי מרקמת האפיתל הלא סנסורי של הלשון,‏ נבדקו גם<br />

ביטויים של הקולטנים למר<br />

באפיתל הלא סנסורי.‏<br />

ארבעת הקינאזות,‏<br />

.(T1R3) ולמתוק (T2R4)<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2<br />

,GRK6 ו-‏<br />

הקולטנים נמצאו אכן רק ברקמת ה-‏ CV ולא<br />

מתבטאות בכלל אברי הגוף<br />

ולכן לא (48)<br />

מפתיע למצוא אותן גם ברקמה הסנסורית והלא סנסורית.‏ סביר גם להניח שלחלק מהן תפקיד שונה בשתי<br />

רקמות אלו.‏ מציאת הקולטנים למר ולמתוק יחד עם ארבעת ה-‏ GRKs בשיטת ה-‏ RT-PCR אינה עדות<br />

לכך שכל החלבונים האלו אכן מתבטאים יחד באותם התאים.‏ בניסוי מסוג זה ביטוים של החלבונים<br />

השונים נבדק בכלל התאים שבפפילת ה-‏ .CV ידוע כיום כי הקולטנים למר והקולטנים למתוק מתבטאים<br />

בתאי טעם שונים<br />

,(183 ,114 ,62)<br />

ובאותה מידה ייתכן וה-‏ GRKs השונים מתבטאים גם הם בסוגים<br />

שונים של תאים מתוך הפפילה ופקיעית הטעם.‏ בנוסף,‏ פפילת הטעם אינה מורכבת אך ורק מפקיעיות<br />

טעם:‏ תאי אפיתל לא סנסוריים מקיפים את פקיעיות הטעם ויוצרים את רקמת הפפילה.‏ חלק מהרנ"א אשר<br />

הופק לאחר ריסוק רקמת הפפילה מקורו מתאים אפיתליאלים לא סנסוריים אלו.‏ על מנת לוודא את<br />

מיקומם של ה-‏ GRKs השונים בתוך פפילת ה-‏ ,CV נעשתה צביעה אימונית של חתכי פפילת CV עם<br />

נוגדנים ייחודים אשר סונתזו כנגד כל אחד מן ה-‏<br />

.(3.3 ‏(איור GRKs<br />

מצביעה זו נראה ש-‏<br />

GRK5<br />

מתבטא בעיקר בתוך פקיעית הטעם.‏ לעומתו,‏ GRK2 נראה גם בפקיעיות הטעם וגם באפיתל הלא סנסורי<br />

המקיף אותן,‏ אך GRK6 נראה בעיקר מחוץ לפקיעיות הטעם.‏ תוצאות אלו ממקדות בעיקר את<br />

GRK5<br />

אך גם GRK2 כקינאזות פוטנציאליות המעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של תהליכים אשר קורים בתאי<br />

פקיעיות הטעם,‏ וביניהם תאי הטעם.‏ תוצאה זו מתנגשת קצת עם פרסומים אחרונים אשר דיווחו כי<br />

66

GRK2 בלבד נמצא בפקיעיות הטעם של פפילת ה-‏ CV בעכברים<br />

התוצאות נובע משונות בין בעלי חיים ‏(עכבר מול חולדה).‏<br />

,(103)<br />

אך ייתכן שמקור השוני בין<br />

נוגדן כנגד GRK3 לא גרם לצביעה הנראית לעין של חתכי פפילת ה-‏ .CV מכיוון שעל פי שיטת ה -<br />

GRK3 ,RT-PCR<br />

נמוכה במיוחד של<br />

מתבטא ברקמה זו,‏ ייתכן כי התוצאה השלילית בצביעה האימונית נובעת מרמת ביטוי<br />

,GRK3<br />

מתחת לסף רגישות השיטה.‏ על מנת לקבוע במדויק אלו<br />

יחד באותו תא עם קולטנים למר או למתוק,‏ יידרשו ניסויים נוספים כגון<br />

GRKs מתבטאים<br />

in-situ hybridization בהם<br />

נבדקת נוכחותם של רנ"א מגנים שונים בתאים.‏ ניסויים מסוג זה שימשו על מנת לקבוע שחלבונים כגון<br />

PLCβ2 ,gustducin או<br />

TRPM5 מתבטאים יחד עם קולטנים למר או למתוק<br />

.(183)<br />

נראה כי צביעה<br />

של רנ"א הינה יותר ספציפית ומאפשרת צביעה והבחנה של תאים בודדים מתוך מצבור התאים<br />

שבפקיעית הטעם.‏ לחילופין RT-PCR של תא בודד יכול לספק מידע על גנים המתבטאים בכל סוג תא<br />

בפקיעית הטעם.‏ למרות רגישותן הגבוהה של שתי שיטות אלו,‏ חסרון מסוים נעוץ בכך שהבדיקה נעשית<br />

ברמת הרנ"א וידוע מכמה מערכות שרנ"א אינו תמיד אומדן נאמן לרמת החלבון בתא.‏<br />

- 4.3<br />

טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

ה-‏ GPCRs על ידי עיכוב פעילותן של קינאזות ה-‏<br />

.GRKs<br />

לאחר שנמצא כי טעמנים אמפיפטיים יכולים לחדור בתנאים פיזיולוגיים לתוך תאי הטעם ושקיימות<br />

קינאזות ממשפחת ה-‏ GRKs באותם התאים,‏ מטרת חלק זה של העבודה הייתה לבחון האם ביכולתם של<br />

אותם הטעמנים האמפיפטיים לעכב את תהליך הדסנסיטיזציה של קולטנים ממשפחת ה-‏<br />

אינטראקציה עם מרכיבים ציטוזוליים כגון קינאזות ה-‏<br />

GPCRs<br />

.GRKs<br />

ע"י<br />

על מנת להוכיח טענה זו,‏ התעורר הצורך<br />

לעבוד במערכת מודל עם קולטן אחר מקולטני הטעם,‏ וזאת ממספר סיבות.‏ ראשית,‏ תהליך הדסנסיטיזציה<br />

של הקולטנים לטעם,‏ מר או מתוק,‏ לא נחקר עד כה.‏ בניגוד לרוב קולטני ה-‏<br />

,GPCRs<br />

זהותם ותפקודם<br />

של הקולטנים לטעם התבררו רק בשנים האחרונות ומנגנון הדסנסיטיזציה שלהם אינו ידוע עדיין.‏ שנית,‏<br />

ולמרות השיפורים הטכנולוגיים בשנים האחרונות,‏ לא נמצאה עד כה שיטה המאפשרת לגדל תאי טעם<br />

בתרבית מבלי לגרום עיוות לתאים או מוות לאחר זמן קצר<br />

.(126 ,85)<br />

מסיבה זו,‏ חקירת תפקודם של<br />

הקולטנים לטעם דורשת ביטוי מלאכותי שלהם בשורות תאים ‏(טרנספקציה).‏ אומנם ביטוי שכזה נעשה<br />

במספר רב של עבודות,‏ ע"י שימוש בתאים כגון תאי<br />

בעיקר לביטוי ציטוזולי של הקולטן<br />

מחסום משמעותי עבורנו.‏<br />

או HEK293 ,COS-7<br />

,(24 ,18)<br />

אך ידוע כי שיטה זו מביאה<br />

ומכאן לקולטן לא פונקציונלי לרוב,‏ דבר אשר מהווה<br />

ובכל זאת,‏ מכיוון שהקולטנים לטעם המר והמתוק משתייכים למשפחת ה-‏<br />

מנגנון הדסנסיטיזציה עבורם יהיה דומה לזה אשר תואר בסעיף<br />

מסוג<br />

,GPCRs<br />

,1.6<br />

GRK<br />

ולאחר מכן אינטרנליזציה.‏ מסיבות אלו,‏ נבחר הקולטן ה-‏<br />

סביר להניח כי<br />

זאת אומרת דרך זרחון ע"י קינאזה<br />

β2AR<br />

לשמש מודל במערכת<br />

שלנו.‏ β2AR הינו קולטן GPCR אשר מנגנון הדסנסיטיזציה שלו נחקר בהרחבה שנים רבות,‏ מרכיביו<br />

67

אופיינו והשפעותיו על תהליכים תוך תאיים אחרים הינם בעצמם מקור למחקרים רבים נוספים<br />

,99 ,48)<br />

.(175 ,174 ,155 ,153 ,100<br />

בנוסף,‏ ידוע כי קולטן זה מזורחן ע"י<br />

אשר זוהו בתוך תאי פקיעית הטעם של פפילת ה-‏ CV ‏(סעיף<br />

במערכת כזו רלוונטית גם למערכת חישת הטעם.‏<br />

GRK2 ו-‏<br />

,(4.2<br />

,GRK5 שתי הקינאזות<br />

ולכן השפעה אפשרית של הטעמנים<br />

על מנת להשתמש בקולטן ה-‏ β2AR ככלי במחקר זה,‏ היה צורך לבטא אותו בתאים הגדלים בתרבית.‏<br />

תאי ה-‏<br />

HeLa<br />

נבחרו למטרה זו ממספר סיבות:‏ ראשית אלה תאים ממקור אפיתליאלי,‏ בדומה לתאי<br />

הטעם בפקיעית הטעם.‏ בנוסף,‏ על מנת להוכיח השפעה אפשרית של הטעמנים האמפיפטיים על מרכיבים<br />

תוך תאיים,‏ ישנו צורך להשתמש בתאים שלתוכם טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הדומה לזו אשר<br />

נמצאה בתאי הטעם.‏ נמצא שאכן טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הרבה ביותר לתוך תאי ה-‏<br />

‏(בהשוואה לתאי<br />

HeLa<br />

COS7 ,HEK293<br />

או<br />

.(HCT/116<br />

בדומה למה שדווח בתאי טעם,‏ הטעמנים<br />

האמפיפטיים הצטברו גם כאן כנגד מפל הריכוזים.‏ למרות זאת,‏ התברר כי קצב החדירה של הטעמנים<br />

לתוך תאי HeLa הרבה יותר נמוך מזה שבתאי טעם.‏ 10 דקות חשיפה עם תאי ה-‏<br />

לקבל ריכוזים הדומים לאלו אשר נמצאו לאחר<br />

מבודדות<br />

HeLa נדרשו<br />

30<br />

.(132)<br />

כינין ידוע כחומר רעיל לתאים<br />

על מנת<br />

שניות חשיפה בלבד בתאי הטעם מפקיעיות טעם<br />

בנוסף תאי ה-‏ HeLa נמצאו הרבה יותר רגישים לתרכובת כינין מאשר תאי הטעם.‏<br />

.(184 ,120)<br />

אך בניגוד לתאי הטעם אשר יכלו להיחשף לריכוזים של<br />

1-<br />

2 mM ‏(טבלה ,3.1 ,((132)<br />

תאי ה-‏ HeLa לא שרדו ריכוזים העולים על 50. µM לכן ריכוזי הכינין<br />

בחלק זה של העבודה הינם בטווח של 10-50, µM וזמן החשיפה לתאים לפני גירוי הקולטן לא עלה על<br />

3 דקות ‏(טבלה 3.2).<br />

ריכוזי חמשת הטעמנים האחרים הינם ריכוזים המצויים במזון.‏<br />

על מנת לבחון את השפעת הטעמנים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏<br />

פעילותו של הקולטן לאחר גירוי עם ליגנד ספציפי בשם<br />

,β2AR<br />

,(ISO) isoproterenol<br />

נבחנה תחילה<br />

כאשר התאים נחשפו<br />

קודם לכן לטעמנים אמפיפטיים.‏ במידה ולטעמנים השפעה מעכבת על התקדמותו של תהליך<br />

הדסנסיטיזציה,‏ היינו מצפים לפעילות ארוכה יותר של הקולטן,‏ אשר תתורגם ברמות שליחים משניים<br />

גבוהות יותר לזמנים ארוכים יותר.‏ מידת הפעילות של הקולטן נבחנה כאן ע"י מדידת רמות השליח המשני<br />

cAMP<br />

אשר נוצר כתוצאה משפעול חלבון<br />

G s<br />

ואדניליל ציקלאז ע"י הקולטן ה-‏<br />

.β2AR<br />

ואכן נמצא<br />

שחשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים האמפיפטיים השונים גרמה לעלייה משמעותית ברמות ה-‏ cAMP<br />

שנוצרו בתגובה ל-‏ ISO והמשיכה גם 2 דקות לאחר גירוי הקולטן.‏ הגברה זו ברמות ה-‏<br />

תלויה בריכוז הטעמן ‏(איור<br />

cAMP הייתה<br />

.(3.4<br />

תוצאות אלו היוו אינדיקציה ראשונית לכך שטעמנים אמפיפטיים אכן<br />

גורמים לקולטן להיות ‏"פעיל יותר".‏<br />

מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים יכולים להשפיע על מערכות אשר אינן קשורות לטעם,‏ בין<br />

היתר ע"י קשירה לקולטנים שאינם קולטני טעם והפעלתם.‏ למשל,‏ הטעמן NHD נמצא מסוגל לפעול<br />

כליגנד לקולטן האדרנרגי מסוג<br />

כליגנדים לקולטן המלטונין<br />

לקולטן לסרוטונין<br />

,(α2AR) α2<br />

לעומת טעמנים כגון סכרין ו-‏<br />

D-TRP<br />

.(185) (MT1/2)<br />

.(166) 5-HT3<br />

אשר פועלים<br />

לעומת זאת,‏ הטעמן המר כינין נמצא פועל כאנטגוניסט<br />

לאור עובדות אלו,‏ נעשו מספר ניסויים על מנת להוכיח כי השינוי<br />

68

ברמות ה-‏ cAMP נבע מפעילות ציטוזולית של הטעמנים ולא בגלל קשירה חוץ תאית לקולטן ה-‏ β2AR<br />

באופן אשר יידמה ליגנד.‏ הניסויים הראו כי בהיעדר ,ISO אין לטעמנים עצמם כל השפעה על רמות ה-‏<br />

ISO לאחר גירוי הקולטן עם cAMP הבזליות בתא,‏ ויותר מכך,‏ שמידת השפעתם על רמות ה-‏ cAMP<br />

הינה תלויה בזמן החשיפה של התאים אליהם ‏(איור 3.5). תוצאות אלו מוכיחות כי הטעמנים אינם פועלים<br />

כליגנדים לקולטן ה-‏<br />

בתאי<br />

,β2AR<br />

HeLa<br />

וקשור לחלבוני<br />

G s או .G i<br />

,HeLa<br />

או לכל קולטן אחר ממשפחת ה-‏ GPCR אשר מתבטא בצורה אנדוגנית<br />

גם אם סביר להניח כי קולטני α2AR למשל יתבטאו בתאי<br />

נראה כי רמת הביטוי שלהם נמוכה מכדי שטעמנים כגון NHD ישפיעו במידה משמעותית על<br />

רמות ה-‏ .cAMP התלות באורך החשיפה של תאים לטעמנים מוכיחה כי חדירתם ונוכחותם של הטעמנים<br />

בתוך ציטוזול התא בריכוז גבוה מספיק הינם חיוניים על מנת שתתקבל הגברה בפעילות הקולטן,‏ כלומר<br />

שהשפעת הטעמנים הינה תוך תאית ולא רצפטורלית.‏<br />

בנוסף לקשירתם לקולטנים שונים,‏ ידוע כי תרכובות אמפיפטיות מסוגלות גם להשפיע על פעילותם של<br />

מרכיבים ציטוזולים כגון פוספודיאסטראזות ‏(קפאין<br />

חלבונים ממברנליים כגון תעלות ‏(נרינגין<br />

,((64)<br />

פקטורי שעתוק ‏(פלבונואידים<br />

,((108)<br />

,(156 ,6)<br />

כינין<br />

.((170 ,31)<br />

או<br />

לכן נדרשו צעדים נוספים על<br />

מנת להוכיח כי ההגברה שנראתה ברמות ה-‏ cAMP אכן נובעת מהשפעת הטעמנים על פעילות הקולטן<br />

ולא בדרך עקיפה על מרכיבים ציטוזולים אשר עיכובם יגרום גם הוא לעלייה ברמת ה-‏ cAMP בתא.‏ שני<br />

שחקנים אשר יכלו להשפיע על רמות שליחים משניים היו ,PDE אשר אחראי על פירוק שליחים משניים<br />

ו-‏ PKA אשר מעורב בדסנסיטיזציה ההטרולוגית של הקולטן ה-‏ .β2AR ואכן,‏ נוכחותם של מעכב PDE<br />

בשם IBMX או מעכב PKA בשם H89 במערכת גרמו,‏ לאחר גירוי הקולטן,‏<br />

לרמות cAMP<br />

גבוהות פי<br />

10-15 מאשר בתנאים זהים בהיעדרם.‏ אך התוצאות הראו כי ההגברה ברמות ה-‏ cAMP לאחר חשיפת<br />

התאים לטעמנים קרתה גם בנוכחות IBMX או<br />

,H89<br />

ובמידה דומה לזו שבהיעדר המעכבים ‏(איור<br />

,(3.6<br />

ומהוות הוכחה לכך שההשפעה של הטעמנים על רמות ה-‏ cAMP לא נבעה מהשפעה כלשהי על PDE או<br />

,PKA<br />

בהתאמה.‏<br />

הטעמן היחיד אשר התנהג שונה היה קפאין.‏ קפאין הינו תרכובת הידועה כמשפיעה על פעילותם של מגוון<br />

רחב ביותר של אנזימים,‏ תעלות וקולטנים.‏ קפאין פועל כאנטגוניסט ל-‏<br />

,78) adenosine receptor<br />

,(138<br />

גורם לשחרור סידן תוך תאי<br />

,(177)<br />

מעכב תעלות אשלגן<br />

מעכב (55),<br />

(139) ATM ו-‏ PKC<br />

והרשימה עוד ארוכה.‏ אך אחת מההשפעות הידועות ביותר של קפאין ‏(כמו של המטבוליט שלו תאופילין)‏<br />

הינה עיכוב .PDE זו הסיבה לכך שבנוכחותו,‏ רמות ה-‏ cAMP לאחר גירוי הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO<br />

גבוהות בהרבה ‏(בערך פי<br />

(5<br />

ושהירידה ברמות ה-‏ cAMP אשר נראית במצב רגיל לאחר 30 שניות אינה<br />

מתקיימת.‏ לכן,‏ במטרה לבחון את השפעת קפאין על פעילות הקולטן בלבד,‏ הוסף למערכת הניסוי<br />

.IBMX<br />

ואכן נמצא כי השפעתו של קפאין על רמות ה-‏<br />

cAMP<br />

β2AR<br />

להגברת רמות<br />

אינה תלויה ב-‏<br />

.PDE<br />

cAMP פי ,5<br />

שנוצרו בעקבות גירוי הקולטן ה-‏<br />

למרות זאת,‏ ניתן לראות כי אם קפאין לבד גורם לאחר גירוי הקולטן<br />

השפעתו על פעילות הקולטן עצמו ‏(ז"א<br />

בנוכחות (IBMX<br />

יורדת לפי<br />

1.5-<br />

2 בלבד<br />

‏,בדומה לשאר הטעמנים שנבדקו.‏<br />

69

בכדי לבחון אם השפעתם של הטעמנים על רמות<br />

cAMP<br />

נובעת מעיכוב מנגנון הדסנסיטיזציה<br />

ההומולוגית של הקולטן,‏ נבחנה מידת הזרחון של הקולטן לאחר גירוי בנוכחות הטעמנים.‏<br />

לשם כך,‏ השתמשנו בנוגדן אשר פותח בשנים האחרונות ומזהה אתרי סרינים המזורחנים ספציפית ע"י<br />

GRK2/5<br />

לאחר גירוי הקולטן,‏ והן העמדות<br />

Ser355 ו-‏ Ser356<br />

.(153)<br />

נוגדן זה שימש במספר מחקרים והוכח כספציפי<br />

.(168) GRK2 ו-‏<br />

HeLa<br />

בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי של הקולטן<br />

GRK5 מתבטאים בצורה<br />

אנדוגנית בתאי ולכן לא נדרשה טרנספקציה נוספת להפעלת מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן<br />

בתאים אלו.‏ מן התוצאות ניתן לראות כי זרחון הקולטן אכן הושפע מנוכחות טעמנים אך באופן לא צפוי.‏<br />

בנוסף לירידה ברמת הזרחון של הקולטן,‏ התקבלה דחייה בזמן הופעתו:‏ אם במצב רגיל ‏(ביקורת)‏ הקולטן<br />

נמצא מזורחן בעיקר<br />

‏(איור<br />

של<br />

5-10 דק'‏<br />

לאחר הגירוי,‏ בנוכחות הטעמנים זרחון זה הופיע רק לאחר<br />

10-20 דק'‏<br />

.(3.7<br />

תופעה זו איננה שגרתית במובן זה שעיכוב של אנזים מתורגם בירידה בפעילותו ואילו<br />

במקרה שלנו,‏ פעילותם של ה-‏ GRK2/5 נראית כמושהית ל-‏<br />

5-10 דק'‏<br />

in-vitro kinase assay<br />

הראו כי עיכוב פעילותם של<br />

מתחרות על אתר הקשירה לסובסטרט או על אתר הקשירה ל-‏<br />

GRK2 ו-‏<br />

,(186) ATP<br />

ומתחדשת לאחר מכן.‏ ניסויים<br />

GRK5 ע"י הטעמנים אינו נובע<br />

ומנגנון העיכוב לא פוענח<br />

עד כה.‏ אבל הסבר אפשרי לדחייה בזמן הופעת הזרחון של הקולטן יכול להיות בכך שלאחר הצטברותם<br />

לתוך ציטוזול התאים,‏ הטעמנים ‏"נעלמים"‏ בדרך כלשהי.‏ פירוק אנזימטי לא נראה סביר ולא ידוע על<br />

פעילות<br />

.HeLa בתאי cytochrome P450<br />

המצטברות בציטוזול התא הינו שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה-‏<br />

לעומת זאת,‏ מנגנון ידוע אשר מוציא החוצה תרכובות ‏"זרות"‏<br />

(multi-drug resistance mdr<br />

.transporters)<br />

משפחה זו של טרנספורטרים,‏ הקיימת בתאים אאוקריוטים<br />

(130)<br />

,(76)<br />

כמו פרוקריוטים<br />

אחראית על הוצאת תרופות או חומרים רעילים מתוך התאים ומונעת בדרך זו את מותם.‏<br />

טרנספורטרים אלו פעילים במיוחד בתאי סרטן ‏(וגורמים כך לעמידות לתרופות אנטי-סרטניות<br />

ומתבטאים גם בתאי<br />

,((125)<br />

.(165) HeLa<br />

ניתן לחשוב כי בזמן גירוי הקולטן ‏(אשר ארך עד<br />

המשיכו להצטבר בתוך ציטוזול התא מעבר לריכוזים אשר דווחו בטבלה<br />

גבוהים הפעילו את הטרנספורטרים מסוג<br />

20 דק'),‏<br />

.3.2<br />

mdr<br />

הטעמנים<br />

ייתכן כי ריכוזים כה<br />

ובכך גרמו להוצאתם של הטעמנים מהציטוזול.‏ תוצאה<br />

ישירה תהיה ירידה מתמדת בריכוז הטעמנים בציטוזול.‏ מרגע זה,‏ העיכוב שהפעילו הטעמנים על ה-‏<br />

GRKs נעלם ולכן הקינאזות מסוגלות לפעול מחדש ולזרחן ‏"באיחור"‏ את הקולטן.‏<br />

אם אכן הטעמנים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י<br />

,GRK2/5<br />

ישנה סבירות גבוהה כי תהליכים אשר<br />

תלויים בזרחון זה יימצאו גם הם מעוכבים,‏ וביניהם קשירה של מולקולת β-arrestin לקולטן המזורחן.‏<br />

כתוצאה מקשירה זו מופעלים מספר תהליכים:‏ הראשון הינו אינטרנליזציה של הקולטן לתוך ציטוזול התא<br />

והשני שפעול מסלולי העברת אותות חדשים.‏ לכן השפעת הטעמנים על שני תהליכים אלה נבחנה בהמשך.‏<br />

מידת האינטרנליזציה של הקולטן ה - β2AR לאחר גירוי עם ,ISO בהיעדר או נוכחות טעמנים,‏ נבחנה<br />

קודם כל במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.‏ התוצאות הראו כי בעקבות פראינקובציה של התאים עם<br />

הטעמנים וגירוי הקולטן ה-‏ β2AR<br />

ב-‏ ISO<br />

.(3.8<br />

תוצאות אלו ביחד עם תוצאות השהייה בהופעת הזרחון ‏(איור<br />

חלה עלייה באחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי ‏(איור<br />

(3.7<br />

מתארות יפה את התהליך אשר<br />

70

עובר הקולטן:‏ בהיעדר טעמן,‏ הקולטן מזורחן כבר לאחר 5 דק'‏ של גירוי ובמקביל ניתן לראות את תחילת<br />

האינטרנליזציה שלו לתוך הציטוזול.‏ אחרי<br />

15 דק',‏<br />

רוב התאים מכילים קולטן ציטוזולי.‏ בתוך הציטוזול,‏<br />

הקולטן עובר תהליך של דה-פוספורילציה ‏(הורדת זרחנים ע"י פוספטאזות),‏ אשר מתבטא בירידה<br />

בעוצמת הפסים המתקבלים עם הנוגדן ה-‏ .anti-phosphoSer(355-356) β2AR לעומת זאת בנוכחות<br />

הטעמנים,‏ הקולטן אינו מזורחן באופן בולט גם לאחר<br />

10 דק'‏<br />

עדיין מכילים קולטן ממברנלי בזמן זה.‏ הזרחון מופיע בעיקר לאחר<br />

גירוי,‏ דבר המתבטא בכך שרוב התאים<br />

15 דק'‏<br />

גירוי וכך גם מתחיל להופיע<br />

אחוז גבוה יותר של אינטרנליזציה.‏ השפעת הטעמנים על קצב האינטרנליזציה של הקולטן נמצאה גם כן<br />

תלוית-ריכוז ‏(איור<br />

.(3.9<br />

מכיוון שהסתכלות על תאים דרך מיקרוסקופ אינה מאפשרת להעריך את כמות<br />

הקולטן אשר נמצא עדיין על ממברנת התא,‏ נעשתה פרקציונציה של התא ונבדקה נוכחות הקולטן<br />

בממברנה הפלסמטית ובתוכן הציטוזולי והוכיחה שוב כי חלה ירידה בקצב תהליך האינטרליזציה בנוכחות<br />

הטעמנים<br />

‏(איור 3.10).<br />

התהליך השני אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י<br />

GRKs וקשירת<br />

.(92) MAPK<br />

β-arrestin לקולטן הינו שפעול מסלול ה -<br />

מסלול זה מאופיין בקיום תגובת שרשרת בה קינאזה אחת מזרחנת את השנייה ובכך<br />

משפעלת אותה.‏ התגלו מספר רב של מסלולי<br />

מביניהם הינם<br />

ה-‏<br />

MAPK<br />

.ERK1/2 ו-‏ JNK ,p38<br />

:ERK<br />

הדרך הראשונה תלויה בזרחון הקולטן ע"י<br />

אשר מפעילים אפקטורים שונים,‏ הידועים<br />

ישנן שתי דרכים דרכן הקולטן ה-‏ β2AR משפעל את מסלול<br />

PKA<br />

‏(קורה בטווח של<br />

הקולטן)‏ והשנייה תלויה ביצירת הקומפלקס קולטן/‏β-arrestin ‏(קורה בטווח של<br />

2-5<br />

5-45 דק'‏<br />

.(155)<br />

דק'‏ אחרי גירוי<br />

לאחר גירוי<br />

הקולטן)‏ לכן בשלב הבא,‏ נבחנה השפעתם של הטעמנים על שפעול .ERK ראשית,‏ ללא גירוי<br />

הקולטן,‏ לא הייתה לטעמנים כל השפעה על רמת הזרחון הבזלית של דבר אשר מעיד על כך<br />

שלטעמנים אין כל השפעה על קולטנים מסוג ה-‏<br />

,ERK<br />

tyrosine kinase receptor<br />

כגון קולטן ה-‏<br />

EGF<br />

,(EGFR)<br />

אך גם לא על מרכיבים ציטוזולים אשר יכולים לשפעל את מסלול ה-‏ ,MAPK<br />

נראה שלטעמנים השפעה מעכבת על שפעול ERK רק בטווח של<br />

כגון .PKC<br />

10-30 דק'.‏<br />

ERK<br />

מעכבת על<br />

בזמנים של<br />

2-5<br />

,PKA<br />

לעומת זאת שפעול ה-‏<br />

דקות לא נראה מושפע כלל.‏ תוצאה זו מעידה על כך שלטעמנים אין השפעה<br />

דבר אשר תומך בתוצאות שהתקבלו בניסויי מדידות ה-‏<br />

הגבירו את רמות השליח המשני גם בנוכחות<br />

cAMP<br />

‏(איור H89<br />

הטעמנים עיכבו את המסלול אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה-‏<br />

.(3.6<br />

כאשר הטעמנים<br />

לעומת זאת,‏ ובהתאם לציפיותינו,‏<br />

GRKs<br />

וקשירת<br />

β-arrestin<br />

לקולטן<br />

המזורחן.‏ קפאין היה שוב במקרה זה הטעמן היחיד אשר התנהג אחרת מכל האחרים.‏ קפאין לא רק עיכב<br />

את שפעול ה-‏<br />

ERK<br />

התלוי ב-‏<br />

β-arrestin<br />

אלא גם את השפעול התלוי ב-‏<br />

.PKA<br />

קיימים בספרות<br />

דיווחים רבים על השפעת קפאין על מסלולים התלויים ב-‏ ,PKA אך עובדה מפתיעה ביותר הינה כי על<br />

פי סוג התאים או סוג המערכת נמצאו לקפאין השפעות הפוכות.‏ מספר מאמרים דיווחו על שפעול PKA<br />

ע"י קפאין<br />

,(63 ,3)<br />

לעומת מחקרים אחרים אשר דיווחו על השפעה מעכבת על<br />

.(186 ,148) PKA<br />

מתוצאות המחקר הנוכחי,‏ נראה כי קפאין פעל כמעכב .PKA זו יכולה גם להיות הסיבה לכך שקפאין הינו<br />

הטעמן היחיד מבין השישה אשר גרם לירידה ברמת הזרחון הבזלית של .ERK<br />

71

לסיכום תוצאות הניסויים בחלק זה מצביעות על כך שכתוצאה מחדירתם לתוך ציטוזול התאים,‏ הטעמנים<br />

האמפיפטיים גורמים לקולטן ה-‏ β2AR להיות פעיל לתקופה ארוכה יותר ע"י עיכוב קינאזות ה-‏<br />

האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה ההומולוגית שלו.‏<br />

GRKs<br />

הטעמנים מצטיירים כמעכבים פחות ספציפיים ורגישים ממעכבים הידועים עבור קינאזות אחרות<br />

ממשפחת ה-‏<br />

(PKA עבור H89 ‏(כגון serine/threonine kinases<br />

ואף קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

tyrosine<br />

.(bcr/abl עבור imatinib ‏(כמו kinases<br />

ריכוזי הטעמנים אשר נדרשו על מנת לקבל השפעה היו ברמות<br />

המילימולרים,‏ לעומת רמות של µM הדרושות עבור רוב המעכבים המשווקים מסחרית.‏ מצד שני,‏ לא<br />

נמצאו עד כה מעכבים ספציפים ל-‏<br />

GRKs<br />

וחקר פעילותה הייחודית של כל אחת מן הקינאזות הללו<br />

נעשה עד היום ע"י פגיעה בביטוי הקינאזה,‏ למשל ע"י שימוש ב-‏ .siRNA בנוסף,‏ בהשוואה למעכבים<br />

אחרים הדורשים זמן חשיפה ממוצע לתאים של<br />

20 עד 45 דקות<br />

‏(אך יכול להגיע גם לשעות),‏ הטעמנים<br />

האמפיפטיים חודרים במהירות לתוך ציטוזול התאים ומגיעים לריכוזים אפקטיביים תוך זמן קצר יחסית<br />

(10 דקות בלבד).‏<br />

מכיוון ש-‏<br />

GRK2 ו-‏<br />

ה-‏ ,β2AR<br />

להשפיע בתנאי<br />

GRK5 הינן שתי הקינאזות האחראיות על הדסנסיטיזציה ההומולוגית של הקולטן<br />

התוצאות שתוארו כאן מתייחסות לשתי הקינאזות האלו בלבד.‏ בחינת יכולתם של הטעמנים<br />

in-vivo<br />

על קינאזות אחרות מתוך המשפחה תדרוש שימוש במודלים אחרים.‏ בנוסף,‏<br />

תוצאות המחקר אינן מאפשרות לדעת אם הטעמנים השפיעו במידה שונה על כל אחת משתי הקינאזות.‏<br />

ולמרות זאת,‏ שתי הקינאזות GRK2 ו-‏ GRK5 מעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של המגוון הרחב ביותר<br />

של קולטנים ולכן,‏ על אף שהקולטן ה-‏ β2AR שימש במחקר זה מודל בלבד לקולטני הטעם,‏ תוצאות<br />

המחקר הן בעלות משמעות רחבה יותר.‏<br />

רשימה ארוכה של קולטנים אשר משתייכים למשפחת ה-‏ GPCR התגלו בתאי פקיעית הטעם:‏ בין היתר<br />

הקולטנים לנוירוטרנסמיטורים סרוטונין<br />

,(67) (5-HT)<br />

אצטילכולין<br />

,(122) (mAChR1)<br />

(mGluR4)<br />

ו-‏<br />

(25) בעלי חשיבות רבה בתקשורת בין תאית.‏ הקולטן לכולציסטוכינין<br />

וגלוטמאט<br />

(61) (CCK-A)<br />

,β<br />

מתבטא אף הוא בתאי פקיעית הטעם ומשחק כנראה תפקיד בתחושת השובע.‏ מספר קולטנים אדרנרגים α<br />

וביניהם הקולטן ה-‏ β2AR<br />

,(60)<br />

מתבטאים גם בתאי פקיעית הטעם,‏ ותפקידם שם עדיין מעורפל.‏<br />

כל הקולטנים הללו משתייכים למשפחת ה-‏ GPCRs וברובם התגלה כי<br />

בתהליך הדסנסיטיזציה שלהם<br />

GRK2 ו/או GRK5 מעורבים<br />

.(54 ,50 ,33)<br />

לכן ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע<br />

על תיפקודם של כל אחד מהקולטנים הללו במידה ותהיה להם גישה לציטוזול התאים בהם הם מתבטאים.‏<br />

רבים מן הקולטנים אשר הוזכרו כאן מתבטאים לא רק בתאי הטעם<br />

,(type II)<br />

אלא גם בתאים מסוג<br />

III<br />

,(type III)<br />

אשר אחראים על פי מחקרים אחרונים על שחרור נוירוטרנסמיטור ותקשורת עם תאי העצב.‏<br />

הטעמנים האמפיפטיים צפויים לחדור לתוך כל סוגי התאים שבתוך פקיעית הטעם באותה מידה,‏ ולכן גם<br />

לתוך תאים אשר מבטאים את הקולטנים הללו.‏ על פי תוצאות המחקר הנוכחי,‏ ייתכן והטעמנים<br />

האמפיפטיים משפיעים על תחושת הטעם לא רק ע"י שיבוש מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם<br />

72

עצמם אלא גם בדרך עקיפה ע"י השפעה על תפקודם של קולטני GPCRs אחרים האחראים על תהליכים<br />

פיזיולוגים מגוונים כגון העברת המידע מתא הטעם הלאה.‏<br />

על פי אותו היגיון,‏ ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע על כל תהליך פיזיולוגי התלוי<br />

בקולטני GPCRs במידה ובאפשרותם לחדור לתוך ציטוזול התאים המבטאים אותם.‏ ידוע כי תרכובות<br />

אמפיפטיות רבות,‏ כגון סכרין,‏ נרינגין או קפאין,‏ אינן מפונות מהגוף ביעילות לאחר צריכתן,‏ וניתן למצוא<br />

אותן בריכוזים שונים בין היתר במערכת העיכול,‏ במערכת השתן ואף בדם.‏ סכרין למשל נספג תוך<br />

דקות בתוך המעי (105) וניתן למצוא אותו כמעט בכל איבר בגוף שעה לאחר הצריכה<br />

הוא מגיע לדם ע"י ספיגה מהירה מאוד דרך המעי<br />

15<br />

.(93)<br />

,(83)<br />

ומכאן מגיע לכל אברי הגוף<br />

.(11)<br />

קפאין גם<br />

לכן ייתכן כי<br />

לטעמנים האלה גישה לתאים מאיברים שונים בגוף.‏ בגלל אופיים האמפיפטי,‏ ישנה סבירות לפיה<br />

הטעמנים האלו חודרים לתוך ציטוזול התאים של איברים שונים,‏ שם הם יכולים להשפיע על מערכות<br />

אשר אינן קשורות כלל למערכת חישת הטעם.‏ אחד האיברים אשר יכול להיות מושפע יותר מאחרים הינו<br />

המעי,‏ אשר אחראי על ספיגת תרכובות מהמזון.‏ מעניין לציין כי מחקרים הראו לאחרונה שהקולטנים<br />

לטעם המתוק וחלבון ה-‏<br />

ספיגת הסוכרים ותחושת השובע<br />

gustducin G<br />

.(102 ,72)<br />

מתבטאים בתאי המעי ונראה שהם מווסתים שם את תהליך<br />

בקרה לא נכונה של תהליכים אלו ידועה במחלות כגון<br />

סכרת והשמנת יתר.‏ ייתכן כי הטעמנים,‏ בתוך ציטוזול תאי המעי,‏ יכולים להשפיע על התהליכים להם<br />

קולטני הטעם אחראים בתאים אלו,‏ ובכך להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים כגון רמות סוכר בדם,‏<br />

התכווצויות המעי ותחושת השובע.‏<br />

73

רשימת ספרות<br />

1. Abaffy T, Trubey KR, and Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and<br />

modulation of cAMP in rat taste cells. Am J Physiol Cell Physiol 284: C1420-1428,<br />

2003.<br />

2. Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJP, and Zuker<br />

CS. A novel family of mammalian taste receptors. Cell 100: 693-702, 2000.<br />

3. Al-Wadei HA, Takahashi T, and Schuller HM. Caffeine stimulates the<br />

proliferation of human lung adenocarcinoma cells and small airway epithelial cells via<br />

activation of PKA, CREB and ERK1/2. Oncol Rep 15: 431-435, 2006.<br />

4. Avenet P, Hofmann F, and Lindemann B. Signalling in taste receptor cells:<br />

cAMP-dependent protein kinase causes depolarization by closure of 44 pS K-<br />

channels. Comp Biochem Physiol A 90: 681-685, 1988.<br />

5. Bachmanov AA, Li X, Reed DR, Ohmen JD, Li S, Chen Z, Tordoff MG,<br />

de Jong PJ, Wu C, West DB, Chatterjee A, Ross DA, and Beauchamp GK.<br />

Positional cloning of the mouse saccharin preference (Sac) locus. Chem Senses 26:<br />

925-933, 2001.<br />

6. Bailey DG, Dresser GK, Leake BF, and Kim RB. Naringin is a major and<br />

selective clinical inhibitor of organic anion-transporting polypeptide 1A2 (OATP1A2)<br />

in grapefruit juice. Clin Pharmacol Ther 81: 495-502, 2007.<br />

7. Barone JJ, and Roberts HR. Caffeine consumption. Food Chem Toxicol 34:<br />

119-129, 1996.<br />

8. Behrens M, Brockhoff A, Kuhn C, Bufe B, Winnig M, and Meyerhof W.<br />

The human taste receptor hTAS2R14 responds to a variety of different bitter<br />

compounds. Biochem Biophys Res Commun 319: 479-485, 2004.<br />

9. Bernhardt SJ, Naim M, Zehavi U, and Lindemann B. Changes in IP3 and<br />

cytosolic Ca2+ in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of<br />

sweet taste in the rat. J Physiol 490 (Pt 2): 325-336, 1996.<br />

10. Bezencon C, le Coutre J, and Damak S. Taste-signaling proteins are<br />

coexpressed in solitary intestinal epithelial cells. Chem Senses 32: 41-49, 2007.<br />

11. Biaggioni I, Paul S, and Robertson D. A simple liquid-chromatographic<br />

method applied to determine caffeine in plasma and tissues. Clin Chem 34: 2345-<br />

2348, 1988.<br />

12. Bo X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, and Burnstock G. Localization<br />

of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds.<br />

Neuroreport 10: 1107-1111, 1999.<br />

13. Boguski MS, and McCormick F. Proteins regulating Ras and its relatives.<br />

Nature 366: 643-654, 1993.<br />

14. Bohn LM, Gainetdinov RR, Sotnikova TD, Medvedev IO, Lefkowitz RJ,<br />

Dykstra LA, and Caron MG. Enhanced rewarding properties of morphine, but not<br />

cocaine, in beta(arrestin)-2 knock-out mice. J Neurosci 23: 10265-10273, 2003.<br />

15. Bohn LM, Lefkowitz RJ, Gainetdinov RR, Peppel K, Caron MG, and Lin<br />

FT. Enhanced morphine analgesia in mice lacking beta-arrestin 2. Science 286: 2495-<br />

2498, 1999.<br />

16. Boughter JD, Jr., Pumplin DW, Yu C, Christy RC, and Smith DV.<br />

Differential expression of alpha-gustducin in taste bud populations of the rat and<br />

hamster. J Neurosci 17: 2852-2858, 1997.<br />

74

17. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of<br />

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal<br />

Biochem 72: 248-254, 1976.<br />

18. Bufe B, Hofmann T, Krautwurst D, Raguse JD, and Meyerhof W. The<br />

human TAS2R16 receptor mediates bitter taste in response to beta-glucopyranosides.<br />

Nat Genet 32: 397-401, 2002.<br />

19. Caicedo A, Kim KN, and Roper SD. Individual mouse taste cells respond to<br />

multiple chemical stimuli. J Physiol 544: 501-509, 2002.<br />

20. Caicedo A, Pereira E, Margolskee RF, and Roper SD. Role of the G-<br />

protein subunit alpha-gustducin in taste cell responses to bitter stimuli. J Neurosci 23:<br />

9947-9952, 2003.<br />

21. Caicedo A, and Roper SD. Taste receptor cells that discriminate between<br />

bitter stimuli. Science 291: 1557-1560, 2001.<br />

22. Castaing M, Brouant P, Loiseau A, Santelli-Rouvier C, Santelli M,<br />

Alibert-Franco S, Mahamoud A, and Barbe J. Membrane permeation by<br />

multidrug-resistance-modulators and non-modulators: effects of hydrophobicity and<br />

electric charge. J Pharm Pharmacol 52: 289-296, 2000.<br />

23. Chandrashekar J, Hoon MA, Ryba NJP, and Zuker CS. The receptors and<br />

cells for mammalian taste. Nature 444: 288-294, 2006.<br />

24. Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA, Adler E, Feng L, Guo W,<br />

Zuker CS, and Ryba NJP. T2Rs function as bitter taste receptors. Cell 100: 703-<br />

711, 2000.<br />

25. Chaudhari N, Landin AM, and Roper SD. A metabotropic glutamate<br />

receptor variant functions as a taste receptor. Nat Neurosci 3: 113-119, 2000.<br />

26. Cho EY, Cho DI, Park JH, Kurose H, Caron MG, and Kim KM. Roles of<br />

protein kinase C and actin-binding protein 280 in the regulation of intracellular<br />

trafficking of dopamine D3 receptor. Mol Endocrinol 21: 2242-2254, 2007.<br />

27. Chou KH, and Bell LN. Caffeine content of prepackaged national-brand and<br />

private-label carbonated beverages. J Food Sci 72: C337-342, 2007.<br />

28. Clapp TR, Medler KF, Damak S, Margolskee RF, and Kinnamon SC.<br />

Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium<br />

channels and SNAP-25. BMC Biol 4: 7, 2006.<br />

29. Cong M, Perry SJ, Lin FT, Fraser ID, Hu LA, Chen W, Pitcher JA, Scott<br />

JD, and Lefkowitz RJ. Regulation of membrane targeting of the G protein-coupled<br />

receptor kinase 2 by protein kinase A and its anchoring protein AKAP79. J Biol Chem<br />

276: 15192-15199, 2001.<br />

30. Conn PJ, and Pin JP. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate<br />

receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 37: 205-237, 1997.<br />

31. Cummings TA, and Kinnamon SC. Apical K+ channels in Necturus taste<br />

cells. Modulation by intracellular factors and taste stimuli. J Gen Physiol 99: 591-613,<br />

1992.<br />

32. Daaka Y, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Switching of the coupling of the<br />

beta2-adrenergic receptor to different G proteins by protein kinase A. Nature 390: 88-<br />

91, 1997.<br />

33. Dale LB, Bhattacharya M, Anborgh PH, Murdoch B, Bhatia M,<br />

Nakanishi S, and Ferguson SS. G protein-coupled receptor kinase-mediated<br />

desensitization of metabotropic glutamate receptor 1A protects against cell death. J<br />

Biol Chem 275: 38213-38220, 2000.<br />

34. Damak S, Rong M, Yasumatsu K, Kokrashvili Z, Perez CA, Shigemura<br />

N, Yoshida R, Mosinger B, Jr., Glendinning JI, Ninomiya Y, and Margolskee<br />

75

RF. Trpm5 null mice respond to bitter, sweet, and umami compounds. Chem Senses<br />

31: 253-264, 2006.<br />

35. Day PW, Carman CV, Sterne-Marr R, Benovic JL, and Wedegaertner<br />

PB. Differential interaction of GRK2 with members of the G alpha q family.<br />

Biochemistry 42: 9176-9184, 2003.<br />

36. DeFazio RA, Dvoryanchikov G, Maruyama Y, Kim JW, Pereira E, Roper<br />

SD, and Chaudhari N. Separate populations of receptor cells and presynaptic cells in<br />

mouse taste buds. J Neurosci 26: 3971-3980, 2006.<br />

37. DerMardirossian C, Rocklin G, Seo JY, and Bokoch GM. Phosphorylation<br />

of RhoGDI by Src regulates Rho GTPase binding and cytosol-membrane cycling. Mol<br />

Biol Cell 17: 4760-4768, 2006.<br />

38. Deshpande DA, Pascual RM, Wang SW, Eckman DM, Riemer EC, Funk<br />

CD, and Penn RB. PKC-dependent regulation of the receptor locus dominates<br />

functional consequences of cysteinyl leukotriene type 1 receptor activation. Faseb J<br />

21: 2335-2342, 2007.<br />

39. DeSimone JA, Callaham EM, and Heck GL. Chorda tympani taste response<br />

of rat to hydrochloric acid subject to voltage-clamped lingual receptive field. Am J<br />

Physiol 268: C1295-1300, 1995.<br />

40. DeSimone JA, Heck GL, and DeSimone SK. Active ion transport in dog<br />

tongue: a possible role in taste. Science 214: 1039-1041, 1981.<br />

41. Doolin RE, and Gilbertson TA. Distribution and characterization of<br />

functional amiloride-sensitive sodium channels in rat tongue. J Gen Physiol 107: 545-<br />

554, 1996.<br />

42. Dulac C. The physiology of taste, vintage 2000. Cell 100: 607-610, 2000.<br />

43. Elorza A, Sarnago S, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent modulation of G<br />

protein-coupled receptor kinase 2 by mitogen-activated protein kinases. Mol<br />

Pharmacol 57: 778-783, 2000.<br />

44. Fan G, Shumay E, Malbon CC, and Wang H. c-Src tyrosine kinase binds<br />

the beta 2-adrenergic receptor via phospho-Tyr-350, phosphorylates G-protein-linked<br />

receptor kinase 2, and mediates agonist-induced receptor desensitization. J Biol Chem<br />

276: 13240-13247, 2001.<br />

45. Finger TE, Danilova V, Barrows J, Bartel DL, Vigers AJ, Stone L,<br />

Hellekant G, and Kinnamon SC. ATP signaling is crucial for communication from<br />

taste buds to gustatory nerves. Science 310: 1495-1499, 2005.<br />

46. Gainetdinov RR, Bohn LM, Sotnikova TD, Cyr M, Laakso A, Macrae<br />

AD, Torres GE, Kim KM, Lefkowitz RJ, Caron MG, and Premont RT.<br />

Dopaminergic supersensitivity in G protein-coupled receptor kinase 6-deficient mice.<br />

Neuron 38: 291-303, 2003.<br />

47. Gainetdinov RR, Bohn LM, Walker JK, Laporte SA, Macrae AD, Caron<br />

MG, Lefkowitz RJ, and Premont RT. Muscarinic supersensitivity and impaired<br />

receptor desensitization in G protein-coupled receptor kinase 5-deficient mice.<br />

Neuron 24: 1029-1036, 1999.<br />

48. Gainetdinov RR, Premont RT, Bohn LM, Lefkowitz RJ, and Caron MG.<br />

Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions. Annu Rev<br />

Neurosci 27: 107-144, 2004.<br />

49. Galindo-Cuspinera V, Winnig M, Bufe B, Meyerhof W, and Breslin PA.<br />

A TAS1R receptor-based explanation of sweet 'water-taste'. Nature 441: 354-357,<br />

2006.<br />

76

50. Gates LK, Ulrich CD, and Miller LJ. Multiple kinases phosphorylate the<br />

pancreatic cholecystokinin receptor in an agonist-dependent manner. Am J Physiol<br />

264: G840-847, 1993.<br />

51. Gilbertson TA. The physiology of vertebrate taste reception. Curr Opin<br />

Neurobiol 3: 532-539, 1993.<br />

52. Gilbertson TA, Boughter JD, Jr., Zhang H, and Smith DV. Distribution of<br />

gustatory sensitivities in rat taste cells: whole-cell responses to apical chemical<br />

stimulation. J Neurosci 21: 4931-4941, 2001.<br />

53. Gilbertson TA, Fontenot DT, Liu L, Zhang H, and Monroe WT. Fatty acid<br />

modulation of K+ channels in taste receptor cells: gustatory cues for dietary fat. Am J<br />

Physiol 272: C1203-1210, 1997.<br />

54. Gray JA, Sheffler DJ, Bhatnagar A, Woods JA, Hufeisen SJ, Benovic JL,<br />

and Roth BL. Cell-type specific effects of endocytosis inhibitors on 5-<br />

hydroxytryptamine(2A) receptor desensitization and resensitization reveal an arrestin-<br />

, GRK2-, and GRK5-independent mode of regulation in human embryonic kidney 293<br />

cells. Mol Pharmacol 60: 1020-1030, 2001.<br />

55. Harinath S, and Sikdar SK. Inhibition of human TREK-1 channels by<br />

caffeine and theophylline. Epilepsy Res 64: 127-135, 2005.<br />

56. Harper JF, and Brooker G. Femtomole sensitive radioimmunoassay for<br />

cyclic AMP and cyclic GMP after 2'0 acetylation by acetic anhydride in aqueous<br />

solution. J Cyclic Nucleotide Res 1: 207-218, 1975.<br />

57. He W, Danilova V, Zou S, Hellekant G, Max M, Margolskee RF, and<br />

Damak S. Partial rescue of taste responses of alpha-gustducin null mice by transgenic<br />

expression of alpha-transducin. Chem Senses 27: 719-727, 2002.<br />

58. Heck GL, Mierson S, and DeSimone JA. Salt taste transduction occurs<br />

through an amiloride-sensitive sodium transport pathway. Science 223: 403-405,<br />

1984.<br />

59. Hellekant G, af Segerstad CH, Roberts T, van der Wel H, Brouwer JN,<br />

Glaser D, Haynes R, and Eichberg JW. Effects of gymnemic acid on the chorda<br />

tympani proper nerve responses to sweet, sour, salty and bitter taste stimuli in the<br />

chimpanzee. Acta Physiol Scand 124: 399-408, 1985.<br />

60. Herness S, Zhao FL, Kaya N, Lu SG, Shen T, and Sun XD. Adrenergic<br />

signalling between rat taste receptor cells. J Physiol 543: 601-614, 2002a.<br />

61. Herness S, Zhao FL, Lu SG, Kaya N, and Shen T. Expression and<br />

physiological actions of cholecystokinin in rat taste receptor cells. J Neurosci 22:<br />

10018-10029, 2002b.<br />

62. Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba NJP, and Zuker CS.<br />

Putative mammalian taste receptors: a class of taste-specific GPCRs with distinct<br />

topographic selectivity. Cell 96: 541-551, 1999.<br />

63. Horrigan LA, Kelly JP, and Connor TJ. Caffeine suppresses TNF-alpha<br />

production via activation of the cyclic AMP/protein kinase A pathway. Int<br />

Immunopharmacol 4: 1409-1417, 2004.<br />

64. Howell LL, Coffin VL, and Spealman RD. Behavioral and physiological<br />

effects of xanthines in nonhuman primates. Psychopharmacology (Berl) 129: 1-14,<br />

1997.<br />

65. Huang AL, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Trankner D,<br />

Ryba NJP, and Zuker CS. The cells and logic for mammalian sour taste detection.<br />

Nature 442: 934-938, 2006.<br />

66. Huang L, Shanker YG, Dubauskaite J, Zheng JZ, Yan W, Rosenzweig S,<br />

Spielman AI, Max M, and Margolskee RF. Ggamma13 colocalizes with gustducin<br />

77

in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nat Neurosci<br />

2: 1055-1062, 1999.<br />

67. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D,<br />

and Roper SD. Mouse taste buds use serotonin as a neurotransmitter. J Neurosci 25:<br />

843-847, 2005a.<br />

68. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D,<br />

and Roper SD. Using biosensors to detect the release of serotonin from taste buds<br />

during taste stimulation. Arch Ital Biol 143: 87-96, 2005b.<br />

69. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, and Roper SD. Mouse taste<br />

buds release serotonin in response to taste stimuli. Chem Senses 30 Suppl 1: i39-i40,<br />

2005c.<br />

70. Jaber M, Koch WJ, Rockman H, Smith B, Bond RA, Sulik KK, Ross J,<br />

Jr., Lefkowitz RJ, Caron MG, and Giros B. Essential role of beta-adrenergic<br />

receptor kinase 1 in cardiac development and function. Proc Natl Acad Sci U S A 93:<br />

12974-12979, 1996.<br />

71. Jakob I, Hauser IA, Thevenod F, and Lindemann B. MDR1 in taste buds<br />

of rat vallate papilla: functional, immunohistochemical, and biochemical evidence.<br />

Am J Physiol 274: C182-191, 1998.<br />

72. Jang HJ, Kokrashvili Z, Theodorakis MJ, Carlson OD, Kim BJ, Zhou J,<br />

Kim HH, Xu X, Chan SL, Juhaszova M, Bernier M, Mosinger B, Margolskee<br />

RF, and Egan JM. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of<br />

glucagon-like peptide-1. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15069-15074, 2007.<br />

73. Jiang P, Cui M, Zhao B, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Osman R,<br />

Margolskee RF, and Max M. Lactisole interacts with the transmembrane domains of<br />

human T1R3 to inhibit sweet taste. J Biol Chem 280: 15238-15246, 2005a.<br />

74. Jiang P, Cui M, Zhao B, Snyder LA, Benard LM, Osman R, Max M, and<br />

Margolskee RF. Identification of the cyclamate interaction site within the<br />

transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3. J Biol Chem<br />

280: 34296-34305, 2005b.<br />

75. Jiang P, Ji Q, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Margolskee RF, and Max<br />

M. The cysteine-rich region of T1R3 determines responses to intensely sweet<br />

proteins. J Biol Chem 279: 45068-45075, 2004.<br />

76. Johnson R, Streicher EM, Louw GE, Warren RM, van Helden PD, and<br />

Victor TC. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Curr Issues Mol Biol 8:<br />

97-111, 2006.<br />

77. Johnston PV, and Roots BI. Fixation of the central nervous system by<br />

perfusion with aldehydes and its effect on the extracellular space as seen by electron<br />

microscopy. J Cell Sci 2: 377-386, 1967.<br />

78. Karcz-Kubicha M, Antoniou K, Terasmaa A, Quarta D, Solinas M,<br />

Justinova Z, Pezzola A, Reggio R, Muller CE, Fuxe K, Goldberg SR, Popoli P,<br />

and Ferre S. Involvement of adenosine A1 and A2A receptors in the motor effects of<br />

caffeine after its acute and chronic administration. Neuropsychopharmacology 28:<br />

1281-1291, 2003.<br />

79. Kawai M, Okiyama A, and Ueda Y. Taste enhancements between various<br />

amino acids and IMP. Chem Senses 27: 739-745, 2002.<br />

80. Kaya N, Shen T, Lu SG, Zhao FL, and Herness S. A paracrine signaling<br />

role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor<br />

subtypes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286: R649-658, 2004.<br />

81. Kim DJ, and Roper SD. Localization of serotonin in taste buds: a<br />

comparative study in four vertebrates. J Comp Neurol 353: 364-370, 1995.<br />

78

82. Kim MR, Kusakabe Y, Miura H, Shindo Y, Ninomiya Y, and Hino A.<br />

Regional expression patterns of taste receptors and gustducin in the mouse tongue.<br />

Biochem Biophys Res Commun 312: 500-506, 2003.<br />

83. King LA. Absorption of caffeine from beverages. Lancet 1: 1313, 1973.<br />

84. Kinnamon SC, Dionne VE, and Beam KG. Apical localization of K+<br />

channels in taste cells provides the basis for sour taste transduction. Proc Natl Acad<br />

Sci U S A 85: 7023-7027, 1988.<br />

85. Kishi M, Emori Y, Tsukamoto Y, and Abe K. Primary culture of rat taste<br />

bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression<br />

of foreign genes. Neuroscience 106: 217-225, 2001.<br />

86. Kitagawa M, Kusakabe Y, Miura H, Ninomiya Y, and Hino A. Molecular<br />

genetic identification of a candidate receptor gene for sweet taste. Biochem Biophys<br />

Res Commun 283: 236-242, 2001.<br />

87. Kobayashi H, Narita Y, Nishida M, and Kurose H. Beta-arrestin2 enhances<br />

beta2-adrenergic receptor-mediated nuclear translocation of ERK. Cell Signal 17:<br />

1248-1253, 2005.<br />

88. Krizhanovsky V, Agamy O, and Naim M. Sucrose-stimulated subsecond<br />

transient increase in cGMP level in rat intact circumvallate taste bud cells. Am J<br />

Physiol Cell Physiol 279: C120-125, 2000.<br />

89. Kuhn C, Bufe B, Winnig M, Hofmann T, Frank O, Behrens M,<br />

Lewtschenko T, Slack JP, Ward CD, and Meyerhof W. Bitter taste receptors for<br />

saccharin and acesulfame K. J Neurosci 24: 10260-10265, 2004.<br />

90. Kumazawa T, and Kurihara K. Large synergism between monosodium<br />

glutamate and 5'-nucleotides in canine taste nerve responses. Am J Physiol 259: R420-<br />

426, 1990.<br />

91. Kumazawa T, Nakamura M, and Kurihara K. Canine taste nerve responses<br />

to umami substances. Physiol Behav 49: 875-881, 1991.<br />

92. Lefkowitz RJ, and Shenoy SK. Transduction of receptor signals by betaarrestins.<br />

Science 308: 512-517, 2005.<br />

93. Lethco EJ, and Wallace WC. The metabolism of saccharin in animals.<br />

Toxicology 3: 287-300, 1975.<br />

94. Li X, Staszewski L, Xu H, Durick K, Zoller M, and Adler E. Human<br />

receptors for sweet and umami taste. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 4692-4696, 2002.<br />

95. Lin W, Finger TE, Rossier BC, and Kinnamon SC. Epithelial Na+ channel<br />

subunits in rat taste cells: localization and regulation by aldosterone. J Comp Neurol<br />

405: 406-420, 1999.<br />

96. Lush IE. The genetics of tasting in mice. VI. Saccharin, acesulfame, dulcin<br />

and sucrose. Genet Res 53: 95-99, 1989.<br />

97. Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca<br />

GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, and Lefkowitz RJ.<br />

Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase<br />

complexes. Science 283: 655-661, 1999.<br />

98. Luttrell LM, Hawes BE, van Biesen T, Luttrell DK, Lansing TJ, and<br />

Lefkowitz RJ. Role of c-Src tyrosine kinase in G protein-coupled receptor- and<br />

Gbetagamma subunit-mediated activation of mitogen-activated protein kinases. J Biol<br />

Chem 271: 19443-19450, 1996.<br />

99. Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. The role of beta-arrestins in the termination<br />

and transduction of G-protein-coupled receptor signals. J Cell Sci 115: 455-465, 2002.<br />

100. Ma L, and Pei G. Beta-arrestin signaling and regulation of transcription. J<br />

Cell Sci 120: 213-218, 2007.<br />

79

101. Mace OJ, Affleck J, Patel N, and Kellett GL. Sweet taste receptors in rat<br />

small intestine stimulate glucose absorption through apical GLUT2. J Physiol 582:<br />

379-392, 2007.<br />

102. Margolskee RF, Dyer J, Kokrashvili Z, Salmon KS, Ilegems E, Daly K,<br />

Maillet EL, Ninomiya Y, Mosinger B, and Shirazi-Beechey SP. T1R3 and<br />

gustducin in gut sense sugars to regulate expression of Na+-glucose cotransporter 1.<br />

Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15075-15080, 2007.<br />

103. Masuho I, Tateyama M, and Saitoh O. Characterization of bitter taste<br />

responses of intestinal STC-1 cells. Chem Senses 30: 281-290, 2005.<br />

104. Matsunami H, Montmayeur JP, and Buck LB. A family of candidate taste<br />

receptors in human and mouse. Nature 404: 601-604, 2000.<br />

105. Matthews HB, Fields M, and Fishbein L. Saccharin: distribution and<br />

excretion of a limited dose in the rat. J Agric Food Chem 21: 916-919, 1973.<br />

106. Max M, Shanker YG, Huang L, Rong M, Liu Z, Campagne F, Weinstein<br />

H, Damak S, and Margolskee RF. Tas1r3, encoding a new candidate taste receptor,<br />

is allelic to the sweet responsiveness locus Sac. Nat Genet 28: 58-63, 2001.<br />

107. McLaughlin SK, McKinnon PJ, and Margolskee RF. Gustducin is a tastecell-specific<br />

G protein closely related to the transducins. Nature 357: 563-569, 1992.<br />

108. Min YD, Choi CH, Bark H, Son HY, Park HH, Lee S, Park JW, Park EK,<br />

Shin HI, and Kim SH. Quercetin inhibits expression of inflammatory cytokines<br />

through attenuation of NF-kappaB and p38 MAPK in HMC-1 human mast cell line.<br />

Inflamm Res 56: 210-215, 2007.<br />

109. Misaka T, Kusakabe Y, Emori Y, Arai S, and Abe K. Molecular cloning<br />

and taste bud-specific expression of a novel cyclic nucleotide-gated channel. Ann N Y<br />

Acad Sci 855: 150-159, 1998.<br />

110. Montmayeur JP, Liberles SD, Matsunami H, and Buck LB. A candidate<br />

taste receptor gene near a sweet taste locus. Nat Neurosci 4: 492-498, 2001.<br />

111. Montmayeur JP, and Matsunami H. Receptors for bitter and sweet taste.<br />

Curr Opin Neurobiol 12: 366-371, 2002.<br />

112. Moore CA, Milano SK, and Benovic JL. Regulation of receptor trafficking<br />

by GRKs and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 451-482, 2007.<br />

113. Mori K, Nagao H, and Yoshihara Y. The olfactory bulb: coding and<br />

processing of odor molecule information. Science 286: 711-715, 1999.<br />

114. Mueller KL, Hoon MA, Erlenbach I, Chandrashekar J, Zuker CS, and<br />

Ryba NJP. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature 434: 225-229,<br />

2005.<br />

115. Naim M, Ronen T, Striem BJ, Levinson M, and Zehavi U. Adenylate<br />

cyclase responses to sucrose stimulation in membranes of pig circumvallate taste<br />

papillae. Comp Biochem Physiol B 100: 455-458, 1991.<br />

116. Naim M, Seifert R, Nurnberg B, Grunbaum L, and Schultz G. Some taste<br />

substances are direct activators of G-proteins. Biochem J 297 ( Pt 3): 451-454, 1994.<br />

117. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, and Peri I. Permeation of<br />

amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor<br />

signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and<br />

Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics, edited by Weerasinghe DK, and<br />

DuBois GE. Washington, DC: American Chemical Society, 2007, p. In press.<br />

118. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G, Ryba NJP, and<br />

Zuker CS. An amino-acid taste receptor. Nature 416: 199-202, 2002.<br />

119. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJP, and Zuker<br />

CS. Mammalian sweet taste receptors. Cell 106: 381-390, 2001.<br />

80

120. Nilkaeo A, Bhuvanath S, Praputbut S, and Wisessombat S. Induction of<br />

cell cycle arrest and apoptosis in JAR trophoblast by antimalarial drugs. Biomed Res<br />

27: 131-137, 2006.<br />

121. Ninomiya Y, Mizukoshi T, Nishikawa T, and Funakoshi M. Ion specificity<br />

of rat chorda tympani fibers to chemical and electrical tongue stimulations. Brain Res<br />

404: 350-354, 1987.<br />

122. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca2+ in taste cells via<br />

activation of muscarinic receptors. J Neurophysiol 87: 2643-2649, 2002.<br />

123. Okamoto T, Murayama Y, Hayashi Y, Inagaki M, Ogata E, and<br />

Nishimoto I. Identification of a Gs activator region of the beta 2-adrenergic receptor<br />

that is autoregulated via protein kinase A-dependent phosphorylation. Cell 67: 723-<br />

730, 1991.<br />

124. Oliet SH, and Bourque CW. Steady-state osmotic modulation of cationic<br />

conductance in neurons of rat supraoptic nucleus. Am J Physiol 265: R1475-1479,<br />

1993.<br />

125. Ozben T. Mechanisms and strategies to overcome multiple drug resistance in<br />

cancer. FEBS Lett 580: 2903-2909, 2006.<br />

126. Ozdener H, Yee KK, Cao J, Brand JG, Teeter JH, and Rawson NE.<br />

Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem Senses<br />

31: 279-290, 2006.<br />

127. Ozeck M, Brust P, Xu H, and Servant G. Receptors for bitter, sweet and<br />

umami taste couple to inhibitory G protein signaling pathways. Eur J Pharmacol 489:<br />

139-149, 2004.<br />

128. Penn RB, Pronin AN, and Benovic JL. Regulation of G protein-coupled<br />

receptor kinases. Trends Cardiovasc Med 10: 81-89, 2000.<br />

129. Pérez-Ruiz T, Martínez-Lozano C, Tomás1 V, Sanz A, and Bravo E.<br />

Quantitative assay for neohesperidin dihydrochalcone in foodstuffs by capillary<br />

electrophoresis. Chromatographia 51: 385-389, 2000.<br />

130. Perez-Tomas R. Multidrug resistance: retrospect and prospects in anti-cancer<br />

drug treatment. Curr Med Chem 13: 1859-1876, 2006.<br />

131. Perez CA, Huang L, Rong M, Kozak JA, Preuss AK, Zhang H, Max M,<br />

and Margolskee RF. A transient receptor potential channel expressed in taste<br />

receptor cells. Nat Neurosci 5: 1169-1176, 2002.<br />

132. Peri I, Mamrud-Brains H, Rodin S, Krizhanovsky V, Shai Y, Nir S, and<br />

Naim M. Rapid entry of bitter and sweet tastants into liposomes and taste cells:<br />

implications for signal transduction. Am J Physiol Cell Physiol 278: C17-25, 2000.<br />

133. Porcar I, Codoner A, Gomez CM, Abad C, and Campos A. Interaction of<br />

quinine with model lipid membranes of different compositions. J Pharm Sci 92: 45-<br />

57, 2003.<br />

134. Prawitt D, Monteilh-Zoller MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel B, Fleig<br />

A, and Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to<br />

rapid changes in [Ca2+]i. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 15166-15171, 2003.<br />

135. Premont RT, and Gainetdinov RR. Physiological roles of G protein-coupled<br />

receptor kinases and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 511-534, 2007.<br />

136. Premont RT, Koch WJ, Inglese J, and Lefkowitz RJ. Identification,<br />

purification, and characterization of GRK5, a member of the family of G proteincoupled<br />

receptor kinases. J Biol Chem 269: 6832-6841, 1994.<br />

137. Pronin AN, Tang H, Connor J, and Keung W. Identification of ligands for<br />

two human bitter T2R receptors. Chem Senses 29: 583-593, 2004.<br />

81

138. Quarta D, Ferre S, Solinas M, You ZB, Hockemeyer J, Popoli P, and<br />

Goldberg SR. Opposite modulatory roles for adenosine A1 and A2A receptors on<br />

glutamate and dopamine release in the shell of the nucleus accumbens. Effects of<br />

chronic caffeine exposure. J Neurochem 88: 1151-1158, 2004.<br />

139. Ravi D, Muniyappa H, and Das KC. Caffeine inhibits UV-mediated NFkappaB<br />

activation in A2058 melanoma cells: an ATM-PKCdelta-p38 MAPKdependent<br />

mechanism. Mol Cell Biochem 2007.<br />

140. Ribas C, Penela P, Murga C, Salcedo A, Garcia-Hoz C, Jurado-Pueyo M,<br />

Aymerich I, and Mayor F, Jr. The G protein-coupled receptor kinase (GRK)<br />

interactome: role of GRKs in GPCR regulation and signaling. Biochim Biophys Acta<br />

1768: 913-922, 2007.<br />

141. Richter TA, Caicedo A, and Roper SD. Sour taste stimuli evoke Ca2+ and<br />

pH responses in mouse taste cells. J Physiol 547: 475-483, 2003.<br />

142. Rinner O, Makhankov YV, Biehlmaier O, and Neuhauss SC. Knockdown<br />

of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response<br />

recovery and delayed dark adaptation. Neuron 47: 231-242, 2005.<br />

143. Roper SD. Cell communication in taste buds. Cell Mol Life Sci 63: 1494-<br />

1500, 2006.<br />

144. Rosenzweig S, Yan W, Dasso M, and Spielman AI. Possible novel<br />

mechanism for bitter taste mediated through cGMP. J Neurophysiol 81: 1661-1665,<br />

1999.<br />

145. Rossler P, Boekhoff I, Tareilus E, Beck S, Breer H, and Freitag J. G<br />

protein betagamma complexes in circumvallate taste cells involved in bitter<br />

transduction. Chem Senses 25: 413-421, 2000.<br />

146. Rossler P, Kroner C, Freitag J, Noe J, and Breer H. Identification of a<br />

phospholipase C beta subtype in rat taste cells. Eur J Cell Biol 77: 253-261, 1998.<br />

147. Ruiz-Avila L, McLaughlin SK, Wildman D, McKinnon PJ, Robichon A,<br />

Spickofsky N, and Margolskee RF. Coupling of bitter receptor to phosphodiesterase<br />

through transducin in taste receptor cells. Nature 376: 80-85, 1995.<br />

148. Sahir N, Mas C, Bourgeois F, Simonneau M, Evrard P, and Gressens P.<br />

Caffeine-induced telencephalic vesicle evagination in early post-implantation mouse<br />

embryos involves cAMP-dependent protein kinase (PKA) inhibition. Cereb Cortex<br />

11: 343-349, 2001.<br />

149. Sainz E, Cavenagh MM, Gutierrez J, Battey JF, Northup JK, and<br />

Sullivan SL. Functional characterization of human bitter taste receptors. Biochem J<br />

403: 537-543, 2007.<br />

150. Saito Y, Tetsuka M, Li Y, Kurose H, and Maruyama K. Properties of rat<br />

melanin-concentrating hormone receptor 1 internalization. Peptides 25: 1597-1604,<br />

2004.<br />

151. Sarnago S, Elorza A, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent phosphorylation<br />

of the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) by Src tyrosine kinase. J Biol<br />

Chem 274: 34411-34416, 1999.<br />

152. Sato T, and Beidler LM. Broad tuning of rat taste cells for four basic taste<br />

stimuli. Chem Senses 22: 287-293, 1997.<br />

153. Seibold A, Williams B, Huang ZF, Friedman J, Moore RH, Knoll BJ, and<br />

Clark RB. Localization of the sites mediating desensitization of the beta(2)-<br />

adrenergic receptor by the GRK pathway. Mol Pharmacol 58: 1162-1173, 2000.<br />

154. Shaul YD, and Seger R. ERK1c regulates Golgi fragmentation during<br />

mitosis. J Cell Biol 172: 885-897, 2006.<br />

82

155. Shenoy SK, Drake MT, Nelson CD, Houtz DA, Xiao K, Madabushi S,<br />

Reiter E, Premont RT, Lichtarge O, and Lefkowitz RJ. beta-arrestin-dependent, G<br />

protein-independent ERK1/2 activation by the beta2 adrenergic receptor. J Biol Chem<br />

281: 1261-1273, 2006.<br />

156. Shim CK, Cheon EP, Kang KW, Seo KS, and Han HK. Inhibition effect of<br />

flavonoids on monocarboxylate transporter 1 (MCT1) in Caco-2 cells. J Pharm<br />

Pharmacol 59: 1515-1519, 2007.<br />

157. Simon SA, Holland VF, Benos DJ, and Zampighi GA. Transcellular and<br />

paracellular pathways in lingual epithelia and their influence in taste transduction.<br />

Microsc Res Tech 26: 196-208, 1993.<br />

158. Soares NFF, and Hotchkiss JH. Bitterness reduction in grapefruit juice<br />

through active packaging. Packaging Technol Sci 11: 9-18, 1998.<br />

159. Spielman AI, Mody I, Brand JG, Whitney G, MacDonald JF, and Salter<br />

MW. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor<br />

cells. Brain Res 503: 326-329, 1989.<br />

160. Spielman AI, Nagai H, Sunavala G, Dasso M, Breer H, Boekhoff I, Huque<br />

T, Whitney G, and Brand JG. Rapid kinetics of second messenger production in<br />

bitter taste. Am J Physiol 270: C926-931, 1996.<br />

161. Stevens DR, Seifert R, Bufe B, Muller F, Kremmer E, Gauss R, Meyerhof<br />

W, Kaupp UB, and Lindemann B. Hyperpolarization-activated channels HCN1 and<br />

HCN4 mediate responses to sour stimuli. Nature 413: 631-635, 2001.<br />

162. Stewart RE, DeSimone JA, and Hill DL. New perspectives in a gustatory<br />

physiology: transduction, development, and plasticity. Am J Physiol 272: C1-26,<br />

1997.<br />

163. Striem BJ, Naim M, and Lindemann B. Generation of cyclic AMP in taste<br />

buds of the rat circumvallate papilla in response to sucrose. Cell Physiol Biochem 1:<br />

46-54, 1991.<br />

164. Striem BJ, Pace U, Zehavi U, Naim M, and Lancet D. Sweet tastants<br />

stimulate adenylate cyclase coupled to GTP-binding protein in rat tongue membranes.<br />

Biochem J 260: 121-126, 1989.<br />

165. Takara K, Obata Y, Yoshikawa E, Kitada N, Sakaeda T, Ohnishi N, and<br />

Yokoyama T. Molecular changes to HeLa cells on continuous exposure to cisplatin<br />

or paclitaxel. Cancer Chemother Pharmacol 58: 785-793, 2006.<br />

166. Thompson AJ, Lochner M, and Lummis SC. The antimalarial drugs<br />

quinine, chloroquine and mefloquine are antagonists at 5-HT3 receptors. Br J<br />

Pharmacol 151: 666-677, 2007.<br />

167. Torii K, and Cagan RH. Biochemical studies of taste sensation. IX.<br />

Enhancement of L-[3H]glutamate binding to bovine taste papillae by 5'-<br />

ribonucleotides. Biochim Biophys Acta 627: 313-323, 1980.<br />

168. Tran TM, Friedman J, Qunaibi E, Baameur F, Moore RH, and Clark RB.<br />

Characterization of agonist stimulation of cAMP-dependent protein kinase and G<br />

protein-coupled receptor kinase phosphorylation of the beta2-adrenergic receptor<br />

using phosphoserine-specific antibodies. Mol Pharmacol 65: 196-206, 2004.<br />

169. Trubey KR, Culpepper S, Maruyama Y, Kinnamon SC, and Chaudhari<br />

N. Tastants evoke cAMP signal in taste buds that is independent of calcium signaling.<br />

Am J Physiol Cell Physiol 291: C237-244, 2006.<br />

170. Tsunenari T, Hayashi Y, Orita M, Kurahashi T, Kaneko A, and Mori T.<br />

A quinine-activated cationic conductance in vertebrate taste receptor cells. J Gen<br />

Physiol 108: 515-523, 1996.<br />

83

171. Ugawa S, Minami Y, Guo W, Saishin Y, Takatsuji K, Yamamoto T,<br />

Tohyama M, and Shimada S. Receptor that leaves a sour taste in the mouth. Nature<br />

395: 555-556, 1998.<br />

172. Valenti LP. Liquid chromatographic determination of quinine, hydroquinine,<br />

saccharin, and sodium benzoate in quinine beverages. J Assoc Off Anal Chem 68:<br />

782-784, 1985.<br />

173. Varkevisser B, and Kinnamon SC. Sweet taste transduction in hamster: role<br />

of protein kinases. J Neurophysiol 83: 2526-2532, 2000.<br />

174. Vaughan DJ, Millman EE, Godines V, Friedman J, Tran TM, Dai W,<br />

Knoll BJ, Clark RB, and Moore RH. Role of the G protein-coupled receptor kinase<br />

site serine cluster in beta2-adrenergic receptor internalization, desensitization, and<br />

beta-arrestin translocation. J Biol Chem 281: 7684-7692, 2006.<br />

175. Violin JD, Ren XR, and Lefkowitz RJ. G-protein-coupled receptor kinase<br />

specificity for beta-arrestin recruitment to the beta2-adrenergic receptor revealed by<br />

fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem 281: 20577-20588, 2006.<br />

176. Wong GT, Gannon KS, and Margolskee RF. Transduction of bitter and<br />

sweet taste by gustducin. Nature 381: 796-800, 1996.<br />

177. Wright DC, Hucker KA, Holloszy JO, and Han DH. Ca2+ and AMPK both<br />

mediate stimulation of glucose transport by muscle contractions. Diabetes 53: 330-<br />

335, 2004.<br />

178. Xu H, Staszewski L, Tang H, Adler E, Zoller M, and Li X. Different<br />

functional roles of T1R subunits in the heteromeric taste receptors. Proc Natl Acad<br />

Sci U S A 101: 14258-14263, 2004.<br />

179. Yan W, Sunavala G, Rosenzweig S, Dasso M, Brand JG, and Spielman<br />

AI. Bitter taste transduced by PLC-beta(2)-dependent rise in IP(3) and alphagustducin-dependent<br />

fall in cyclic nucleotides. Am J Physiol Cell Physiol 280: C742-<br />

751, 2001.<br />

180. Yang R, Crowley HH, Rock ME, and Kinnamon JC. Taste cells with<br />

synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. J<br />

Comp Neurol 424: 205-215, 2000.<br />

181. Ye Q, Heck GL, and DeSimone JA. Voltage dependence of the rat chorda<br />

tympani response to Na+ salts: implications for the functional organization of taste<br />

receptor cells. J Neurophysiol 70: 167-178, 1993.<br />

182. Zamah AM, Delahunty M, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Protein kinase<br />

A-mediated phosphorylation of the beta 2-adrenergic receptor regulates its coupling to<br />

Gs and Gi. Demonstration in a reconstituted system. J Biol Chem 277: 31249-31256,<br />

2002.<br />

183. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D,<br />

Zuker CS, and Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes: different<br />

receptor cells sharing similar signaling pathways. Cell 112: 293-301, 2003.<br />

184. Zhou Q, McCracken MA, and Strobl JS. Control of mammary tumor cell<br />

growth in vitro by novel cell differentiation and apoptosis agents. Breast Cancer Res<br />

Treat 75: 107-117, 2002.<br />

185. Zubare-Samuelov M, Peri I, Tal M, Tarshish M, Spielman AI, and Naim<br />

M. Some sweet and bitter tastants stimulate inhibitory pathway of adenylyl cyclase<br />

via melatonin and alpha 2-adrenergic receptors in Xenopus laevis melanophores. Am J<br />

Physiol Cell Physiol 285: C1255-1262, 2003.<br />

186. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, and Naim<br />

M. Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and<br />

84

sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol<br />

289: C483-492, 2005.<br />

85

רשימת פרסומים ותקצירים<br />

1. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, Naim M (2005).<br />

Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and<br />

sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol<br />

289: C483-492.<br />

2. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, Peri I (2007). Permeation of<br />

amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor<br />

signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and<br />

Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics; ACS Symposium Series 979;<br />

Weerasinghe, D.K. and DuBois, G.E. Eds; American Chemical Society, Washington<br />

DC. In press.<br />

3. Naim M, Huang L, Spielman AI, Shaul ME, Aliluiko A (2006). Stimulation of<br />

taste cells by sweet taste compounds: receptors, downstream signal transduction<br />

components, and the implications to sweet taste quality. In: Optimizing Sweet Taste in<br />

Food, Spillane, W. Ed., Woodhead Publishing, Ltd. Cambridge, UK.<br />

4. Shaul ME, Peri I, Malach E, Huang L, Spielman AI, Seger R, Naim M (2008).<br />

Intracellular inhibition by some sweet and bitter tastants of β 2 -adrenergic receptor<br />

(β 2 AR) desensitization. Keystone Symposia, Alberta, Canada. Abstract.<br />

5. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME (2004). Amphipathic sweet and<br />

bitter tastants are inhibitors of G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) in vitro:<br />

possible implication for delayed taste termination. FASEB J, 18(4): A313. Abstract.<br />

6. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME, Aliluiko A (2004). Amphipathic<br />

sweet and bitter tastants permeate cells in vivo and are inhibitors of G-protein-coupled<br />

receptor kinases (GRKs) in vitro: possible implication for delayed taste termination.<br />

ECRO, Dijon, France. Abstract.<br />

7. Shaul ME, Rodin S, Tarshish M, Nir S, Naim M (2003). Active and passive<br />

transport of sweet and bitter amphipathic tastants into taste cells. The Annual Meeting<br />

2003 ISBMB (The Isreali Society for Biochemistry and Molecular Biology), Tel-Aviv<br />

University, Tel-Aviv April 2003. Abstract.<br />

86

logo

products

Resources

Company

Terms of service
Privacy policy
Cookie policy
Cookie settings
Imprint
Change language
Made with love in Switzerland
© 2024 Yumpu.com all rights reserved

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!