pCold® TF DNA - è£½å“ä¸€è¦§ï½œã‚¿ã‚«ãƒ©ãƒã‚¤ã‚ªæ ªå¼ä¼šç¤¾ éºä¼å­å·¥å­¦ç ”ç©¶ ...

製 品 コード 3365
研 究 用
pCold® TF DNA
説 明 書
v201211Da_2

タンパク 質 の 構 造 や 機 能 の 解 明 はポストゲノムの 重 要 な 研 究 対 象 で、 効 率 のよいタンパク 質 生 産 システ
ムはポストゲノム 解 析 に 必 須 の 基 盤 技 術 です。 組 換 えタンパク 質 の 生 産 には 大 腸 菌 を 宿 主 とする 発 現 系
が 広 く 利 用 されています。しかしながら、 大 腸 菌 発 現 系 は 扱 いやすく、 低 コストである 反 面 、 遺 伝 子 によっ
ては 発 現 できない、あるいは 発 現 タンパク 質 が 不 溶 化 するという 問 題 が 起 こることがあります。
タカラバイオではニュージャージー 医 科 歯 科 大 学 の 井 上 正 順 教 授 と 共 同 研 究 を 行 い、 新 規 で 有 用 な 大 腸
菌 コールドショックベクター pCold DNA シリーズを 開 発 しました。 大 腸 菌 の 培 養 中 に 培 養 温 度 を 低 温
にシフトさせると、 菌 の 生 育 は 一 時 的 に 停 止 し 大 部 分 の 大 腸 菌 タンパク 質 の 発 現 は 減 少 しますが、コー
ルドショックタンパク 質 と 呼 ばれる 一 連 のタンパク 質 は 特 異 的 に 発 現 が 誘 導 されます。pCold ベクター
は 大 腸 菌 コールドショック 遺 伝 子 の 一 つである cspA のプロモーターを 利 用 したコールドショック 発 現
ベクターで、 従 来 の 大 腸 菌 発 現 系 と 比 較 して、 発 現 できる 確 率 や 発 現 産 物 の 可 溶 性 度 を 向 上 させること
ができます(1)。 低 温 発 現 のため、 他 の 大 腸 菌 由 来 のタンパク 質 の 発 現 が 抑 えられ、 純 度 の 高 い 目 的 タ
ンパク 質 を 得 ることが 可 能 です。
一 方 で、 大 腸 菌 での 異 種 タンパク 質 の 発 現 を 成 功 させるためには、タンパク 質 の 折 りたたみに 作 用 する
シャペロンタンパク 質 を 共 発 現 させることも 有 効 です。
pCold ベクターを 用 いたタンパク 質 発 現 でも、シャペロンタンパク 質 発 現 プラスミド(Chaperone Plasmid
Set)との 併 用 により、pCold ベクター 単 独 では 発 現 しない、あるいは 不 溶 化 していた 異 種 タンパク
質 の 可 溶 化 発 現 に 成 功 した 例 が 多 数 あります。
これらの 知 見 をもとに 開 発 された pCold TF DNA は、 大 腸 菌 シャペロンの 一 種 であるトリガーファク
ター(trigger factor、TF)を 可 溶 化 タグとする 融 合 型 コールドショック 発 現 ベクターです。TF は 分 子 量
48 kDa のシャペロンタンパク 質 でリボソームに 会 合 して 存 在 し、タンパク 質 の 翻 訳 と 共 役 しながら(cotranslationally)、
新 生 ポリペプチドのフォールディングを 促 進 します(2)。TF は 大 腸 菌 由 来 のタンパク
質 であるため、 他 生 物 由 来 のタグに 比 べて 大 腸 菌 内 での 発 現 効 率 がよく、 可 溶 化 タグとして 高 い 効 果 が
期 待 できます。
本 ベクターは、cspA プロモーターの 下 流 に 5’ 非 翻 訳 領 域 (5' UTR)、translation enhancing element(TEE)、
His タグ、TF タグ、multi cloning site(MCS)などが 配 置 されています。TEE には 翻 訳 を 促 進 する 作 用 があり、
His タグは 発 現 タンパク 質 の 精 製 に 利 用 できます。また、プロモーターの 下 流 には 発 現 を 厳 密 に 制 御 す
るための lac operator が 挿 入 されています。
さらに、TF タグと MCS の 間 には HRV 3C Protease、Thrombin、Factor Xa の 認 識 配 列 があり、 発 現 後 の
融 合 タンパク 質 からタグを 除 去 することができます。
pCold TF DNA は 大 腸 菌 のプロモーターを 用 いているため、 他 の pCold DNA と 同 様 に、ほとんどの 大 腸
菌 を 発 現 用 宿 主 として 利 用 することができます。
pCold TF DNA を 利 用 すれば、コールドショックベクターの 高 効 率 な 組 換 えタンパク 質 発 現 能 と TF の 可
溶 化 タグ 機 能 およびシャペロン 機 能 により、これまで 発 現 が 困 難 であった 遺 伝 子 を 可 溶 化 タンパク 質 と
して 発 現 させることが 可 能 となります。
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I. 製 品 の 内 容
pCold TF DNA
25 μg
< 利 用 できる 大 腸 菌 発 現 系 >
大 腸 菌 に 由 来 する cspA プロモーターにより 転 写 されるので 殆 どすべての 大 腸 菌 株 を
発 現 用 宿 主 として 利 用 できます。
M13 IG
cspA 3’UTR
Multiple cloning site
Factor Xa site
Thrombin site
HRV 3C Protease site
His−Tag
TEE
cspA 5’UTR
lac operator
cspA promoter
Amp
lac I
ColE1 ori
図 1.プラスミドの 概 略 図
GeneBank Accession No. AB213654
II. 保 存 − 20℃
III. 使 用 方 法
目 的 遺 伝 子 の 発 現 方 法
(1)コールドショックベクター pCold TF DNA のマルチクローニングサイトに 目 的 遺 伝 子
を 挿 入 して 発 現 用 プラスミドを 作 製 する * 1 。
* 1: 発 現 プラスミドの 構 築 については VII. Appendix(7 ページ)をご 参 照 ください。
(2) 発 現 用 プラスミドで 宿 主 大 腸 菌 * 2 を 形 質 転 換 し、アンピシリンを 含 む 選 択 培 地 プレー
ト 上 で 形 質 転 換 体 を 選 択 する。
* 2: 本 製 品 を 用 いる 場 合 、 目 的 遺 伝 子 は 大 腸 菌 に 由 来 する cspA プロモーターによ
り 発 現 されるので、ほとんど 全 ての 大 腸 菌 株 を 発 現 用 宿 主 として 利 用 できる。
(3)50 μg/ml アンピシリンを 含 む LB 培 地 に 形 質 転 換 体 を 植 菌 し、37℃で 振 とう 培 養 する。
(4) 培 養 液 の OD600 が 0.5 程 度 となった 時 点 で 培 養 液 をすみやかに 15℃に 冷 却 し、30 分
間 放 置 する。
(5) 終 濃 度 0.1 ~ 1.0 mM となるように IPTG を 添 加 し 15℃で 24 時 間 振 とう 培 養 する。
(6) 培 養 終 了 後 、SDS-PAGE や 活 性 測 定 などにより 目 的 産 物 の 有 無 、 発 現 量 や 可 溶 性 を 確
認 する。
発 現 用 宿 主 大 腸 菌 、 培 養 ・ 誘 導 条 件 ( 培 地 、 培 養 温 度 、 通 気 攪 拌 条 件 、 誘 導 のタイミング、
誘 導 物 質 の 濃 度 、 誘 導 後 の 培 養 条 件 と 温 度 など)を 至 適 化 することにより 発 現 量 、 可 溶 化
度 を 改 善 することができます。
なお、His タグを 利 用 した 融 合 タンパク 質 の 精 製 には、Clontech 社 の TALON® His タグ 融
合 タンパク 精 製 樹 脂 、His60 Ni Superflow Resin 等 の 製 品 をお 勧 めします。
N 末 端 側 のタグ 配 列 は Factor Xa、Thrombin、HRV 3C Protease で 切 断 ・ 除 去 できます。
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IV.クローニング 図
pCold TF DNA
V. 実 施 例
pCold TF DNA を 用 いた 発 現 系 を、pCold I DNA 単 独 発 現 系 およびトリガーファクターを
発 現 するシャぺロンプラスミド pTf16 と pCold I DNA の 共 発 現 系 、あるいは、T7 プロモー
ター 発 現 系 ( 他 の 可 溶 化 タグとの 融 合 発 現 例 を 含 む)と 比 較 した。コールドショック 発 現
は、 発 現 用 宿 主 として BL21 を 使 用 して、 使 用 方 法 に 記 載 した 目 的 遺 伝 子 の 発 現 方 法 に 従 っ
て、 培 養 ・ 発 現 誘 導 を 行 った。T7 プロモーターによる 発 現 は、 発 現 宿 主 として BL21(DE3)
を 用 い、 常 法 通 り IPTG を 添 加 後 37℃で 培 養 することにより 行 った。
(1) 発 現 が 可 能 となった 遺 伝 子 の 例
酵 素 タンパク 質 A( 推 定 分 子 量 29 kDa)は、pCold I DNA( 単 独 発 現 、シャぺロン 共
発 現 )を 用 いた 場 合 および T7 プロモーターを 用 いた 発 現 系 では、 目 的 タンパク 質
の 推 定 分 子 量 29 kDa 付 近 には 明 確 なバンドは 認 められなかった。 一 方 で、pCold
TF DNA を 用 いた 場 合 のみ、 目 的 タンパク 質 (29 kDa + 52 kDa)の 発 現 が 確 認 され、
その 大 部 分 は 可 溶 性 であった( 図 1)。この 酵 素 タンパク 質 A においては、 融 合 タ
ンパク 質 のままでも 酵 素 活 性 があることを 確 認 している。
1: 細 胞 抽 出 液
2: 可 溶 性 画 分
←: 目 的 タンパク 質
*: 共 発 現 させたトリガーファクター
図 1. 酵 素 タンパク 質 A の 発 現
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(2) 可 溶 性 発 現 量 が 増 大 した 遺 伝 子 の 例
酵 素 タンパク 質 B( 推 定 分 子 量 63 kDa)は、pCold I DNA( 単 独 発 現 、シャぺロン 共
発 現 )および 他 の 可 溶 化 タグを 持 つ T7 発 現 ベクター 用 いた 場 合 は、ほとんど 可 溶
性 発 現 が 認 められなかった。 一 方 、pCold TF DNA を 用 いた 場 合 は、 目 的 タンパク
質 の 大 部 分 が 可 溶 性 画 分 に 得 られ、その 可 溶 化 度 は 他 のタグと 比 較 して 著 しく 高
かった( 図 2)。(それぞれタグが 融 合 発 現 しているため、 目 的 タンパク 質 の 分 子 量
は 63 kDa より 大 きくなっている)
図 2. 酵 素 タンパク 質 B の 発 現
1: 細 胞 抽 出 液
2: 可 溶 性 画 分
3: 不 溶 性 画 分
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VI.Q & A
Q1. 発 現 タンパク 質 が 不 溶 化 した 場 合 、 何 を 検 討 すればいいか?
A1. 最 適 な 培 養 ・ 誘 導 条 件 は 目 的 タンパク 質 によって 異 なります。 下 記 の 点 を 参 考 にし
て 培 養 ・ 誘 導 条 件 を 検 討 してください。
・ 誘 導 のタイミングを 変 更 する( 対 数 期 初 期 から 後 期 までの 範 囲 で 検 討 する)。
・ 誘 導 物 質 (IPTG)の 濃 度 を 変 更 する(0.1 ~ 1 mM)。
・ 誘 導 後 の 培 養 温 度 、 培 養 時 間 を 検 討 する( 通 常 15℃、24 時 間 が 最 適 )。
・ 通 気 、 攪 拌 条 件 を 変 更 する。
Q2. 全 く 発 現 しない、あるいは 発 現 量 が 少 ない 場 合 の 検 討 方 法 は?
A2. 培 養 ・ 誘 導 条 件 の 検 討 を 行 う(Q1 参 照 )か、 宿 主 大 腸 菌 を 変 更 することをお 勧 めし
ます。
Q3. 使 用 実 績 のある 宿 主 大 腸 菌 は?
A3. 弊 社 販 売 の BL21、Novagen 社 の Rosetta、Origamiなどです。
BL21 は、 最 も 一 般 的 な 発 現 用 宿 主 です。
Origamiは、trx /gor 遺 伝 子 欠 損 株 で 細 胞 質 内 でのジスルフィド 結 合 形 成 が 高 レベ
ルでおこります。 発 現 したタンパク 質 の 可 溶 化 と refolding が 促 進 されます。
Rosettaは、 大 腸 菌 で 使 用 頻 度 が 少 ないコドンに 対 応 する tRNA を 供 給 するプラス
ミドを 含 むため、 大 腸 菌 のコドンの 使 用 頻 度 の 制 約 を 受 けていた 遺 伝 子 に 対 しても
"Universal" な 翻 訳 が 可 能 です。
Q4. pCold TF ベクターに 目 的 遺 伝 子 を 挿 入 したプラスミドを 保 持 する 大 腸 菌 は、プレー
ト 上 で 4℃ 保 存 できるか?
A4. プレート 上 で 4℃ 保 存 することはお 勧 めできません。 目 的 遺 伝 子 を 挿 入 した pCold
TF ベクターによる 形 質 転 換 体 をプレート 上 で 4℃ 保 存 すると、 目 的 タンパク 質 が
leak する 可 能 性 があります。 早 々にピックアップして− 80℃ 保 存 (グリセロールス
トック)することをお 勧 めします。
Q5. サイズの 大 きな 遺 伝 子 も 発 現 できるか?
A5. ヒト 遺 伝 子 125 kDa で 良 好 に 可 溶 化 発 現 した 実 績 があります。
(CBB 染 色 で、125 + 52 kDa バンドが 確 認 された。)
Q6. pCold TF DNA で 融 合 発 現 させた 目 的 タンパク 質 で、プロテアーゼ 処 理 後 の SDS-
PAGE では 切 断 が 確 認 できたにも 関 わらず、 目 的 タンパク 質 から TF タグが 離 れない。
A6. 目 的 タンパク 質 の 性 状 によっては、プロテアーゼで 切 断 後 も 目 的 タンパク 質 と TF
タグが 相 互 作 用 するケースがあります。 不 溶 性 になりやすいタンパク 質 では 特 にこ
の 傾 向 が 強 いようです。 解 決 法 としては、 切 断 時 に 可 溶 性 度 を 改 善 する 試 薬 を 加 え
ることが 考 えられます。 候 補 には 1% Triton X-100、0.5 M アルギニン、5 mM DTT、
20 mM CHAPS などがあります。 万 能 な 条 件 はありませんので、 目 的 タンパク 質 に
あわせてご 検 討 ください。
ただ、 目 的 タンパク 質 と TF の 相 互 作 用 が 強 固 な 場 合 は、 両 者 が 解 離 せず、 目 的 タ
ンパク 質 を 単 離 できないこともあります。
なお、Protein S 由 来 の ProS2 可 溶 化 タグをもつ pCold ProS2 DNA( 製 品 コード
3371)では、ProS2 タグと 目 的 タンパク 質 との 相 互 作 用 が 弱 いため、プロテアーゼ
処 理 後 の 目 的 タンパク 質 と ProS2 タグの 分 離 が 比 較 的 容 易 です。
Q7. pCold TF DNA や pCold ProS2 DNA で 発 現 した 融 合 タンパク 質 を 用 いて 抗 体 作 製 を
行 いたいが?
A7. 抗 体 作 製 用 タンパク 質 の 発 現 には pCold ProS2 DNA( 製 品 コード 3371)をご 利 用 くだ
さい。ProS2 融 合 タンパク 質 をウサギに 免 疫 し、 抗 血 清 を 調 製 することも 可 能 ですが、
プロテアーゼで ProS2 タグを 切 断 した 目 的 タンパク 質 を 抗 原 として 利 用 することを
お 勧 めします。
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一 方 、TF 融 合 タンパク 質 をウサギに 免 疫 すると、 抗 血 清 が TF タグに 対 して 非 常 に
強 い 反 応 性 を 示 す 場 合 があります。TF 融 合 タンパク 質 に 対 する 抗 体 を 調 製 する 場 合
には、 免 疫 動 物 としてモルモットの 使 用 をお 勧 めします。
プロテアーゼ 処 理 で TF タグを 切 断 し、タグを 含 まない 目 的 タンパク 質 を 精 製 すれば、
ウサギへの 免 疫 にも 使 用 できますが、Q6 のように TF タグの 除 去 が 難 しい 場 合 があ
りますのでご 注 意 ください。
VII.Appendix
発 現 プラスミドの 構 築
発 現 プラスミドを 構 築 するには、(1) 目 的 タンパク 質 をコードするインサート DNA
が pCold TF DNA の 読 み 取 りフレームに 合 うように 考 慮 して 制 限 酵 素 サイトを 選 択 し、
(2)インサートの 調 製 、(3)ベクターの 制 限 酵 素 切 断 を 行 い、(4) 切 断 したベクターとイ
ンサートを 連 結 後 、 適 当 な 大 腸 菌 を 形 質 転 換 して、(5) 得 られたコロニーよりプラスミド
を 調 製 して 正 しくインサートが 入 ったものを 選 択 する 必 要 があります。
インサート DNA の 調 製 法 としては PCR を 用 いる 方 法 や、プラスミドにクローニングされ
た 遺 伝 子 を 制 限 酵 素 消 化 によって 切 り 出 す 方 法 、 合 成 遺 伝 子 を 用 いる 方 法 があります。
pCold TF DNA は、pCold I ~ IV DNA および pCold ProS2 DNA のマルチクローニングサイ
トと 配 列 が 同 じですので、 制 限 酵 素 による 乗 せ 替 えをスムーズに 行 うことができます。
また、Clontech 社 の In-Fusion® HD Cloning Kit を 用 いると、 適 切 な 制 限 酵 素 サイトが 存
在 しない 場 合 でも、 簡 単 ・ 迅 速 にディレクショナルクローニングが 行 えるので 便 利 です。
ここでは、 一 般 的 な 方 法 として PCR を 用 いた 実 験 例 を 示 します。
[ 大 腸 菌 チオレドキシンをコードする 遺 伝 子 の 発 現 用 プラスミド 調 製 例 ]
1. 制 限 酵 素 サイトの 選 択 とプライマーの 設 計
プライマー 設 計 時 の 手 順 と 注 意 点
1. マルチクローニングサイトにある 制 限 酵 素 の 中 から 目 的 配 列 を 切 断 しない 2 種
類 の 制 限 酵 素 を 選 ぶ。ただし、 隣 り 合 う 制 限 酵 素 サイトは 切 断 できないことが
あるので 避 けるようにする。
2. 目 的 配 列 を 挟 むようにプライマーを 設 定 し、それぞれのプライマーの 5’ 側 に 制
限 酵 素 サイトを 付 加 する。
N 末 端 側 は pCold TF DNA の 読 み 取 りフレームにインサートのフレームが 合 う
ように 目 的 配 列 と 制 限 酵 素 サイトの 間 の 塩 基 数 を 調 整 する。C 末 端 側 はストッ
プコドンに 直 接 制 限 酵 素 サイトを 付 加 してもよい。
3. 制 限 酵 素 サイトの 外 側 に 4 base 程 度 の 任 意 配 列 を 付 加 する。 多 くの 制 限 酵 素
は 認 識 配 列 の 外 側 に 数 bp 以 上 の 塩 基 がないと 切 断 効 率 が 悪 くなる。
プライマー 設 計 例
[pCold TF DNA の Nde I /Xho I サイトに 挿 入 する 場 合 ]
Nde I
Primer 1( 順 方 向 プライマー)5’ -GCCGCATATGAGCGATAAAATTATTCAC
任 意 配 列 チオレドキシン 由 来 配 列 * 1
Xho I *
Primer 2( 逆 方 向 プライマー)5’ - GCCGCTCGAGTTAGGCCAGGTTAGCGTC
任 意 配 列 チオレドキシン 由 来 配 列 * 2
* 1:Nde I サイトを 利 用 する 場 合 は、Nde I サイトの ATG にインサートの 開
始 コドン(ATG)を 合 わせるとよい。
* 2: 終 始 コドン(*)を 含 む 相 補 的 なチオレドキシンの 配 列 。
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2.インサートの 調 製
(1)PCR による 目 的 遺 伝 子 ( 約 350 bp)の 増 幅
高 い 正 確 性 を 持 つ High-Fidelity PCR 酵 素 (PrimeSTAR HS DNA Polymerase( 製 品
コード R010A)など)を 用 いて、PCR 反 応 を 行 う。
鋳 型 DNA(5 ng) * 1
1 μl
5×PrimeSTAR Buffer * 2
10 μl
dNTP Mixture(2.5 mM each) * 2
4 μl
Primer 1(10 ~ 50 pmol/μl)
1 μl
Primer 2(10 ~ 50 pmol/μl)
1 μl
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(5 U/μl) 0.5 μl
滅 菌 蒸 留 水
32.5 μl
Total
50 μl
* 1:プラスミドの 場 合 は 10 pg ~ 1 ng 程 度 、cDNA やゲノム DNA の 場 合 は
5 ~ 200 ng 程 度 使 用 する。
* 2:5×PrimeSTAR Buffer、dNTP Mixture は PrimeSTAR HS DNA Polymerase( 製
品 コード R010A)に 添 付 されている。
98℃ 10 sec.
55℃ 5 ~ 15 sec. 30 cycles
72℃ 1 min.
Thermal Cycler Dice( 製 品 コード TP600)を 用 いる 場 合
(2) 増 幅 産 物 の 確 認
PCR 反 応 液 5 μl を 用 いて 電 気 泳 動 を 行 い、 増 幅 サイズを 確 認 する。
(3) 増 幅 産 物 の 精 製
増 幅 産 物 が シ ン グ ル バ ン ド の 場 合 に は、 フ ェ ノ ー ル / ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 、
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up ( 製 品 コード 740609.10/.50/.250)を 用 いる
PCR Clean-up などのタンパク 質 除 去 操 作 を 行 う。
増 幅 産 物 に 複 数 のバンドがある 場 合 にはアガロースゲルからの 回 収 を 行 う。
(4) 増 幅 産 物 の 制 限 酵 素 切 断
精 製 を 行 ったインサート DNA を 制 限 酵 素 により 切 断 する。
1. 以 下 のものを 混 合 する。
インサート DNA
0.5 ~ 1 μg
10 × K Buffer 3 μl
Nde I(10 U/μl)
1 μl
Xho I(10 U/μl)
1 μl
滅 菌 蒸 留 水
X μl
Total
30 μl
2. 37℃で 1 時 間 保 温 する。
3. 反 応 液 をエタノール 沈 殿 などにより 精 製 する。 *
4. 電 気 泳 動 、 吸 光 度 測 定 (OD260)などにより、 回 収 したフラグメントのサイズ
と 濃 度 を 確 認 する。
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*: 制 限 酵 素 Nde I、Xho I はどちらもエタノール 沈 殿 により 失 活 させることが
できる。
エタノール 沈 殿 で 完 全 に 失 活 しない 制 限 酵 素 を 用 いた 場 合 にはフェノール 処
理 を 行 う。
また、アガロースゲルからの DNA 回 収 を 行 うと、 切 断 によって 生 じた 短 い
断 片 を 完 全 に 除 去 することができる。
[エタノール 沈 殿 の 手 順 ]
1. サンプルの 1/10 量 の 3M 酢 酸 ナトリウム(pH5.2)を 加 え 攪 拌 する。
2. サンプルの 2 ~ 2.5 倍 量 の 100% 冷 エタノールを 加 えてよく 攪 拌 し、− 20℃
で 30 分 以 上 放 置 する。
3. 4℃、12,000 rpm で 10 ~ 15 分 間 遠 心 し、 上 清 を 除 去 する。
4. 70% 冷 エタノールを 加 え、4℃、12,000 rpm で 5 分 間 遠 心 する。
5. 上 清 を 除 去 し、 風 乾 する。
6. 適 当 量 (10 ~ 50 μl 程 度 )の TE バッファーに 溶 解 する。
3.pCold TF DNA の 制 限 酵 素 切 断
増 幅 断 片 の 消 化 に 用 いた 制 限 酵 素 を 用 いてコールドショックベクター pCold TF DNA
を 消 化 し 精 製 する。 精 製 した DNA は TE バッファーに 溶 解 し、 吸 光 度 により DNA 濃
度 を 測 定 する。
1. 以 下 のものを 混 ぜる。
pCold TF DNA
1 μg
10 × K Buffer 3 μl
Nde I(10 U/μl)
1 μl
Xho I(10 U/μl)
1 μl
滅 菌 蒸 留 水
X μl
Total
30 μl
2.37℃で 1 ~ 2 時 間 保 温 する。
3. 反 応 液 をエタノール 沈 殿 により 精 製 する。 *
4. 適 量 の TE バッファーに 溶 解 する。
5. 吸 光 度 (OD260) 測 定 し、DNA 濃 度 を 計 算 する。
※ dsDNA の 場 合 、1 OD260 = 50 μg/ml より 濃 度 を 算 出
6.100 ng/μl となるように 濃 度 を 調 整 する。
*: 制 限 酵 素 切 断 後 、アルカリホスファターゼ [BAP( 製 品 コード 2120A)、CIAP( 製
品 コード 2250A)など]を 用 いた 脱 リン 酸 反 応 を 行 ってもよい。ただし、1 種 類
の 制 限 酵 素 のみで 切 断 した 場 合 には 必 ず 脱 リン 酸 反 応 を 行 う。
更 に、 切 断 により 生 じた 短 い 断 片 を 完 全 に 除 きたい 場 合 にはアガロースゲルから
の DNA 回 収 を 行 うとよい。
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4.pCold TF DNA へのインサート DNA の 挿 入 と 形 質 転 換
(1)Ligation 反 応
制 限 酵 素 消 化 したベクター 断 片 とインサート DNA を 混 合 し、DNA Ligation Kit
< Mighty Mix >( 製 品 コード 6023)を 用 いて 連 結 する。
ベクターとインサートの 使 用 量 は、モル 比 で 1 : 3 ~ 1 : 10 が 望 ましい。
1. 氷 上 で 以 下 のものを 調 製 する。
切 断 処 理 済 み pCold TF 100 ng( 約 0.03 pmol)
インサート DNA(0.1 ~ 0.3 pmol)
Ligation Mix
Total
1 μl
4 μl
5 μl
10 μl
2.16℃で 1 時 間 保 温 する。
(2)Ligation 反 応 液 10 μl を 用 いて 大 腸 菌 E. coli HST08 Premium Competent Cells( 製
品 コード 9128)100 μl を 形 質 転 換 し、100 μg/ml アンピシリンを 含 む LB 寒 天 培
地 上 で 生 育 させる。
1. E. coli HST08 Premium JM109 Competent Cells を 使 用 直 前 に 氷 中 で 融 解 する。
2. 100 μl のコンピテントセルに 10 μl の Ligation 反 応 液 を 加 え、 穏 やかに 攪 拌
する。
3. 氷 中 で 30 分 間 放 置 する。
4. 42℃で 45 秒 間 保 温 する。
5. 氷 中 で 1 ~ 2 分 間 放 置 する。
6. あらかじめ 37℃に 保 温 しておいた SOC 培 地 * を 最 終 1 ml になるように 加 える。
7. 37℃で 1 時 間 振 とうする。
8. アンピシリンを 含 む LB プレートに 適 量 をまき、37℃で 一 晩 培 養 する。
*: SOC 培 地 は E. coli HST08 Premium Competent Cells( 製 品 コード 9128)に 添
付 されている。
5.プラスミドの 調 製 と 確 認
得 られたコロニーをアンピシリンを 含 む LB 培 地 に 接 種 し、 一 晩 培 養 した 培 養 液 から
プラスミドを 調 製 する。
プラスミドの 調 製 には 市 販 のキットが 使 用 できる。
NucleoSpin® Plasmid QuickPure( 製 品 コード 740615.10/.50/.250)など
得 られたプラスミドを 制 限 酵 素 Nde I、Xho I で 切 断 した 後 、 電 気 泳 動 によりインサー
トの 有 無 を 確 認 する。
正 しいサイズのインサートを 持 つプラスミドが 確 認 できたら、シーケンス 反 応 により
インサートの 塩 基 配 列 を 確 認 し、 発 現 用 プラスミドとして 以 降 の 実 験 に 用 いる。
シーケンスには 下 記 のプライマー 配 列 が 利 用 できる。
上 流 側 pCold-TF-F1 5'-CCACTTTCAACGAGCTGATG
pCold-TF-F2 5'-GCGAAAGTGACTGAAAAAG
下 流 側 pCold-R 5'-GGCAGGGATCTTAGATTCTG
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VIII. 参 考 文 献
1)Qing, G., et al (2004) Nat. Biotechnol. 22, 877-882, 2004
2)Gerlind S., et al (1995), EMBO J. 14, 4939-4948,
IX. 関 連 製 品
< pCold ベクターシリーズ>
pCold DNA シリーズ( 製 品 コード 3360 ~ 3364)
pCold ProS2 DNA( 製 品 コード 3371)
< 組 換 えタンパク 質 の 可 溶 性 発 現 に>
Chaperone Competent Cells BL21 Set( 製 品 コード 9120)
Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21( 製 品 コード 9121)
Chaperone Competent Cell pGro7/BL21( 製 品 コード 9122)
Chaperone Competent Cell pKJE7/BL21( 製 品 コード 9123)
Chaperone Competent Cell pG-Tf2/BL21( 製 品 コード 9124)
Chaperone Competent Cell pTf16/BL21( 製 品 コード 9125)
TaKaRa Competent Cell BL21( 製 品 コード 9126)
Chaperone Plasmid Set( 製 品 コード 3340)
< E. coli コンピテントセル>
・ 発 現 用
TaKaRa Competent Cell BL21( 製 品 コード 9126)
・クローニング 用
E. coli HST08 Premium Competent Cells( 製 品 コード 9128)
E. coli DH5α Competent Cells( 製 品 コード 9057)
E. coli JM109 Competent Cells( 製 品 コード 9052)
E. coli HST08 Premium Electro-Cells( 製 品 コード 9028)
E. coli DH5α Electoro-Cells( 製 品 コード 9027)
E. coli JM109 Electoro-Cells( 製 品 コード 9022)
< Hisタグ 融 合 タンパク 精 製 関 連 試 薬 >
TALON® Metal Affinity Resin( 製 品 コード 635501 ~ 635504/635652/635653)
HisTALON Superflow Cartridge Purification Kit( 製 品 コード 635649/635681)
HisTALON Buffer Set( 製 品 コード 635651)
His60 Ni Superflow Resin( 製 品 コード 635659 ~ 635664)
His60 Ni Gravity Columns( 製 品 コード 635657)
His60 Ni Buffer Set( 製 品 コード 635665)
ほか 各 種
In-Fusion® HD Cloning Kit( 製 品 コード 639633 ~ 639650)
IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)( 製 品 コード 9030)
NucleoSpin® Plasmid QuickPure( 製 品 コード 740615.10/.50/.250)
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up ( 製 品 コード 740609.10/.50/.250)
タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 11
製 品 コード 3365

X. 注 意
・ 本 製 品 は 研 究 用 として 販 売 しております。ヒト、 動 物 への 医 療 、 臨 床 診 断 用 には 使
用 しないようご 注 意 ください。また、 食 品 、 化 粧 品 、 家 庭 用 品 等 として 使 用 しない
でください。
・ タカラバイオの 承 認 を 得 ずに 製 品 の 再 販 ・ 譲 渡 、 再 販 ・ 譲 渡 のための 改 変 、 商 用 製
品 の 製 造 に 使 用 することは 禁 止 されています。
・ ライセンスに 関 する 最 新 の 情 報 は 弊 社 ウェブカタログをご 覧 ください。
・ 本 説 明 書 に 記 載 されている 会 社 名 および 商 品 名 などは、 各 社 の 商 号 、または 登 録 済 み
もしくは 未 登 録 の 商 標 であり、これらは 各 所 有 者 に 帰 属 します。
1. 本 製 品 は、New Jersey 医 科 歯 科 大 学 よりライセンスを 受 け、タカラバイオ 株 式 会
社 が 製 造 販 売 しています。
2. 本 製 品 は 研 究 目 的 にのみ 使 用 が 許 可 されています。 本 製 品 または、 本 製 品 を 利 用
して 製 造 したものを 商 業 目 的 で 使 用 するには、 別 途 、 商 業 利 用 契 約 の 締 結 が 必 要
となります。
3. 該 当 する 製 品 、ライセンスは 以 下 の 通 りです。
1) New Jersey 医 科 歯 科 大 学 コールドショックベクターテクノロジーのライセ
ンス : Code.3360, 3361, 3362, 3363, 3364, 3365, 3371, 3372
2) New Jersey 医 科 歯 科 大 学 Protein S テクノロジーのライセンス : Code.3371
4. 本 製 品 、その 構 成 部 分 またはその 誘 導 体 、ならびにこれらで 製 造 されたものを 第
三 者 に 譲 渡 ( 無 料 配 布 、 販 売 )することはできません。 但 し、 本 製 品 の 購 入 により
既 にコールドショックベクターの 研 究 目 的 での 使 用 を 許 可 されている 第 三 者 に 対
しては、 別 途 、 譲 渡 を 行 う 者 とタカラバイオ( 株 )の 間 で 譲 渡 に 係 る 契 約 を 締 結 し
た 上 でこれらを 譲 渡 することができます。
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v201211Da_2