Retrovirus Constructive System Eco

製 品 コード 6164研 究 用Retrovirus ConstructiveSystem Eco説 明 書製 品 コード 6164 は 以 下 の 組 み 合 わせです。・レトロウイルス 調 製 細 胞 G3T-hi 細 胞 ( 製 品 コード 6163)・Retrovirus Packaging Kit Eco( 製 品 コード 6160)・RetroNectin®( 製 品 コード T100A)1 vial/ 袋1 箱1 箱v201403

目 次I. 本 製 品 の 使 用 について.......................................................................................................3II. 製 品 内 容 および 保 存 ...........................................................................................................3II-1. 製 品 内 容 ...................................................................................................................3II-2. 保 存 ............................................................................................................................3III. 製 品 説 明 ..................................................................................................................................4IV. 必 要 な 器 具 ・ 装 置 および 試 薬 .........................................................................................4IV-1. 器 具 ・ 装 置 ............................................................................................................4IV-2. 試 薬 ..........................................................................................................................5V. 細 胞 培 養 の 手 順 .....................................................................................................................5V-1. 凍 結 ストックからの 細 胞 培 養 .........................................................................5V-2. 細 胞 の 継 代 ..............................................................................................................5V-3. 細 胞 の 凍 結 ..............................................................................................................6VI. ウイルス 産 生 .........................................................................................................................6VI-1. 一 過 性 ウイルス 産 生 ..........................................................................................8VI-2.ウイルスの 力 価 測 定 ..........................................................................................9VII. レトロウイルスベクターを 用 いた 遺 伝 子 導 入 実 験 ................................................9VII-1.RetroNectin コートプレートの 準 備 ........................................................ 11VII-2.RetroNectin Bound Virus(RBV) 感 染 法 ................................................... 12VII-3. 遠 心 法 を 利 用 した RetroNectin Bound Virus(RBV) 感 染 法 ........ 12VII-4.Supernatant(SN) 感 染 法 .............................................................................. 13VIII. 参 考 文 献 ............................................................................................................................... 14IX. 関 連 製 品 ............................................................................................................................... 15X. 注 意 ........................................................................................................................................ 15タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 2製 品 コード 6164

I. 本 製 品 の 使 用 について本 製 品 をご 利 用 の 際 は、 以 下 の 点 にご 注 意 ください。1. 本 製 品 の 使 用 は 研 究 用 に 限 定 されています。 臨 床 目 的 での 使 用 および 生 体 外 診 断 に 使 用 することはできません。( 本 製 品 により 得 られた 生 物 材 料 を 第 三 者 に 譲 渡 することもできません。)また、 食 品 、 化 粧 品 、 家 庭 用 品 等 として 使 用 しないでください。2. 本 製 品 を 研 究 目 的 以 外 に 使 用 される 場 合 は、 事 前 に 弊 社 にお 問 い 合 わせください。 商 業 目的 に 使 用 される 場 合 は、 個 別 にライセンス 契 約 の 締 結 が 必 要 です。3. 本 製 品 によって 生 産 されるウイルス 上 清 液 は 挿 入 断 片 によっては 危 険 なウイルスを 含 む 恐れがあるため、 組 換 えレトロウイルスの 生 産 と 取 り 扱 いには、 適 切 な 処 置 をとる 必 要 があります。 本 製 品 の 使 用 には 文 部 科 学 省 の 定 める 省 令 (「 研 究 開 発 等 に 係 る 遺 伝 子 組 換 え 生物 等 の 第 二 種 使 用 等 に 当 って 執 るべき 拡 散 防 止 措 置 を 定 める 省 令 」 平 成 16 年 文 部 科 学 省 、環 境 省 令 第 一 号 )にある P2 レベル 以 上 の 施 設 が 必 要 です。 本 製 品 ご 利 用 の 際 は、 省 令 及び 組 織 内 の 委 員 会 の 指 示 に 従 い、 安 全 には 十 分 にご 注 意 ください。4. 本 製 品 の 使 用 によって 生 じたいかなる 事 故 、 損 害 についても、 弊 社 では 責 任 を 負 いかねますので、ご 了 承 の 上 ご 使 用 ください。II. 製 品 内 容 および 保 存II-1. 製 品 内 容II-2. 保 存Retrovirus Constructive System Eco( 製 品 コード 6164)[Component]・レトロウイルス 調 製 細 胞 G3T-hi 細 胞 2×10 6 cells/vial( 製 品 コード 6163)・Retrovirus Packaging Kit Eco( 製 品 コード 6160)・RetroNectin 0.5 mg(0.5 ml)( 製 品 コード T100A)レトロウイルス 調 製 細 胞 G3T-hi 細 胞 ................................. 液 体 窒 素 中 凍 結 保 存( 細 胞 の 輸 送 は- 80℃ドライアイス 梱 包 のため、 製 品 到 着 後 ただちに 液 体 窒 素 中 で保 存 してください。 液 体 窒 素 保 存 ができない 場 合 は、ただちに 細 胞 を 融 解 し、 培養 を 行 ってください。)Retrovirus Packaging Kit Eco..................................................- 20℃ 保 存RetroNectin ...................................................................................- 20℃ 保 存タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 3製 品 コード 6164

III. 製 品 説 明本 製 品 は、レトロウイルス 調 製 細 胞 G3T-hi 細 胞 、Retrovirus Packaging Kit Eco、RetroNectin *がセットになっており、 組 換 えレトロウイルスベクタープラスミドを 用 意 するだけで 組 換 えレトロウイルスの 調 製 から 標 的 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 までを 行 うことができるよう 構 成 されています。本 製 品 に 含 まれる G3T-hi 細 胞 は、ヒト 腎 臓 由 来 の 細 胞 株 293T にヒト N- アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ III 1) (N-acetylglucosaminyltransferase III;GnT-III)を 導 入 した GnT-III 高 発現 細 胞 株 です。ネオマイシン 耐 性 である 293T 細 胞 に、ハイグロマイシン 耐 性 遺 伝 子 を 用 いてヒト GnT-III 遺 伝 子 を 導 入 しています。本 細 胞 は 293T 細 胞 由 来 であるため、SV40 の T 抗 原 遺 伝 子 が 導 入 されており、この 働 きによってレトロウイルスの RNA が 増 幅 され、 高 力 価 ウイルス 液 が 得 られます 2) 。 本 細 胞 に、RetrovirusPackaging Kit Eco に 含 まれる gag-pol 発 現 ベクタ-プラスミドおよび env(エコトロピック) 発 現ベクタ-プラスミドと、 目 的 遺 伝 子 を 組 み 込 んだ 組 換 えレトロウイルスベクタ-プラスミドを 共導 入 することにより、 迅 速 かつ 一 過 性 にラット、マウスの 細 胞 に 感 染 可 能 な 高 力 価 の 組 換 えウイルスを 産 生 することができます。 通 常 、Retrovirus Packaging Kit を 用 いた 一 過 性 発 現 では 10 5 ~10 7 cfu/ml のウイルス 液 が 得 られます。また、 本 細 胞 は、 細 胞 膜 糖 鎖 が GnT-III により 修 飾 されることを 特 徴 とします。レトロウイルスは、 宿 主 細 胞 から 出 芽 する 際 、 宿 主 細 胞 膜 を 纏 った 形 で 出 芽 するため、 本 細 胞 を 用 いて 調 製 した組 換 えレトロウイルスでは 膜 タンパク 質 糖 鎖 が GnT-III により 修 飾 を 受 けていると 考 えられます。この 糖 鎖 修 飾 により、 本 細 胞 による 調 製 ウイルスは RetroNectin への 親 和 性 が 高 くなっており、RetroNectin 併 用 による 標 的 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 効 率 が 有 意 に 上 昇 することが 確 認 されています。特 に 血 球 系 細 胞 を 標 的 とした 遺 伝 子 導 入 に 有 効 です。* RetroNectin: ヒトフィブロネクチンの 細 胞 接 着 ドメイン、ヘパリン 結 合 ドメイン IIおよび CSI 部 位 を 含 む 組 換 えフィブロネクチン。IV. 必 要 な 器 具 ・ 装 置 および 試 薬IV-1. 器 具 ・ 装 置・ 安 全 キャビネット・ 細 胞 観 察 用 顕 微 鏡・ CO2 インキュベーター・ - 80℃フリーザー・ 滅 菌 済 ピペット・ フィルター 付 滅 菌 チップ・ 5 ml ポリスチレン 丸 底 チューブ・ 組 織 培 養 用 ゼラチンまたはコラーゲンコートシャーレ・ 0.45 μm 滅 菌 済 フィルター( 低 吸 着 タイプ)・ 2 ml 滅 菌 済 チューブ(ウイルス 保 存 用 )・ 電 動 ピペッター・ 細 胞 凍 結 容 器 (~ 1℃ / 分 の 温 度 低 下 可 能 なもの)(Nalgene Code 5100-0001 等 )タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 4製 品 コード 6164

IV-2. 試 薬・ 組 換 えレトロウイルスベクタープラスミド( 高 純 度 に 精 製 されたもの)・ DMEM 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine(Lonza Code. 12-604F/12-604Q)・ Fetal Bovine Serum (FBS)・ Penicillin-Streptomycin Mixture(Lonza Code. 17-602E)・ Trypsin-Versene (EDTA) Mixture (1×)(Lonza Code. 17-161E)・ Phosphate Buffered Saline(Lonza Code. 17-516Q、17-517Q)・ 細 胞 凍 結 保 存 液 (CELLBANKER 1; 製 品 コード CB011/CB013、10% DMSO/90% FBS 等 )・ ポリブレン( 臭 化 ヘキサジメトリン;Sigma Code H9268)・ 滅 菌 蒸 留 水V. 細 胞 培 養 の 手 順G3T-hi 細 胞 は 細 胞 凍 結 保 存 液 中 に 凍 結 保 存 された 状 態 でドライアイス(- 80℃) 詰 めにされてお手 元 に 届 きます。 製 品 が 到 着 しましたらただちに 液 体 窒 素 中 で 保 存 してください。 液 体 窒 素 中 で保 存 できない 場 合 は、ただちに 細 胞 を 融 解 し 以 下 の 手 順 で 培 養 を 行 ってください。V-1. 凍 結 ストックからの 細 胞 培 養(1)37℃に 温 めた 培 地 を 準 備 する(10% FBS/DMEM)。(2) 凍 結 細 胞 バイアルを 少 し 凍 結 塊 が 残 る 程 度 まで 37℃ 水 浴 中 で 速 やかに 融 解 する(バイアルの 口 は 浸 さないこと)。(3) 安 全 キャビネットまたはクリーンベンチ 内 で 培 地 1 ml をバイアル( 凍 結 細 胞 1 ml 入り)に 添 加 する。 混 合 液 を 15 ml 遠 心 管 に 移 す。(4)バイアルを 1 ~ 2 ml の 培 地 で 洗 浄 し、 遠 心 管 に 移 す。(5) 培 地 5 ml を 添 加 して 穏 やかに 撹 拌 し、120×g、3 分 間 、 遠 心 分 離 する。(6) 上 清 を 吸 引 除 去 し、 沈 殿 ( 細 胞 )を 10 ml の 培 地 で 懸 濁 し、10 cm 組 織 培 養 用 ゼラチンまたはコラーゲンコートシャーレに 移 し、37℃、5% CO2 の 条 件 下 で 培 養 を 開 始 する。通 常 、2 ~ 3 日 でコンフルエントになる。V-2. 細 胞 の 継 代コンフルエンシーが 70 ~ 80%に 達 した 細 胞 は 以 下 の 手 順 で 継 代 してください。2 ~ 3 日 毎 に 継 代 します( 組 織 培 養 用 10 cm シャーレの 場 合 * )。*: G3T-hi 細 胞 は 細 胞 融 解 後 、ゼラチンあるいはコラーゲンコートに 播 種 して 融 解 後の 細 胞 接 着 性 を 高 めます。これらの 細 胞 は、 凍 結 からの 回 復 後 は 通 常 の 組 織 培 養 用シャーレで 培 養 可 能 です。ただし 接 着 性 が 悪 い 場 合 はウイルス 産 生 なども 含 めた 全ての 培 養 に 細 胞 接 着 性 の 良 いゼラチンまたはコラーゲンコートシャーレを 使 用 することをお 勧 めします。(1)37℃に 温 めた 培 地 (10% FBS/DMEM)および PBS(-)を 準 備 する。(2) 培 地 を 吸 引 し、5 ml の PBS(-)で 細 胞 表 面 を 1 回 洗 浄 する。(3)1 ~ 2 ml のトリプシン- EDTA 液 を 加 え、37℃インキュベーター 内 で 3 分 間 静 置 する。(4) 顕 微 鏡 で 観 察 して 90% 以 上 の 細 胞 が 丸 くなっていることを 確 認 して、シャーレを 手のひら 等 に 軽 く 打 ちつけて 細 胞 を 分 散 させる。(5)5 ml の 培 地 を 添 加 し、ピペッティングにより 細 胞 を 分 散 させる。(6) 細 胞 数 を 計 数 し、2 ~ 4 × 10 4 cells/cm 2 になるように 新 しいシャーレに 播 く。(7)37℃、5% CO2 の 条 件 下 で 培 養 する。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 5製 品 コード 6164

V-3. 細 胞 の 凍 結再 生 可 能 な 細 胞 源 を 確 保 するため、 後 で 使 用 できるように 細 胞 凍 結 ストックを 作 製 しておきます。 凍 結 ストックは、できるだけ 細 胞 の 継 代 回 数 が 少 ない 状 態 で 作 製 することをお 勧めします。(1) 必 要 数 のシャーレに 細 胞 を 80%コンフルエントになるまで 増 殖 させる。(2) 37℃に 温 めた 培 地 (10% FBS/DMEM)および PBS(-)、 氷 冷 した 細 胞 凍 結 保 存 液(CELLBANKER 1、10% DMSO/90% FBS 等 )を 準 備 する。(3) 各 シャーレの 培 地 を 吸 引 し、5 ml の PBS で 細 胞 表 面 を 1 回 洗 浄 する。(4) 各 シャーレに 1 ~ 2 ml のトリプシン- EDTA 液 を 加 え、37℃インキュベーター 内 で3 分 間 静 置 する。(5) 顕 微 鏡 で 観 察 して 90% 以 上 の 細 胞 が 丸 くなっていることを 確 認 して、シャーレを 手のひら 等 に 軽 く 打 ちつけて 細 胞 を 分 散 させる。(6) 各 シャーレに 5 ml の 培 地 を 添 加 し、ピペッティングにより 細 胞 を 分 散 させ、 採 取 する。(7) 190 × g、3 ~ 5 分 間 、 遠 心 分 離 する。(8) 上 清 を 除 去 し、 適 当 量 の 培 地 に 細 胞 を 懸 濁 して 細 胞 数 を 計 数 する。(9) 190 × g、3 ~ 5 分 間 、 遠 心 分 離 する。(10) 氷 冷 した 細 胞 凍 結 保 存 液 に 2 × 10 6 cells/ml となるよう 細 胞 を 懸 濁 する。(11) 凍 結 バイアルに 1 ml/vial で 分 注 し、 細 胞 凍 結 容 器 (~ 1℃ / 分 で 温 度 低 下 )に 入 れて- 80℃で 一 晩 凍 結 する。(12) 翌 日 バイアルを 液 体 窒 素 に 移 す。(13)2 週 間 以 上 経 過 した 後 、 凍 結 ストックの 細 胞 生 存 率 を 確 認 するため 上 記 V-1. の 方 法に 従 って 細 胞 を 凍 結 融 解 し、 培 養 を 開 始 する。VI.ウイルス 産 生G3T-hi 細 胞 は、ヒト 293T 細 胞 由 来 です。 一 過 性 のトランスフェクションには、293T 細 胞 に 対して 優 れた 導 入 効 率 を 示 すリン 酸 カルシウム 法 が 適 しています 2) 。本 システムを 用 いてリン 酸 カルシウム 法 による 一 過 性 トランスフェクションを 行 った 場 合 、トランスフェクションから 48 時 間 後 の 上 清 を 回 収 することによって、 通 常 10 5 ~ 10 7 cfu/ml の 高 力価 ウイルス 液 を 得 ることができます( 図 1)。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 6製 品 コード 6164

図 1.Retrovirus Packaging Kit による G3T-hi 細 胞 を 用 いた 組 換 えレトロウイルスの 調 製 法 概 要(1)トランスフェクション 前 日 に G3T-hi 細 胞 を 準 備 する。(2) 目 的 遺 伝 子 を 挿 入 した 組 換 えレトロウイルスベクタープラスミドと、キット 添 付 のレトロウイルス gag-pol および env 発 現 ベクターを 添 付 試 薬 を 用 いてリン 酸 カルシウム法 にて co-transfection する。(3)トランスフェクションから 24 時 間 後 に 培 地 交 換 を 行 い、 更 に 24 時 間 後 、 培 養 上 清を 採 取 し 0.45 μm フィルターでろ 過 する。(4)ろ 液 をウイルス 溶 液 として 回 収 し、 回 収 したウイルス 液 は 小 分 けして- 80℃で 保 存する。(5)ウイルスの 力 価 測 定 を 行 う。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 7製 品 コード 6164

VI-1. 一 過 性 ウイルス 産 生[ 前 日 : 細 胞 準 備 ]G3T-hi 細 胞 を 6 cm ゼラチンまたはコラーゲンシャーレに 3×10 6 cells 播 く。[1 日 目 :トランスフェクション](1)Retrovirus Packaging Kit の 中 からベクター(pGP、pE-eco)、Chloroquine、 必 要数 量 の Transfection Buffer を 溶 解 する。(2)Transfection Buffer、 滅 菌 蒸 留 水 を 室 温 に 戻 す。(3)Chloroquine を 血 清 培 地 (10% FBS/DMEM)に 1,000 分 の 1 量 添 加 し、 培 地 を 37℃で 温 めておく。(4) 細 胞 が 70 ~ 80%コンフルエントであることを 確 認 し、Chloroquine 入 り 培 地3 ml と 交 換 する。(5)DNA 混 合 液 の 調 製 ( 以 下 の 溶 液 を 5 ml ポリスチレン 丸 底 チューブで 混 合 する。)組 換 えレトロウイルスベクタープラスミド(1 μg/μl 水 溶 液 ) 10 μlpGP Vector5 μlpE-eco Vector5 μl2 M CaCl2 62 μl滅 菌 蒸 留 水418 μl(6)リン 酸 カルシウム 沈 殿 の 作 製 およびトランスフェクション(6)-1. Transfection Buffer 500 μl をはかりとる( 電 動 ピペッターを 使 用 )。(6)-2 .(5)の 液 に 緩 やかに 加 える(チューブを 振 りながら 混 ぜる)。 添 加 後 、 直ちにピペッターの 排 出 を 利 用 してバブリングする(10 ~ 20 秒 )。(6)-3. 1 ~ 2 分 以 内 にシャーレに 均 一 に 滴 下 し、 培 地 と 混 合 する( 長 時 間 の 放置 は 大 きな 結 晶 形 成 の 原 因 となるためできるだけ 避 けること)。(6)-4. 37℃、5% CO2 インキュベーターで 培 養 する(7 ~ 11 時 間 )。( 顕 微 鏡 観 察 で 細 胞 に 粉 雪 が 降 りかかったような 状 態 が 見 えればリン 酸カルシウム 沈 殿 の 形 成 は 成 功 している。)(6)-5. トランスフェクションから 7 ~ 11 時 間 後 、シャーレから 培 地 3 ml を除 き、 新 たに 血 清 培 地 を 4 ml 加 える。[2 日 目 : 培 地 交 換 ]トランスフェクションから 24 時 間 後 、 培 地 を 交 換 する(10% FBS/DMEM、4 ml)[3 日 目 :ウイルス 液 回 収 ]トランスフェクションから 48 時 間 後 、 上 清 を 0.45 μm フィルターでろ 過 し、ウイルス 液 とする。 調 製 したウイルス 液 は 直 ちに 使 用 しない 場 合 、 小 分 けして- 80℃ 保存 し、 凍 結 融 解 の 繰 り 返 しを 避 ける。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 8製 品 コード 6164

VI-2.ウイルスの 力 価 測 定上 記 VI-1. で 採 取 したウイルス 液 中 の 感 染 性 ウイルス 粒 子 数 を 見 積 もるため、ウイルスの力 価 測 定 を 行 います。これにより 細 胞 に 対 する 感 染 性 ウイルスの 相 対 量 (multiplicity ofinfection;M.O.I.)が 推 定 され、 標 的 細 胞 に 適 切 な 導 入 条 件 を 決 定 することができます。ウイルスの 力 価 測 定 には、 一 般 的 に、NIH/3T3 細 胞 が 広 く 利 用 されています。ここではネオマイシン 耐 性 遺 伝 子 を 利 用 した 6 ウェルプレートでの 力 価 測 定 法 を 示 します。[ 前 日 : 細 胞 準 備 ]標 的 細 胞 (NIH/3T3 など)を 6 ウェルプレートに 5×10 4 cells/ ウェルで 播 種 する。[1 日 目 : 感 染 ](1)37℃に 温 めた 培 地 (10% FBS/DMEM)を 準 備 する。(2)ポリブレン 9 μg/ml 含 有 の 培 地 を 調 製 し、 細 胞 の 培 地 を900 μl/ウェルと 交 換 する。(3)ウイルス 上 清 を 培 地 で 10 1 ~ 10 5 倍 に 希 釈 し、それぞれ 100 μl をウェルに 添 加して 感 染 させる。ポリブレン 終 濃 度 は 8 μg/ml、 最 終 ウイルス 希 釈 倍 率 は 10 - 2~ 10 - 6 となる。(4)37℃、5% CO2 インキュベーターで 4 ~ 6 時 間 培 養 後 、ポリブレン * を 希 釈 するために 1 ml の 培 地 を 加 える。*:ポリブレンに 過 剰 に 曝 すと 細 胞 毒 性 を 示 すことがあります。[2 日 目 : 培 地 交 換 ]培 地 を G418(400 ~ 800 μg/ml)を 含 む 培 地 (10% FBS/DMEM)と 交 換 し、 以 後 3 ~4 日 おきに G418 含 有 培 地 と 交 換 する。[ 約 2 週 間 後 : 細 胞 のコロニー 染 色 ]細 胞 をメチレンブルー 液 、ギムザ 液 などで 染 色 し、コロニーを 計 数 し、 力 価 を 算 出 する。力 価 (cfu/ml)=( 得 られたコロニー 数 )×( 希 釈 倍 率 )ここでは、メチレンブルーによるコロニー 染 色 を 示 す。(1)0.2%メチレンブルー/メタノール 溶 液 と PBS(-)を 準 備 する。(2) 細 胞 の 培 地 を 吸 引 し、1 ml の PBS(-)で 1 回 洗 浄 する。(3)PBS(-)を 吸 引 し、 細 胞 を 風 乾 する。(4)0.2%メチレンブルー/メタノール 溶 液 を 0.5 ml/ ウェルで 添 加 し、 室 温 で 10 ~15 分 静 置 する。(5)メチレンブルー 染 色 液 を 除 き、 水 道 水 等 の 流 水 を 利 用 して 洗 浄 後 、 風 乾 する。(6)コロニーカウンター 等 を 利 用 して 細 胞 のコロニーを 計 数 する。※ MLV ベースのレトロウイルスベクターを 用 いた 場 合 、Retrovirus Titer Set (for RealTime PCR)( 製 品 コード 6166)を 用 いると、リアルタイム RT-PCR により 迅 速 に 力 価 (RNAタイター)を 測 定 することが 可 能 である。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 9製 品 コード 6164

VII.レトロウイルスベクターを 用 いた 遺 伝 子 導 入 実 験G3T-hi 細 胞 は 293T 細 胞 由 来 であるため、SV40 の T 抗 原 遺 伝 子 が 導 入 されています。この 働 きにより、レトロウイルスの RNA が 増 幅 され、 高 力 価 ウイルス 液 が 得 られます。したがって、 本細 胞 から 調 製 されたウイルスは、 力 価 測 定 法 でも 示 したポリブレン 法 を 用 いて 遺 伝 子 導 入 することが 可 能 ですが、RetroNectin を 用 いることにより( 図 2)、 標 的 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 効 率 を 有 意に 向 上 させることが 可 能 です。これは 標 的 細 胞 あたりの 感 染 ウイルス 粒 子 数 を 揃 えて 行 った 感 染実 験 により 示 されています(13 ページ 図 3)。また、 血 球 系 の 浮 遊 細 胞 は 一 般 的 にポリブレン 法での 遺 伝 子 導 入 効 率 が 悪 いため、RetroNectin を 用 いた 方 法 を 推 奨 しています 4 - 7) 。(A)ウイルスの 容 器 への 固 定ウイルス 感 染▼感 染 細 胞 の 培 養組 換 えレトロウイルス 液 を 添 加上 清 を 除 去37℃で 4 ~ 6 時 間 静 置または32℃、1,000 ~ 2,000 ×gで 2 時 間 遠 心標 的 細 胞 添 加 培 養各 種 遺 伝 子導 入 解 析 へRetroNectin コート 容 器(B)ウイルス 感 染▼感 染 細 胞 の 培 養組 換 えレトロウイルスと標 的 細 胞 を 一 緒 に 添 加培 養各 種 遺 伝 子導 入 解 析 へ組 換 えレトロウイルス感 染 阻 害 物 質標 的 細 胞図 2.RetroNectin を 用 いた 標 的 細 胞 への 感 染 法 概 要タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 10製 品 コード 6164

(A)-1.RetroNectin Bound Virus(RBV) 感 染 法(1)RetroNectin コートプレートに 組 換 えレトロウイルスを 添 加 し、37℃、5% CO2 インキュベーターで 4 ~ 6 時 間 静 置 する。(2) 上 清 を 除 去 した 後 、1 × PBS(-)で 一 回 洗 浄 し、 細 胞 懸 濁 液 を 添 加 する。(3)37℃、5% CO2 インキュベーターで 培 養 する。(4) 感 染 後 、 目 的 に 応 じた 遺 伝 子 導 入 解 析 等 を 行 う。(A)-2. 遠 心 法 を 利 用 した RetroNectin Bound Virus(RBV) 感 染 法(1)96 ウェルプレート 対 応 遠 心 機 を 1,000 ~ 2,000×g、32℃にセットして 運 転 しておき、チャンバー 内 を 32℃に 加 温 しておく( 加 温 機 能 がなくても 発 熱 により32℃に 加 温 できる)。(2)RetroNectin コートプレートに 組 換 えレトロウイルスを 添 加 し、32℃、1,000 ~2,000 × g、2 時 間 遠 心 する。(3) 上 清 を 除 去 した 後 、1 × PBS(-)で 洗 浄 し、 細 胞 懸 濁 液 を 添 加 する。(4)37℃、5% CO2 インキュベーターで 培 養 する。(5) 感 染 後 、 目 的 に 応 じた 遺 伝 子 導 入 解 析 等 を 行 う。(B)Supernatant(SN) 感 染 法(1) 標 的 細 胞 をウイルス 希 釈 液 で 懸 濁 する。(2)RetroNectin コートプレートに(1)の 細 胞 懸 濁 液 を 添 加 する。(3)37℃、5% CO2 インキュベーターで 培 養 する。(4) 感 染 後 、 目 的 に 応 じた 遺 伝 子 導 入 解 析 等 を 行 う。VII-1.RetroNectin コートプレートの 準 備(24 ウェル RetroNectin コートプレートの 作 製 例 )(1)RetroNectin 溶 液 (1 mg/ml)を 融 解 し 均 一 になるように 混 合 する。(ボルテックスによる 撹 拌 は 避 けてください。)(2)RetroNectin 溶 液 を PBS で 希 釈 して 20 μg/ml に 調 製 する。(3) 表 面 未 処 理 24 ウェルプレートに、1 ウェルあたり 500 μl の RetroNectin/PBS 溶 液 を添 加 し(5 μg/cm 2 )、 室 温 2 時 間 または 4℃で 一 晩 放 置 する。(4)RetroNectin/PBS 溶 液 を 除 去 し、2% BSA/PBS を 1 ウェルあたり 500 μl 添 加 して 室 温にて 30 分 間 ブロッキングする。(5)ブロッキング 溶 液 を 除 去 し、1 ウェルあたり 500 μl の PBS で 1 回 洗 浄 し、PBS を 除去 した 状 態 で 保 存 する。このプレートを RetroNectin コートプレート * とする。*: 容 器 のふたをパラフィルム 等 でシールした 場 合 、RetroNectin コートプレートは 4℃で 1 週 間 の 保 存 が 可 能 です。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 11製 品 コード 6164

VII-2.RetroNectin Bound Virus(RBV) 感 染 法採 取 した 調 製 ウイルス 液 は 細 胞 の 培 養 上 清 です。このためウイルス 液 中 には 培 養 上 清 中 の夾 雑 物 質 が 含 まれています。 感 染 にウイルス 原 液 を 用 いた 場 合 、この 夾 雑 物 質 中 に 含 まれる 感 染 阻 害 物 質 により、 期 待 される 遺 伝 子 導 入 効 率 が 得 られない 可 能 性 があります。このような 場 合 は RBV 感 染 法 が 推 奨 されます。 本 感 染 方 法 では、 得 られたウイルスを、ウイルス 結 合 活 性 をもつ RetroNectin に 結 合 させた 後 、 洗 浄 操 作 を 行 うため、 感 染 阻 害 物 質 を除 去 することが 可 能 です。 得 られたウイルスを 4 ~ 10 倍 以 上 に 希 釈 して 用 いる 場 合 は、次 項 に 示 す SN 感 染 法 でも 同 等 の 遺 伝 子 導 入 効 率 が 得 られますが、ウイルスベクターの 力価 や 標 的 細 胞 によっても 阻 害 の 影 響 は 異 なってくるため、 安 定 な 導 入 効 率 を 得 るには RBV感 染 法 を 推 奨 しています。[VII-1. で 示 した 24 ウェル RetroNectin コートプレートを 用 いる 場 合 ](1)ウイルス 液 を 必 要 に 応 じて 血 清 培 地 等 で 希 釈 し、1 ウェルあたり 250 ~ 500 μl のウイルス 液 を 添 加 する。(2) 37℃、5% CO2 インキュベーターで 4 時 間 静 置 し、RetroNectin 上 へのウイルス粒 子 の 吸 着 を 促 す。(3) RetroNectin 上 に 結 合 させたウイルスが 乾 燥 しないように 注 意 しながら、ウイルス 液 を 除 去 し、1 ウェルあたり 500 μl の PBS を 添 加 して 洗 浄 する。(4) 標 的 細 胞 の 懸 濁 液 を 調 製 し、1 ウェルあたり 1 ~ 5×10 4 個 となるように 添 加 する。( 注 ) 細 胞 密 度 は、 実 験 の 目 的 に 応 じて 標 的 細 胞 が RetroNectin に 接 着 する 範囲 で 実 施 してください。(5) 37℃、5% CO2 インキュベーターで 培 養 する。VII-3. 遠 心 法 を 利 用 した RetroNectin Bound Virus(RBV) 感 染 法レトロウイルスベクターの 力 価 が 十 分 高 い 場 合 、VII-2. で 示 したように、 静 置 によってRetroNectin 上 へのウイルスの 吸 着 を 促 すことも 可 能 です。しかし、レトロウイルスベクターの 力 価 が 低 い 場 合 、あるいはより 高 効 率 に 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 を 行 いたい 場 合 には、次 に 示 すような 遠 心 による RetroNectin 上 へのウイルス 結 合 法 も 有 効 です。この 場 合 、レトロウイルスベクターを 結 合 させる 時 間 は 静 置 の 場 合 の 4 ~ 6 時 間 から 2 時 間 へ 短 縮 することが 可 能 です。この 方 法 では 32℃、1,000 ~ 2,000 × g、2 時 間 の 遠 心 に 耐 え 得 る 容 器 が 必 要 で、たとえばノントリートマルチウェルプレートやポリスチレン 遠 心 管 、ポリプロピレン 遠 心 管 が 使用 できますが、エアロゾルの 発 生 があり 得 ることを 十 分 注 意 して 封 じ 込 めの 措 置 を 講 じて使 用 してください。[VII-1. で 示 した 24 ウェル RetroNectin コートプレートを 用 いる 場 合 ](1) 96 ウェルプレート 対 応 遠 心 機 を 1,000 ~ 2,000×g、32℃にセットして 運 転 しておき、チャンバー 内 を 32℃に 加 温 しておく( 加 温 機 能 がなくても 発 熱 により32℃に 加 温 できる)。(2) ウイルス 液 を 必 要 に 応 じて 血 清 培 地 等 で 希 釈 し、1 ウェルあたり 250 ~ 1,000 μlのウイルス 液 を 添 加 する( 遠 心 力 をかけてウイルスを 沈 降 させるため、 液 量 が 多いほど、 高 効 率 の 遺 伝 子 導 入 が 期 待 できる)。 遠 心 機 にセットし、32℃、1,000 ~2,000 × g、2 時 間 遠 心 し、RetroNectin 上 へのウイルス 粒 子 の 結 合 を 促 す。(3) RetroNectin 上 に 結 合 されたウイルスが 乾 燥 しないように 注 意 しながら、ウイルス 液 を 除 去 し、1 ウェルあたり 500 μl の PBS を 添 加 して 洗 浄 する。(4) 標 的 細 胞 の 懸 濁 液 を 調 製 し、1 ウェルあたり 1 ~ 5×10 4 個 となるように 添 加 する。( 注 ) 細 胞 密 度 は、 実 験 の 目 的 に 応 じて 標 的 細 胞 が RetroNectin に 接 着 する 範囲 で 実 施 してください。(5) 37℃、5% CO2 インキュベーターで 培 養 する。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 12製 品 コード 6164

VII-4.Supernatant(SN) 感 染 法得 られたウイルス 液 を 原 液 で 使 用 する 場 合 は、 上 記 VII-2. で 示 した RBV 感 染 法 を 推 奨 していますが、4 ~ 10 倍 以 上 に 希 釈 して 用 いる 場 合 には 本 SN 感 染 法 で、RBV 感 染 法 と 同 等の 遺 伝 子 導 入 効 率 を 得 ることができます。 状 況 に 応 じて 選 択 してください。SN 感 染 法 はRBV 感 染 法 と 比 較 し、ウイルス 感 染 に 要 する 時 間 が 非 常 に 短 縮 されているのが 特 徴 です。なおウイルスベクターの 力 価 や 標 的 細 胞 によっては 希 釈 したウイルスでも 阻 害 の 影 響 が 出る 場 合 がありますのでご 注 意 ください。[VII-1. で 示 した 24 ウェル RetroNectin コートプレートを 用 いる 場 合 ](1) 標 的 細 胞 を 血 清 培 地 で 希 釈 したウイルス 液 で 0.2 ~ 1×10 5 cells/ml に 調 製 する。(2) RetroNectin コートプレートの 1 ウェルに 上 記 の 細 胞 懸 濁 液 500 μl を 添 加 する。( 注 ) 細 胞 密 度 は、 実 験 の 目 的 に 応 じて 標 的 細 胞 が RetroNectin に 接 着 する 範囲 で 実 施 してください。(3) 37℃、5% CO2 インキュベーターで 培 養 する。【ウイルス 調 製 細 胞 、 感 染 方 法 の 違 いによる 遺 伝 子 導 入 効 率 の 比 較 】40NIH/3T3 細 胞70HT1080 細 胞50A375M 細 胞12*K-562 細 胞25*TF-1 細 胞遺 伝 子 導 入 効 率 (%)35302520151056050403020104540353025201510510864220151050000035MKN-1 細 胞25MDA-MB-435S 細 胞20293 細 胞遺 伝 子 導 入 効 率 (%)30252015105201510518161412108642293T 細 胞 (ポリブレン)G3T-hi 細 胞 (ポリブレン)293T 細 胞 (RetroNectin)G3T-hi 細 胞 (RetroNectin)*: 血 球 系 細 胞 の 場 合 、ポリブレン 法 での遺 伝 子 導 入 は 非 常 に 低 いレベルでした。000図 3.293T 細 胞 と G3T-hi 細 胞 を 用 いて 調 製 したウイルス 液 の 各 種 標 的 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 効 率 の 比 較(Retrovirus Packaging Kit Ampho 使 用 )GFP 遺 伝 子 を pDON-AI DNA に 挿 入 した 組 換 えレトロウイルスベクタープラスミド pDON-AI-GFP を、Retrovirus Packaging Kit Ampho を 用 いて 293T 細 胞 と G3T-hi 細 胞 に 導 入 し、 一 過 性 にウイルス 液 を 調製 した。 力 価 測 定 は NIH/3T3 細 胞 を 用 いてポリブレン 法 にて 行 った。それぞれ M.O.I.(multiplicity ofinfection)= 0.2 の 条 件 で、MKN-1 細 胞 、HT1080 細 胞 、293 細 胞 、NIH/3T3 細 胞 、MDA-MB-435S 細 胞 、A375M 細 胞 ならびに 血 球 系 細 胞 である K562 細 胞 、TF-1 細 胞 へ、ポリブレン 法 および RetroNectin を 用いた Supernatant(SN) 感 染 法 で 感 染 させた。3 日 後 にフローサイトメーターで GFP 陽 性 細 胞 率 を 測 定 し、遺 伝 子 導 入 効 率 を 算 出 した。G3T-hi 細 胞 を 用 いて 調 製 したウイルスは、GnT-III によってウイルス 膜 表 面に 糖 鎖 修 飾 をうけることにより、RetroNectin への 親 和 性 が 向 上 し、 標 的 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 効 率 が 上昇 することが 示 された。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 13製 品 コード 6164

VIII. 参 考 文 献1) Ihara, Y., Nishikawa, A., Tohma, T., Soejima, H., Niikawa, N. and Taniguchi, N. (1993) cDNAcloning, expression, and chromosomal localization of human N-acetylglucosaminyltransferaseIII (GnT-III) . J. Biochem. 113, 692-698.2) Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L. and Baltimore, D. (1993) Producion of high-titer helper-freeretroviruses by transient transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 8392-8396.3) Kimizuka, F., Taguchi, Y., Ohdate, Y., Kawase, Y., Shimojo, T., Hashino, K., Kato, I., Sekiguchi,K., and Titani, K. (1991) Production and characterization of functional domains of humanfibronectin expressed in Escherichia coli. J. Biochem. 110, 284-291.4) Hanenberg, H., Xiao, XL., Dilloo, D., Hashino, K., Kato, I., and Williams, DA. (1996) Colocalizationof retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transductionof mammalian cells. Nat. Med. 2, 876-882.5) Hanenberg, H., Hashino, K., Konishi, H., Hock, RA., Kato, I., and Williams, DA. (1997)Optimization of fibronectin-assisted retroviral gene transfer into human CD34 + hematopoieticcells. Hum. Gene Ther. 8, 2193-2206.6) Chono, H., Yoshioka, H., Ueno, M. and Kato, I. (2001) Removal of inhibitory substance withrecombinant fibronectin-CH-296 plates enhances the retroviral transduction efficiency ofCD34 + CD38 - bone marrow cells. J. Biochem. 130, 331-334.7) BIO VIEW 47 号 13 ~ 15 ページタカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 14製 品 コード 6164

IX. 関 連 製 品細 胞 凍 結 保 存 液 :CELLBANKER 1( 製 品 コード CB011/CB013)レトロウイルスベクタープラスミド:pDON-5 Neo DNA( 製 品 コード 3657)pDON-5 DNA( 製 品 コード 3658)pDON-AI-2 Neo DNA( 製 品 コード 3653)pDON-AI-2 DNA( 製 品 コード 3654)pMEI-5 Neo DNA( 製 品 コード 3655)pMEI-5 DNA( 製 品 コード 3656)siRNA 発 現 用 レトロウイルスベクター:pSINsi-hH1 DNA( 製 品 コード 3660)pSINsi-hU6 DNA( 製 品 コード 3661)pSINsi-mU6 DNA( 製 品 コード 3662)ダブルノックアウトタイプの siRNA 発 現 用 レトロウイルスベクター:pSINsi-DK I DNA Set( 製 品 コード 3663)pSINsi-DK II DNA Set( 製 品 コード 3664)標 的 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 :Retrovirus Constructive System Ampho( 製 品 コード 6165)Retrovirus Packaging Kit Eco( 製 品 コード 6160)Retrovirus Packaging Kit Ampho( 製 品 コード 6161)RetroNectin® (Recombinant Human Fibronectin Fragment)( 製 品 コード T100A/B)RetroNectin® Dish (RetroNectin Pre-coated Dish, 35 mmφ)( 製 品 コード T110A)レトロウイルスの 力 価 測 定 試 薬 :Retrovirus Titer Set(for Real Time PCR)( 製 品 コード 6166)X. 注 意・ 本 製 品 は、 研 究 用 試 薬 です 。 ヒト、 動 物 への 医 療 、 臨 床 診 断 には 使 用 しないようご 注 意ください。また、 食 品 、 化 粧 品 、 家 庭 用 品 等 として 使 用 しないでください。・ タカラバイオの 承 認 を 得 ずに 製 品 の 再 販 ・ 譲 渡 、 再 販 ・ 譲 渡 のための 改 変 、 商 用 製 品 の製 造 に 使 用 することは 禁 止 されています。・ ライセンスに 関 する 最 新 の 情 報 は 弊 社 ウェブカタログをご 覧 ください。・ RetroNectin はタカラバイオ 株 式 会 社 の 登 録 商 標 です。その 他 、 本 説 明 書 に 記 載 されている 会 社 名 および 商 品 名 などは、 各 社 の 商 号 、または 登 録 済 みもしくは 未 登 録 の 商 標 であり、これらは 各 所 有 者 に 帰 属 します。タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 15製 品 コード 6164

NOTICE TO PURCHASER:LIMITED LICENSE[L9] RetroNectin®A method to increase the efficiency of retrovirus mediated gene transfer (covered by the claims of U.S. Patent No.5,686,278, 6,033,907, 7,083,979, and 6,670,177 and their foreign counterpart patent claims)is licensed to TAKARABIO INC. exclusively and worldwide.[M87] Cell for producing retrovirus vectorThis product is the subject of the pending JP patent application and its foreign counterparts.v201403