CIENCIA - Consejo Superior de Investigaciones Científicas

ESTUDIO MICROAUTORRADIOGRAFICO
DE LA SÍNTESIS CUTÁNEA DEL COLESTEROL
El coleslerol es un compuesto normal de la
piel y ésta es «apa/ «!«• sinleli/arlo n Rían el i-
ciencia como lo demuesiran los Haba jos de Srere
(I), Nicolaides (2, .H) y de Fletcher y Myam (4).
II objeto del présenle trabajo es la locali/a-
t ion histológica del sitio donde se produce la
síniesis del coleslerol en la piel, asi tomo pre­
sentar una técnica sencilla aplicable a este tipo
de estudios.
MMIKIAI. 1 sitiónos
1.a piel se ohliiMi bajo anestesia ion élet ile la rexión
alielominal de ralas hembra del tipo Wistar cuso
peto eia de 150 a 201) g. I.a piel fue cortada en iiecpieñas
liras de 1 X 3 DH evitando al tejido ftdlpOtO subcutáneo
pero sin tratar de separar la dermis de la epidermis.
Porciones de 1 g de la piel así obtenida fueron
sumergidas en frascos de incubación ion 10 mi de una
solución reguladora de fosfalo de Krebs a pll 7.1. modificado
al igualar la concentración de iones de sodio y
de potasio. Como precursor radiactivo fue empleado
(I-O 1*)-acetato de sodio (obtenido del Kacliocbemical
I entre, Amersham, Inglaterra). El acetato de sodio radiactivo
fue añadido ionio solución isotóuica en sufiliente
cantidad para obtener una concentración de 70 ug
por giaino de lejiclo. I.a actividad csiiceífica del acetato
al ser añadido a los frascos fue de 17 pe jcmole. 1.a
incubación fue llevada a callo durante dos horas en un
bailo de Warhiug a S7°.
Al finalizar la incubación 2 g de tejido fueron extraídos
en caliente en un sistema de reflujo con 100 mi de
una me/i la de éter-acetona (1:1) durante 0 horas. 50 mi
del extracto en éter-aectona fueron utili/ados para la determinación
del coleslerol total y 50 mi para la determinación
del coleslerol no csterifirado.
Coleslerol total.—Fue aislado en la forma de digitoniiro
según el método de t.oulcl et al. (5). 50 mi del extracto
en éter-acetona fueron concentrados basta sequedad
y el precipitado, redisuelto en 10 mi de etanol al
50%. fue saponificado añadiendo I mi de una .solución
satinada de hidróxido de sodio c incubando a -10' du
i.inie I horas, al rabo de las cuales la fractióu insapoiiificable
fue extraída con 20 mi de éter de petróleo en
dos ocasiones. F.l extracto en éter de petróleo fue concentrado
basta secpiedacl y redisuelto en 0 mi de acetona
con unas gotas de ácido acético: después fue calentado
a 30° y me/e lado con 3 mi de una solución al 5% de
digilonina en etanol. Veinte horas después se- determinó
la cantidad de digilonuro de colestcrol y MI radianiv¡dad.
Coleslerol Ubre.—50 mi del extracto en éter-acetona
fueron concentrados a secpiedacl y el precipitado redisuelto
en 10 mi de éter de petróleo para ser extraído
después con 20 mi de etanol al 50% en lies ocasiones
consecutivas, después de lo nial fue concentrado a sequedad
v redisuelto cu fi niI de acetona con unas gotas de
ácido acético. Fsie extracto fue calentado a -10' durante
I horas, al calió de las cuales se precipitó con una solu­
CIEN ( I A
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ción de clÍKÍioiuii.1 al V,. en etanol. Veinte huras después
se determinó la utilidad de digilonuro de coles
ICSOl v MI radiactividad.
tlhlriitioli ilil \orii\ntndo \ lirttiinioai nin ilr lu raitiaitii'iitail.
F.n una plam líela condal de plástico, de
113 muí de área v con niificios en la liase. «• deposito
un paiiel filtm Whaliiiami N" I de apioxiinailamenle
la IIIIMII.I áiea. Después de pe-sai la plancheta \ el papel
juntos, se filiic'i a través de ellos el tiiiilcnitlo de los
IIIIMIS de ensayo en los cpie *e verificó la precipitación
con digilonina, teniendo iniciado en ipie el precipitado
se distribuyese en el pajM-l liltro de modo uniforme; la
filtiatiéin se continuó con 4 a li mi de acciona manteniendo
la succión hasta la Mipieilad completa del precipitado.
Se ODtUVO el |ieso de la plánchela y se dedujo
la canhelad de digilonuro de colesieml JMII el método
Kiaviinétrico de Windaus (0).
I .i radiactividad fue determinada en dichas planchelas
con un detecten de (K-iger de semana de mica delgada
(1.7 mg «ni») (t.ciger F.IIM2 H. C.F.C. Research
l.ali.) FI eirui estadístico en el conceo fue menor al 3%.
Ina fuente radiactiva de C" (10,3 pc'g) fue utili/acla
ionio pailón \ su actividad fue medida ante» y después
de cada serie de esliiuaciones. Como el espesor de la
tapa de digitoniiio de coleslerol lesulléi lo suficientemente
grande ¡.. 11. • absolver parle de las p-uiuulas |i
emitidas luir el C", sin sel suficiente paia entrar en el
giado de espesor iiitinito, fue necesario oblenei previamente
una curva de aum-absorción paia el C" en un
medio de digiliiiiiirii de coleslerol. con la ipie si- obtuvo
la corrección necesaria |iara calcular la radiactividad
total del contenido ele la» plánchelas y. conociendo su
peno, la actividad rcix-c (iica.
Determinación de la tinlesis del coleslerol.—ta cantidad
de coleslerol linteli/aclo a partir del acetato mariachi
ixir I g de tejido (luíanle el tiempo de incubación
fue calculado de la siguiente manera:
1.a actividad cspcctlica del digilonuro de coleslerol
es igual a
- £ ftc/g
donde C = cuentas por minino a espesor infinito de la
muestra
\ K — actividad en el patrón,
la producción toi.il de digilonuro es igual a
Teso molecular del digilonuro
— 1* X ug
Peso moleculai del coleslerol
PC. 1002 X 10"'
cantidad de precursor en pe que aparece como digitoniiro
donde I' = ciniceiitración de coleslerol en el tejido en
ug/g de tejido.
Tomando en cuenta la actividad específica del precursor
en pe unióle, la producción total de digitoiiuro en
limóles es igual a
PC 1002 x 10-*
= X limóles
KS 3H7