Estación Experimental de Aula Dei - CSIC - Consejo Superior de ...

2.8.2 Fluorescencia
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Materiales y Métodos
Los fluoróforos de la cadena peptídica de las proteínas son el triptófano y, en
menor medida, la tirosina y la fenilalanina. Al irradiar la proteína a la longitud de onda
adecuada estos residuos absorben energía (se excitan), relajándose a continuación por
diversos mecanismos, en particular por emisión de luz de menor frecuencia
(fluorescencia). Esta diferencia entre la frecuencia de absorción y de emisión se
denomina “Stokes shift”. Algunos cofactores de las cromoproteínas también pueden
absorber luz y emitirla en forma de fluorescencia.
La afinidad de la unión de Cu + a la proteína recombinante pura GmCCS (2 μM)
se analizó también mediante fluorescencia. La titulación se llevó a cabo en tampón A
(apartado 2.8.1). Antes de la titulación, las disoluciones de trabajo se incubaron varios
min bajo una atmósfera de argón. Se midió la fluorescencia intrínseca del triptófano
excitando a 290 nm y registrando el espectro de 300 a 400 nm. Como blanco se utilizó
el tampón. Los espectros de fluorescencia se obtuvieron a 25 ºC en un
espectrofluorímetro Aminco-Bowman Series 2. Este trabajo se ha realizado en
colaboración con la profesora Milagros Medina del Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza.
2.8.3 Dicroísmo circular
La técnica de dicroísmo circular (DC) mide la diferencia entre la absorbancia de
luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha. Cualquier región del espectro
donde la proteína o sus cofactores absorban luz puede presentar, en principio, señal de
DC. En el UV-lejano se puede observar la organización espacial de los enlaces
peptídicos (los distintos elementos de estructura secundaria presentan espectros
diferentes en la zona de 200 a 250 nm). En el UV-cercano se mide la asimetría de los
residuos aromáticos inducida por el entorno. Por último, en el Vis se pueden observar
los cambios en el entorno de los cofactores que absorban en esta zona del espectro.
Se midió el DC en el UV-lejano entre 190 y 250 nm, utilizando una cubeta de
0´1 cm a 25 ºC en un espectropolarímetro Chirascan (Applied Photophysics Ltd). Este
trabajo se ha realizado en colaboración con la profesora Milagros Medina del
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de
Zaragoza. Para ello, se dializó la proteína recombinante pura GmCCS (14 μM) en
tampón C. Las disoluciones utilizadas se incubaron durante varios min bajo una