Estación Experimental de Aula Dei - CSIC - Consejo Superior de ...

Materiales y Métodos
menos 5 min, se añadió el tampón de la retrotranscriptasa y la mezcla de
desoxirribonucleótidos, incubándose todo a 42 ºC durante 1 min. Pasado este minuto, se
añadieron 200 unidades de la retrotranscriptasa (M-MLV retrotanscriptase, Promega)
incubándose durante 1 h a 42 ºC. La retrotranscriptasa se inactivó a 70 ºC durante 10
min y la muestra se trató con RNAsa H libre de DNAsa que digiere el RNA de las
dobles cadenas formadas por RNA y DNA. Finalmente, el cDNA sintetizado se diluyó
hasta un volumen final de 120 μl con H2O miliQ estéril, y se conservó a -80 ºC.
2.2.3.2 Condiciones de PCR
Tras encontrar las condiciones de PCR adecuadas para cada pareja de cebadores,
los productos de amplificación fueron clonados y secuenciados para comprobar su
identidad.
Las PCRs se realizaron en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PE
Applied Biosystems) en tubos de 0´2 ml en los que se dispuso la siguiente mezcla de
reacción:
cDNA 8 μl
dNTP mix (10 mM) 3´5 μl
Tampón Taq × 10 5 μl
MgCl2 (50 mM) 4 μl
Cebador 5’ (10 µM) 2 μl
Cebador 3’ (10 µM) 2 μl
H2O miliQ 24´5 μl
Taq Platinum (5 u/µl) 1 μl
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