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Materiales y Métodos 94 ºC 94 ºC 3 min 30 s 35 ciclos Tm 30 s 72 ºC 72 ºC t 10 min Figura 2-3: Programa tipo de PCR utilizado. La temperatura de hibridación (Tm) y el tiempo de extensión (t) se ajustaron de forma apropiada para cada gen. Gen GmCCS GmCCS´ GmCSD2 NSP-GmCCS1 NSP-GmCCS2 NSP-GmCCS3 NSP-GmCSD2 Actina Tm (ºC) 54 55 54 50 50 50 55 46 Tiempo de extensión (s) Tabla 2-2: Temperatura de hibridación y tiempo de extensión a los que se ha realizado cada amplificación, así como el tamaño del producto amplificado. 60 90 60 60 60 60 60 60 45 930 762 791 755 678 1160 609 334 4 ºC ∞ Tamaño del producto (pb)
94 ºC 94 ºC 4 min 1 min 40 ciclos 52 ºC 2 min 61 72 ºC 72 ºC 90 s 10 min Materiales y Métodos Figura 2-4: Programa de PCR utilizado para amplificar el gen que codifica a la hipotética chaperona cpCCS de soja. (*) Significa que las rampas de temperatura anterior y posterior a la etapa de hibridación a 52 ºC corrieron más lentas que en el programa tipo. 2.2.4 Electroforesis de DNA en geles de agarosa * La electroforesis se realizó sobre un soporte sólido de agarosa en tampón TBE. En estas condiciones, a pH neutro, el DNA presenta una carga negativa de manera que, sometido a un campo eléctrico, migra hacia el ánodo. Las moléculas de DNA lineal migran a través del gel a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. De este modo, pudo determinarse el tamaño de los fragmentos de DNA de interés en relación con marcadores comerciales de peso molecular conocidos. La electroforesis horizontal en geles de agarosa se utilizó como método general de análisis de preparaciones de DNA, y para separar, identificar o purificar fragmentos de DNA. La concentración de agarosa de los geles dependió del tamaño del fragmento que se deseó analizar. En nuestro caso, debido a la diversidad de tamaños, se utilizaron geles desde el 0´7% de agarosa para los fragmentos más grandes hasta el 1´2% para los más pequeños. Para preparar el gel, la agarosa (Pronadisa) se fundió mediante calentamiento y con agitación en tampón TBE. Una vez preparada la disolución de agarosa, se añadió bromuro de etidio a una concentración final de 5 μg/μl, se vertió en el molde del gel y 4 ºC ∞
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A mi familia
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AGRADECIMIENTOS Me gustaría aprove
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EDTA Ácido etilendiaminotetraacét
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7 PUBLICACIONES 179 Publicaciones D
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