Estación Experimental de Aula Dei - CSIC - Consejo Superior de ...

Materiales y Métodos
2.5 TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS
2.5.1 Western Blot
Una vez separadas las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE (apartado
2.4.2), éstas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Trans-blot transfer
medium, BioRad) para los métodos de revelado colorimétricos con la peroxidasa y la
fosfatasa alcalina o a una membrana de PVDF (Pall Corporation) para el método de
revelado quimioluminiscente. La membrana de nitrocelulosa se activó sumergiéndose
unos segundos en H2O milliQ antes de equilibrarse con el tampón de transferencia, la
membrana de PVDF se activó de la misma manera pero se utilizó metanol en lugar de
H2O milliQ para su activación. Estas proteínas se detectaron mediante anticuerpos
específicos (Tabla 2-4). Para ello, tras desarrollar la electroforesis, el gel sin teñir se
dispuso junto a la membrana en el equipo de transferencia (Mini Trans-blot, BioRad).
Tanto el gel como la membrana, previamente hidratada, se colocaron entre dos papeles
Whatman y dos esponjas, todo ello empapado en tampón TBS. Los papeles Whatman y
la membrana se recortaron con las dimensiones exactas del gel para que la transferencia
transcurriera eficientemente. La transferencia se llevó a cabo a un voltaje constante de
100 V durante 90 min en presencia del tampón de transferencia.
Una vez realizada la transferencia, la membrana se incubó con el anticuerpo
específico para la proteína que se deseaba detectar. Este anticuerpo, denominado
anticuerpo primario es reconocido a su vez por un anticuerpo secundario. El anticuerpo
secundario se encuentra conjugado con una molécula que permite la detección del
complejo formado por la proteína de interés. En nuestro caso se han utilizado dos tipos
de anticuerpos secundarios; conjugados con peroxidasa y conjugados con fosfatasa
alcalina biotinada (Tabla 2-4). El tipo de método de revelado realizado dependió del
tipo de anticuerpo secundario utilizado y de la sensibilidad requerida. Para el anticuerpo
secundario conjugado con peroxidasa se realizaron el método de revelado colorimétrico
y el quimioluminiscente, siendo este segundo más sensible. Para el anticuerpo
secundario conjugado con la fosfatasa alcalina biotinada se realizó el método de
revelado colorimétrico correspondiente. A continuación, se detallan los protocolos
seguidos para cada uno de estos revelados.
Tampón de transferencia: 14´4 g/l Glicina, 3´03 g/l Tris-HCl, 200 ml Metanol.
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