Estación Experimental de Aula Dei - CSIC - Consejo Superior de ...

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Materiales y Métodos
La concentración de RNA se determinó espectrofotométricamente midiendo la
absorbancia a 260 nm. Para el cálculo de la concentración, cada unidad de absorbancia a
260 nm se consideró como 40 μg/ml de RNA. Finalmente, el RNA se diluyó en agua
con 0´1% (v/v) de DEPC hasta una concentración de trabajo estándar de 2 μg/μl.
2.2.2 Extracción del RNA de plantas de soja
Para la extracción y purificación del RNA de plantas se siguió el mismo
procedimiento que con las suspensiones celulares, se utilizó el kit “RNeasy Plant Mini
Kit” (Quiagen GMBH, Hiden, Alemania), según las instrucciones del fabricante. Se
partió de 0´1 g de material para todos los tejidos analizados (hoja joven, hoja madura,
tallo, raíz y flor). En el caso de la raíz, se realizó una incubación adicional de 3 min a 56
ºC tal y como indica el manual en el paso 3. A continuación, el RNA se resuspendió en
30 μl de H2O miliQ con 0´1% (v/v) de DEPC y se midió su concentración (apartado
2.2.1). Finalmente, el RNA se diluyó en H2O miliQ con 0´1% (v/v) de DEPC hasta una
concentración de trabajo estándar de 2 μg/μl.
2.2.3 RT-PCR semicuantitativa
La técnica de RT-PCR (Transcripción reversa – Reacción en cadena de la
polimerasa) se utilizó para estudiar de modo semicuantitativo los niveles de mRNA de
los genes GmCCS y GmCSD2. La realización de una RT-PCR conlleva dos etapas: la
síntesis del DNA complementario (cDNA) a partir del mRNA y la amplificación
mediante cebadores específicos del cDNA derivado del mRNA del gen de interés.
2.2.3.1 Síntesis de cDNA
El RNA extraído tal y como se explica en el apartado anterior, ha sido tratado
previamente con 5 unidades de DNAsa I libre de RNAsa a 37 ºC durante 10 min para
eliminar la posible contaminación con DNA genómico antes de ser purificado con las
columnas del kit “RNeasy Plant Mini Kit”, las cuales eliminan posteriormente esta
DNAsa.
Se sintetizó la hebra de cDNA a partir de 5 μg de RNA, utilizando como cebador
un oligonucleótido compuesto por desoxirribonucleótidos de timina denominado oligo
dT. Para ello se añadió el cebador (dT)12-18 (Invitrogen) a una concentración final de 1
μM e incubamos a 70 ºC durante 10 min. Tras enfriar rápidamente en hielo durante al