Determinacion de IgE Especifica.pdf
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Determinación <strong>de</strong> la Ig E<br />
Específica en el Laboratorio<br />
Carlos Artaza Álvarez<br />
MIR 1 F.H.Alcorcón
INTRODUCCION
• El sistema inmunológico se caracteriza<br />
por reconocer sustancias extrañas (Ag) y<br />
generar una respuesta para eliminarlas.<br />
• En las alergias esta respuesta es excesiva<br />
y finalmente produce daño en los tejidos.<br />
• Intervienen elementos genéticos, celulares<br />
y moleculares
SISTEMA INMUNOLOGICO
• Contacto inicial con el alergeno en un<br />
individuo predispuesto: producción <strong>de</strong> <strong>IgE</strong><br />
que se fija a mastocitos y basófilos<br />
(sensibilización).<br />
• Un segundo contacto con alergeno<br />
produce <strong>de</strong>granulación y liberación <strong>de</strong><br />
sustancias vasoactivas
REACCIÓN N DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO I<br />
1ª EXPOSICIÓN A UN ALERGENO<br />
PREDISPOSICIÓN GENETICA<br />
PRODUCCIÓN DE GRAN CANTIDAD DE <strong>IgE</strong> ESPECIFICA<br />
FIJACIÓN A RECEPTORES DE MEMBRANA DE MASTOCITO<br />
2ª EXPOSICIÓN A ALERGENO<br />
UNIÓN DE ALERGENO A <strong>IgE</strong> ESPECIFICA EN LA SUPERFICIE<br />
DEL MASTOCITO<br />
LIBERACIÓN DE HISTAMINA Y OTROS MEDIADORES<br />
MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Diagnóstico <strong>de</strong> la Alergia mediada por <strong>IgE</strong><br />
. HISTORIACLINICA<br />
- Exploración física<br />
. Pruebas objetivas <strong>de</strong> sensibilidad a<br />
la <strong>IgE</strong>:<br />
- Pruebas cutáneas<br />
- Determinación S<strong>IgE</strong>
Peculiarida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> la <strong>IgE</strong><br />
-Permite <strong>de</strong>tectar la sensibilización <strong>de</strong> un paciente<br />
frente a un alergeno <strong>de</strong>terminado<br />
-Baja concentración sérica: aguja en un pajar
Propieda<strong>de</strong>s Inmunológicas <strong>de</strong> las<br />
Inmunoglobulinas<br />
IgG<br />
IgA<br />
IgM<br />
<strong>IgE</strong><br />
IgD<br />
Concentración<br />
Sérica (mg/dl)<br />
820<br />
170<br />
90<br />
0,05<br />
0,05<br />
Cantidad<br />
sintetizada<br />
(mg/Kg/día)<br />
33<br />
24<br />
6,7<br />
0,002<br />
0,4<br />
Vida Media<br />
(días)<br />
21<br />
6<br />
5<br />
2<br />
2
Detección <strong>de</strong> <strong>IgE</strong>: ensayo óptimo<br />
- Capacidad <strong>de</strong> <strong>de</strong>tectar bajas concentraciones (UI = 2.4 ng)<br />
-Ausencia <strong>de</strong> reactividad cruzada:<br />
ni con otras Igs (IgG, IgM, IgA,…)<br />
ni con otros alergenos no homólogos<br />
- No interferencia con bilirrubina, Hb, lípidos…<br />
- Calibración estable, con amplio rango <strong>de</strong> medida<br />
- Precisión: CV intras.
Detección <strong>de</strong> <strong>IgE</strong>: ensayo óptimo<br />
• Altamente Sensible: “Detectar” pacientes con niveles <strong>IgE</strong> ↑<br />
• Altamente Especifico: Excluir los no sensibilizados<br />
• Calidad analítica: fiabilidad, estabilidad, reproducibilidad<br />
• Estandarización (OMS)<br />
• Reproducible (baja variación en la repetición <strong>de</strong> una<br />
medida)<br />
• Automatización: flexible, fácil manipulación.<br />
• Amplio menú <strong>de</strong> alergenos
INMUNOENSAYOS
Inmunoensayo: reacción<br />
Ag-Ac<br />
Alergeno <strong>IgE</strong><br />
Pilar <strong>de</strong>l diagnóstico “in vitro” en el laboratorio<br />
<strong>de</strong> alergia: <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> <strong>IgE</strong> específica.
INMUNOENSAYOS:CONCEPTOS<br />
BASICOS<br />
• Complejo Ag-Ac: Sistema en equilibrio<br />
• Ag + Ac Ag-Ac<br />
• Afinidad<br />
• Heterogeneidad <strong>de</strong> la respuesta<br />
• Avi<strong>de</strong>z<br />
• Reactividad cruzada
INMUNOENSAYOS MARCADOS:<br />
GENERALIDADES<br />
• Inmunoensayos en los que el Ag o Ac están<br />
marcados<br />
• Rápidos, menos <strong>de</strong> 24 h.<br />
• Alta sensibilidad, <strong>de</strong> microgramos a<br />
nanogramos.<br />
• Automatizables, aplicaciones<br />
• Clasificación:<br />
» Homogéneos<br />
» Heterogéneos<br />
» Competitivos<br />
» No competitivos
Inmunoensayos Marcados<br />
Tipos
Inmunoensayos Marcados<br />
Fase<br />
sólida<br />
Conjugado marcado*:<br />
RIA<br />
EIA<br />
Alergeno <strong>IgE</strong><br />
FIA<br />
QIA
RADIOINMUNOENSAYOS<br />
• Inmunoensayo marcaje radiactivo<br />
– Radiacion beta: Tritio, carbono 14, etc.<br />
– Radiación gamma: Iodo 125, Iodo 135, etc.<br />
• Ensayos esencialmente competitivos<br />
– Ensayos secuénciales<br />
– Ensayos en equilibrio<br />
• Contadores
FLUOROINMUNOENSAYO<br />
• Determinación <strong>de</strong> proteínas, drogas y<br />
hormonas.<br />
• Ac se une covalentemente a una molécula<br />
fluorescente.<br />
• Absorben la luz <strong>de</strong> baja longitud <strong>de</strong> onda (200 a<br />
400 nm)<br />
• Emisión a longitud <strong>de</strong> onda mayor (400-700 nm)<br />
• Método directo:<br />
– Ac marcado directamente proporcional al Ag presente<br />
• Método indirecto:<br />
– Menor Ac fluorescente fijado, mayor será el Ag<br />
presente
Primer Paso<br />
Fluoroinmunoensayo<br />
Incubación 37ºC<br />
Eliminación<br />
por lavado<br />
Ac. Fase Sólida<br />
Ag a medir<br />
<strong>de</strong>l paciente<br />
Ag <strong>de</strong>l paciente<br />
ligado al Ac
Fluoroinmunoensayo<br />
Segundo Paso<br />
37ºC<br />
Incubación<br />
Reactivo anti-Ag<br />
fluorescente<br />
Medición <strong>de</strong> la<br />
fluorescencia relativa<br />
sobre la fase sólida
ENZIMOINMUNOENSAYO<br />
• Ensayo marcado por una enzima.<br />
• Heterogéneos. Paso intermedio o<br />
separación:<br />
• Competitivo. Ag Marcado<br />
• No competitivo (Sándwich). Ac marcado<br />
• Indirecto. Medición niveles <strong>de</strong> Ac<br />
• Homogéneos. No paso intermedio<br />
• Enzimas<br />
• Bajo coste, alto nivel <strong>de</strong> pureza y interferencia
METODOLOGIAS<br />
UniCap ®<br />
(Pharmacia)<br />
Advia Centaur ®<br />
(Bayer)<br />
Immulite 2000 ®<br />
(DPC)
Sistema UniCAP (Phadia)<br />
• Alta capacidad <strong>de</strong> fijación <strong>de</strong>l alergeno sobre una matriz.<br />
• Gran versatilidad, panel más amplio <strong>de</strong> alergenos (más <strong>de</strong> 450),<br />
y permite un cribado múltiple <strong>de</strong> alergenos (Phadiatop, que<br />
combina los neumoalergenos, o los alimentos más frecuentes<br />
encontrados en clínica), e investigar aquellos pacientes con<br />
resultado positivo (> 0.35 kU/L).<br />
• Diseño : se trata <strong>de</strong> un Fluoroenzimoinmunoensayo clásico <strong>de</strong><br />
tipo sandwich, alergeno fijado a fase sólida (matriz) y la anti-<strong>IgE</strong><br />
marcada con enzima beta-galactosidasa que hidroliza la 4-metilumbeliferil-beta-D-galactosa,<br />
liberando el producto fluorescente,<br />
la 4-metil-umbeliferona.<br />
• Curva <strong>de</strong> calibración obtenida con 6 calibradores <strong>de</strong> <strong>IgE</strong> total.<br />
Válida durante un mes en el que se controla con 2 puntos.<br />
• Tiempo <strong>de</strong> realización <strong>de</strong>l ensayo : 2.5 horas.
ImmunoCAP 250 (Phadia)<br />
Fluoro-Inmunoanálisis:<br />
β-galactosidasa libera 4 metil-umbeliferona fluorescente.<br />
Curva 6 <strong>IgE</strong> total<br />
totalmente<br />
automatizado<br />
60 test/hora<br />
Técnica <strong>de</strong><br />
referencia en la<br />
<strong>de</strong>tección in vitro<br />
<strong>de</strong> <strong>IgE</strong> específica.<br />
> 450 alergenos.
Sistema AlaSTAT - Immulite 2000<br />
(Diagnostic Products Corporation)<br />
• Incorpora la tecnología <strong>de</strong> alergenos en fase líquida, están fijados<br />
a polímeros solubles.<br />
• La unión a la fase sólida a través <strong>de</strong> la elevada afinidad <strong>de</strong> la<br />
biotina (fijada también al polímero que porta al alergeno) por la<br />
estreptavidina (que recubre la bola <strong>de</strong> poliestireno).<br />
• Tecnología <strong>de</strong> lavado patentada por centrifugación a 10.000 rpm :<br />
mínimas uniones inespecíficas <strong>de</strong>bido a la óptima separación<br />
entre las fases ligada y no ligada.<br />
• Diseño : Se trata <strong>de</strong> un enzimo-quimioinmunoanálisis.<br />
• Conjugado anti-<strong>IgE</strong> marcado con fosfatasa alcalina y sustrato es<br />
el ester fosfato <strong>de</strong> admantil-dioxetano que origina un producto<br />
luminiscente.<br />
• Velocidad <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>l analizador : 100 <strong>de</strong>terminaciones/hora.<br />
Con un tiempo para el primer resultado <strong>de</strong> 65 minutos.
Immulite 2000 (DPC): sistema<br />
AlaSTAT<br />
Enzimo-quimioinmunoanálisis<br />
Bola <strong>de</strong> poliestireno<br />
recubierta <strong>de</strong><br />
Estreptavidina<br />
Biotina<br />
<strong>IgE</strong><br />
Sustrato<br />
Alergeno<br />
Luminiscencia, CPS<br />
Enzima ALP<br />
Anti-<strong>IgE</strong><br />
Sustrato:<br />
Ester fosfato <strong>de</strong><br />
adamantil-dioxetano<br />
(señal prolongada)<br />
Alergeno en fase líquida<br />
unido a un polímero soluble<br />
que también lleva fijado biotina.
IMMULITE 2000 ® - EL TUBO DE REACCIÓN<br />
Un elemento esencial es el tubo <strong>de</strong> Reacción, que junto con la<br />
bola recubierta <strong>de</strong> estreptavidina, esta diseñado especialmente<br />
para llevar a cabo<br />
1. La reacción inmunológica<br />
2. El lavado por centrifugación<br />
3. El <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> la señal quimioluminiscente
LA SEÑAL QUIMIOLUMINISCENTE<br />
Mediante esta tecnología se genera una señal prolongada<br />
permitiendo aumentar el rango y por tanto el número <strong>de</strong><br />
lecturas precisas (12, separando las 2 extremas) frente a la<br />
quimioluminiscencia tradicional.
Immulite 2000 (DPC)<br />
Velocidad <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>l autoanalizador: 100 <strong>de</strong>t/h (1º en 65´)<br />
Plataforma que permite <strong>de</strong>terminar otros analitos<br />
Curva master <strong>de</strong> calibración:<br />
7 puntos <strong>IgE</strong> total<br />
(códigos <strong>de</strong> barra <strong>de</strong>l reactivo)<br />
En la práctica<br />
con 2 puntos se adapta<br />
a cada ensayo
Sistema ADVIA-Centaur (Bayer)<br />
• Diseño <strong>de</strong> sandwich invertido : Es la Anti-<strong>IgE</strong> (y no el alergeno) la<br />
que está fijada a la fase sólida (partículas paramagnéticas)<br />
capturando sólo la totalidad <strong>de</strong> <strong>IgE</strong> que presenta el especímen<br />
<strong>de</strong>l paciente.<br />
• Es el alergeno el que va a portar el marcaje luminiscente, pero no<br />
<strong>de</strong> forma directa, sino a través <strong>de</strong> la interacción biotinaestreptavidina.<br />
• El ester <strong>de</strong> acridinio sometido a un cambio <strong>de</strong> pH emite<br />
luminiscencia.<br />
• Curva <strong>de</strong> calibración empleando <strong>IgE</strong> específica frente a una<br />
proteína recombinante <strong>de</strong>l alergeno <strong>de</strong> abedul (r Bet v 1)<br />
• Velocidad <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>l analizador : 120 <strong>de</strong>terminaciones/hora.<br />
Con un tiempo para el primer resultado <strong>de</strong> 47 minutos.
Advia-Centaur (Bayer)<br />
Diseño sandwich invertido:<br />
la Anti-<strong>IgE</strong> es la que se fija a la fase sólida<br />
y el que lleva el marcaje es el alergeno, pero<br />
no <strong>de</strong> forma directa.<br />
Anti-<strong>IgE</strong><br />
unida a partículas<br />
paramagnéticas<br />
<strong>IgE</strong><br />
Alergeno<br />
unido a<br />
biotina<br />
Ester <strong>de</strong> acridinio<br />
unido a<br />
Estreptavidina<br />
pH: ac. nítrico y sosa<br />
Quimioluminiscencia, RLU
Advia-Centaur (Bayer)<br />
Velocidad <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>l autoanalizador: 120 <strong>de</strong>t/h (1º en 47´)<br />
Flexibilidad analítica: hormonas, serología, marcadores<br />
Curva master <strong>de</strong> calibración:<br />
6 puntos s-<strong>IgE</strong> rbet<br />
En la práctica<br />
con 2 puntos se adapta<br />
a cada ensayo
Interpretación resultados <strong>IgE</strong> específicos<br />
Resultados<br />
cuantitativos<br />
KUA/L<br />
< 0.35<br />
0.35-
<strong>IgE</strong> específica y citometría <strong>de</strong><br />
flujo
Fundamento Citometría <strong>de</strong><br />
flujo<br />
• Técnica <strong>de</strong> análisis celular multiparamétrico<br />
• Flujo laminar suspensión <strong>de</strong> partículas (generalmente células) por <strong>de</strong>lante <strong>de</strong> un<br />
haz <strong>de</strong> láser focalizado.<br />
• El impacto <strong>de</strong> cada célula produce señales (dispersión y fluorescencia) que son<br />
recogidos por distintos <strong>de</strong>tectores y digitalizadas para la medida simultánea <strong>de</strong><br />
varios parámetros<br />
• Permite el análisis <strong>de</strong> un gran número <strong>de</strong> células en poco tiempo (5000<br />
partículas / segundo).<br />
Se trata <strong>de</strong> una técnica cualitativa y CUANTITATIVA.
Principales componentes<br />
CMF<br />
* Fluídica:<br />
Flujo laminar.<br />
* Sistema óptico<br />
- Fuente <strong>de</strong> radiación monocromática<br />
- Selección <strong>de</strong> la radiación<br />
- Detección <strong>de</strong> las distintas señales<br />
* Sistema <strong>de</strong> recogida y análisis <strong>de</strong> datos
Esquema Citómetro <strong>de</strong> flujo
<strong>IgE</strong> específica y citometría <strong>de</strong><br />
flujo<br />
FLUJO<br />
LAMINAR<br />
fila <strong>de</strong> partículas<br />
Anti-<strong>IgE</strong><br />
marcada<br />
<strong>IgE</strong> sérica<br />
lolium olivo gato<br />
Cada partícula porta<br />
una especificidad<br />
alergénica<br />
2 LASER<br />
Un láser i<strong>de</strong>ntifica la partícula<br />
por su espectro rojo-naranja.<br />
El otro cuantifica el marcaje<br />
con fluoresceína (ver<strong>de</strong>).
Tecnología Multiplex<br />
En un mismo pocillo <strong>de</strong> reacción,<br />
para una muestra <strong>de</strong>terminada,<br />
realizamos<br />
múltiples micro-inmunoensayos<br />
simultáneamente.
Para cada paciente:<br />
múltiples microensayos simultáneos<br />
Bajos<br />
CV<br />
< 10%<br />
analiza 50-200 esferas<br />
<strong>de</strong> cada especificidad
Los Acs siguen siendo la<br />
clave<br />
CONJUGADO (marcado con fluorocromo)<br />
contra la molécula a analizar<br />
(contra un epítopo distinto al <strong>de</strong>l 1º anticuerpo)<br />
Marcador tumoral<br />
Hormona<br />
Antígeno<br />
SUERO<br />
DEL<br />
PACIENTE<br />
ANTICUERPO fijado a la esfera (soporte)<br />
(contra la molécula a analizar)
Ventajas <strong>de</strong> CMF<br />
- Volumen <strong>de</strong> muestra mínimo.<br />
- Mayor precisión frente a las técnicas manuales: IFI<br />
- Cuantifica: mayor rango analítico que EIA<br />
- Homogeniza las múltiples pruebas existentes<br />
- Análisis múltiple simultáneo (mismo conjugado)<br />
- Disminuye drásticamente el tiempo <strong>de</strong> respuesta<br />
- Ahorro <strong>de</strong> mano <strong>de</strong> obra
Ten<strong>de</strong>ncias en las pruebas <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> s<strong>IgE</strong><br />
• Consolidar el mayor número <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminaciones<br />
en un solo tubo y una sola estación <strong>de</strong> trabajo ó<br />
plataforma analítica multifuncional.<br />
• Utilización <strong>de</strong> metodología <strong>de</strong> alta sensibilidad,<br />
precisión, garantía <strong>de</strong> no contaminación,<br />
•Amplio menú <strong>de</strong> alergenos, amplio panel <strong>de</strong><br />
alergenos recombinantes.