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Fig. 1.- Morfología microscópica de Haemophilus paras u i s. Microscopio óptico (x100). Tinción deGram.Microscópicamente, son pequeños bacilos o cocobacilos pleomórficos (incluso cadenasfilamentosas), de longitud variable, desde 1 a 7 mm de largo y 0,2 a 2 mm de ancho,gramnegativos (fig. 1), que manifiestan la presencia de cápsula en cultivos in vitro y que precisandel factor V de coagulación de la sangre (NAD) para su crecimiento. La dependencia de este factorse resuelve mediante la adición directa de NAD (0,025%) a los medios de cultivo, enformulaciones que incorporan sangre calentada (ágar chocolate) o mediante el satelitismoalrededor de colonias de Staphylococcus aureus o S. epidermidis. Al cabo de 2448 horas a 37°C,en atmósfera aerobia o mejor en microaerofilia (en aislamientos primarios, fundamentalmente),dan lugar a colonias pequeñas, de 12 mm de diámetro, traslúcidas y no hemolíticas (en ágar con5% de sangre de caballo).Poseen actividad catalasa, oxidasa y reducen los nitratos a nitritos. Carecen, sin embargo, deactividad ureasa; no producen indol ni descarboxilan la ornitina, lisina y arginina. Producen ácidode la glucosa, manosa, maltosa y sacarosa, pero son negativos sobre la xilosa, lactosa, manitol,ramnosa y arabinosa. Existen variaciones, dependientes de la cepa, respecto de la producción deácido del inositol y del sulfuro de hidrógeno; en cualquier caso, la limitación de los estudiosmetabólicos reside en la dificultad de diferenciar entre cepas patógenas y apatógenas.Utilizando electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) se han puesto de manifiesto dosperfiles o patrones proteicos diferentes dentro de H . parasuis (Nicolet- et al., 1980; Morozumi yNicolet, 1986). La gran mayoría de las cepas que se aíslan de casos de enfermedad de Glässer sonmuy homogéneas y se integran dentro del biotipo II, que se caracteriza por la presencia de unabanda de un peso molecular en torno a 37 kDa, aunque las diferencias de patogenicidad entrecepas son, realmente, muy marcadas, mientras que los aislados de fosas nasales de cerdos sanosse integran en el perfil I, que se caracteriza por la presencia de grupos de bandas con pesosmoleculares por encima de 68 kDa y entre 23 y 40 kDa. La relación de este procedimiento con elpoder patógeno del microorganismo no se encuentra, sin embargo, cuando se aplica un métodosimilar a las bacterias sonicadas, con el propósito de estudiar los perfiles de las proteínas demembrana externa (Rapp- et al., 1986), método por el que han llegado a diferenciarse hasta 18patrones distintos, lo que demuestra, en suma, una gran variedad interna dentro de la especie,que podría deparar reagrupaciones en los próximos años.En algunas cepas se han demostrado estructuras filamentosas, semejantes a fimbrias, que sepierden después del subcultivo (Munch et al., 1992) y también una capa de glucocálix. Ambasestructuras permiten, en algunos patógenos, la adherencia a la superficie de las células epitelialesy la colonización consiguiente.SEROTIPOSLa existencia de serotipos fue identificada, en primer lugar, por Bakos et al., en 1952 (citados porRapp-Gabrielson, 1999), cuyo primitivo esquema de clasificación reconocía los serotipos A a Dmediante una prueba de precipitación. Este esquema original se transformó por el progresivoincremento del número de serotipos demostrado por diversos investigadores (Schimmel et al.,1985; Morozumi y Nicolet, 1986; Kielstein et al., 1991). En cualquier caso, es destacable laheterogeneidad antigénica de este microorganismo, que origina no pocos problemas para suclasificación.En la actualidad se reconocen un total de 15 serotipos (1 al 15) (Kielstein y Rapp-Gabrielson,1992), basados en una técnica de inmunodifusión con antisueros específicos producidos en conejo,originalmente descrita por Morozumi y Nicolet (1986) y validada recientemente (Rafiee y Blackall,2000). Consiste en la detección de un antígeno polisacárido termoestable, resistente a laproteolisis enzimática, presumiblemente de origen capsular o lipopolisacárido (con todaprobabilidad un polisacárido ácido, aunque en algunas cepas no se excluye una composicióndiferente -Morozumi y Nicolet, 1986-). El uso de SDS-PAGE e immunoblotingcon anticuerposmonoclonales ha puesto de manifiesto la heterogeneidad del L P S .Hay que destacar, sin embargo, que un porcentaje elevado de cepas identificadas como H.parasuis (en ocasiones, hasta el 30% e incluso más) no son tipificables, lo que puede significartanto que algunos aislamientos no expresan suficiente cantidad de antígeno como que puedantratarse de otros serotipos aún por identificar.No es un suceso infrecuente el que varias cepas o serotipos estén presentes en el mismo animal oen la misma explotación, como se ha demostrado en varias ocasiones (Rapp-Gabrielson, 1992,1993).FACTORES DE VIRULENCIA
Se ha demostrado una relación entre algunos serotipos y la virulencia, como se verá másadelante, aunque ésta última se vea influida por otros factores, entre ellos, patrones específicosde proteínas. Sin embargo, estas observaciones no se ratifican cuando se repiten los experimentosde virulencia con diferentes cepas de un mismo serotipo. Es posible que la razón no sea otra quela falta de homogeneidad interna de los serotipos, en cuyo caso debería hablarse de unaasociación de la virulencia con la cepa, más que con el serotipo, aunque tampoco puedendescartarse otras explicaciones.Poco se conoce, por el momento, sobre la razón de la virulencia de algunos serotipos de H.parasuis, que justificaría la morbilidad y mortalidad de algunos casos de enfermedad. Losserotipos 1, 5, 10, 12, 13 y 14 se asocian, por lo general, con casos agudos, capaces de producirla muerte del animal en un periodo de cuatro días, mientras que los serotipos 2, 4 y 15desencadenan la forma crónica de la enfermedad, con graves lesiones de poliserositis y artritis. Elserotipo 8 se califica de virulencia ligera, mientras que los serotipos 3, 6, 7, 9 y 11 no serelacionan con signos clínicos (Kielstein y Rapp-Gabrielson, 1992).Determinados estudios, llevados a cabo con los siete primeros serotipos mediante la inoculaciónintratraqueal en cobaya (Rapp-Gabrielson et al., 1992), permitieron observar diferencias claras,pues mientras que los serotipos 1 y 5 fueron los más invasivos, ocasionando la muerte de losanimales a dosis altas (1,3 x 1010 UFC en el caso del serotipo 1 y de 4,2 x 109 UFC en el delserotipo 5) o una septicemia persistente a dosis más bajas (1,3 x 108 UFC en el caso del serotipo1 y de 4,2 x 107 UFC en el del serotipo 5), sin embargo, los serotipos 2 y 6 resultaron menosvirulentos, aunque en algunos casos también produjeron bronconeumonía y muerte; por otraparte, los serotipos 3, 4 y 7 solamente indujeron signos clínicos transitorios y lesiones mínimas.Estos datos ponen de manifiesto una cierta similitud con los resultados descritos en el hospedadornatural, lo que indica su valor como modelo para estudios experimentales relacionados con lavirulencia.La capacidad para aglutinar en acriflavina así como el perfil de péptidos obtenido en SDS-PAGE(tipo II) (Morozumi y Nicolet, 1986) permite sugerir una cierta asociación con estructurasrelacionadas con la virulencia, por el momento sin definir.Las diferencias de patogenicidad en H. parasuis se han asociado también a la presencia de cápsulay a la de proteínas de membrana externa. La presencia de proteínas receptoras de hierro yreguladas por este elemento ha sido objeto de controversia por parte de los microbiólogos. Mortony Williams (1989) detectaron la producción de sideróforos, atribuyéndoles la captación de hierro apartir de la transferrina, lo que posteriormente se demostró erróneo: los propios autorescuestionaban la coherencia de su observación. Charland et al., (1995) obtuvieron las primerasevidencias concluyentes de la existencia de proteínas receptoras de transferrina sérica porcina:trabajando con dos cepas de H. parasuis comprobaron que estos microorganismos adquirían hierrounido a transferrina porcina (pero no bovina, ni lactoferrina) por un mecanismo independiente desideróforos, en el que se implicaban, según la cepa, uno o dos polipéptidos, de 96 kDa y de 94 y60 kDa, respectivamente, a quienes responsabilizaban la condición de receptores de latransferrina. La cuestión, hasta la fecha abierta, ha sido recientemente resuelta por nuestro grupo,pues utilizando sondas específicas hemos clonado y secuenciado los genes tbpA y tbpB,demostrando así, de forma directa, la existencia de proteínas de captación de hierro en estaespecie (t b p A y t b p B) (De la Puente et al., 2000).La explicación más probable supone, por tanto, que H. parasuis, que como otros microorganismosnecesita para su crecimiento pequeñísimas concentraciones de hierro (de 0,4 a 4 µM) (Finkelsteinet al., 1983), dispone de la doble capacidad de captar hierro tanto mediante sideróforos comomediante proteínas t b p. Estas proteínas posiblemente desempeñen un papel decisivo en elmantenimiento de la infección en el hospedador natural, pues en él la presencia de hierro libredisponible en los fluidos corporales puede alcanzar valores tan bajos como 10 1 8 M o tiene lugaren condiciones inaccesibles de forma directa, formando complejos con otras moléculas o unido aproteínas transportadoras (transferrina o lactoferrina) (Bullen, 1981).Aunque se han descrito estructuras semejantes a fimbrias, su papel en la adhesión aún no ha sidodefinido de forma concluyente (Münch et al., 1992) y respecto del LPS, hasta la fecha suspatrones moleculares no se han asociado tampoco con la virulencia (Zucker et al., 1996).Recientemente, Lictensteiger y Vimr (1997) se han referido a la detección de una enzima,neuraminidasa (sialidasa), cuya presencia se hace evidente al final de la fase de crecimientologarítmico, que se asocia a las células y que no requiere Ca++ para su actividad. Su función en labiología de H. parasuis p o d r í a estar relacionada con la supervivencia intracelular.EPIDEMIOLOGÍAComo en el caso de algunos otros patógenos porcinos, el cerdo es el hospedador exclusivo de H.parasuis, de cuyas fosas nasales se recupera, en ocasiones sin relación con cuadro clínico alguno,
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