*Albeitar 94.qxd

42Actualidad profesional➔ cut-off (punto de corte) determina losresultados de las muestras.Enfer test (ELISA,Enfer Scientific, Irlanda)La preparación de la muestra en un pasoincluye la transferencia de la misma dentroy fuera de una bolsa de plástico seguidadel tratamiento con proteasas. A continuación,se envuelve individualmente enplacas ELISA seguido de la detección víaanticuerpos policlonales y anticuerpossecundarios unidos a enzimas. La detecciónse basa en quimioluminiscencia.En 2002 se realizó una nueva convocatariade participación en una evaluaciónpara test rápidos de BSE. Esta vez, sedividió en una evaluación laboratorial yun experimento de campo para determinarel rendimiento de los nuevos ensayosen condiciones de campo y permitir unacomparación con los ya aprobados (8).Los siguientes dos test pasaron ambaspruebas y fueron aprobados por la Comisiónde la Unión Europea en 2003 para elcontrol de la EEB en vacuno (ver tabla).Prionics-Check LIA (ELISA,Prionics AG, Suiza)Se trata de un protocolo sencillo en unpaso en la preparación de la muestra,que es seguido por el tratamiento con laproteasa. La detección tiene lugar pormedio de un ELISA sandwich que utilizaanticuerpos monoclonales, uno de ellosmarcado con enzimas. La detección seLa sensibilidady especificidaddiagnóstica delos test de las EETfueron evaluadaspor la Comisiónde la UniónEuropea por mediodel uso de 50muestras positivasy 150 negativas.basa en quimioluminiscencia utilizandoun cut-off específico de placa.Inmunoensayo dependientede conformación CDI-5(ELISA, Inpro, Estados Unidos)Además de un tratamiento suave conproteasas, el CDI utiliza la unión diferencialde anticuerpos a la PrP Sc nativa o desnaturalizada.El anticuerpo de detecciónreconoce un epitopo dependiente de conformaciónel cual, que estaba expuestoen la forma no infecciosa (PrP c ) lo haceen la infecciosa (PrP Sc ) sólo bajo desnaturalización.La cuantificación de las unionesque tienen lugar provoca una diferenciade señal (señal de “PrP total desnaturalizada”menos “PrP c nativa” esigual a PrP Sc ), que se utiliza como criteriodiagnóstico.Una tercera evaluación se llevó a caboen 2004 de forma conjunta por el DirectorateGeneral Joint Research Centre dela Comisión Europea, el Instituto paramateriales y medidas de referencia(IRMM) y la Dirección General de Saludy Protección al Consumidor, en colaboracióncon un grupo de trabajo de la Agenciade Seguridad Alimentaria Europea(EFSA). Esta evaluación se realizó denuevo en dos fases: una evaluación laboratorial(10) y un experimento de campo(11). De un total de 10 test que fueronexaminados en la evaluación laboratorial,nueve pasaron a la prueba de campo.Basándose en una baja sensibilidad en eldiagnóstico, el test rápido de BSE PDL(Prion Developmental Laboratories, Inc.,Estados Unidos) no pasó a la fase práctica.De los nueve test evaluados encampo, sólo uno no pasó con éxito laevaluación, el Priontype post mortemrapid BSE Test (Labor DiagnostikGmbH Leizpig, Alemania). Los siguientesocho test sí pasaron la prueba y recibieronla aprobación de la ComisiónEuropea (ver tabla).CediTect BSE Test (ELISA,Cedi Diagnostics, Holanda)Las muestras digeridas por proteasas sefijan en una membran RVDF activadapor filtración en un formato de 96 pocillos.Una réplica de cada muestra se tratadespués con un agente caotrópico (muestraT), mientras que la segunda réplica(muestra N), que se usa como control,no se expone a ese reactivo. La detecciónde la PrP resistente a la proteasa se basaen la lectura quimioluminiscente utilizandoun anticuerpo monoclonal conjugadocon enzimas. El cálculo del índice devalor T y valor N se usa para determinarel estado del homogeneado.FERLISA BSE (ELISA,Fujirebio, Japón)Consiste en la homogeneización de tejidoscon partículas seguida por un tratamientocon DNAsa I, colagenasa y proteasa.El homogeneado se somete entoncesa precipitación proteica, desnaturalizacióny sonicación. La detección de laPrP Sc resistente a la proteasa se realizapor un ELISA en un paso, utilizando dosanticuerpos monoclonales, uno de ellosun conjugado enzimático, que permiteuna detección colorimétrica con un cutoffespecífico de placa.IDEXX HerdChek BSE AntigenTest kit, EIA (ELISA, IDEXXLaboratories Inc.,Estados Unidos)La homogeneización de las muestras selleva a cabo con un ribolyser. La detecciónde la PrP Sc se realiza por medio deun inmunoensayo a dos caras que utilizaun polímero (tecnología con licencia deMicrosense Biotechnologies, Londres,Reino Unido) para la captura selectiva dela PrP Sc , sin la necesidad del paso dedigestión por proteasa) y la detección porun anticuerpo monoclonal conjugadocon enzimas que utiliza un sustrato colorimétrico.Se emplea un cut-off específicode placa en el diagnóstico de la muestra.Institut Pourquier Speed´it BSE(ELISA, Institut Pourquier,Francia)Los tejidos son homogeneizados utilizandoun ribolyser seguido por un tratamientode las muestras con proteinasa K.Figura 1.Detección de PrP Sc tratada con proteasa en el PrioSTRIP.Línea controlPrP ScLínea testPrP ScNegativoPositivoDetección de PrPSc tratada con proteasa en el test PrioSTRIP. Las muestras se mezclan con proteinasa K y con el conjugado, donde se insertan las tirasdel test. Los inmunocomplejos formados se visualizan en la línea del test, y el conjugado sobrante, en la línea control.’94