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Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“Aplicaciones biotecnológicas en el mejoramiento genético de especies de Rhodophialachilenas4.1.1 Ensayos establecidos en cultivo in vitro4.1.1.1 Cauterización de la zona apical de microbulbillos de diferentes genotipos de R.bagnoldii.Para ello se utilizaron microbulbillos in vitro de diferentes genotipos de Rhodophiala bagnoldii.A cada microbulbillo se le realizó un corte basal, y una cauterización del ápice con bisturí, loscuales fueron sembrados en 30 ml de medio de cultivo MS 100%, en estado líquido. Estemedio de cultivo fue adicionado con 0,5 mg/L de meta-topolina (MTP) y 0,25 mg/L depaclobutrazol (PBZ), además de un medio testigo sin la adición de reguladores de crecimiento..Se utilizaron 10 repeticiones por tratamiento, sembrando en cada frasco microbulbillos con unpeso igual o superior a 1.0 g. La incubación se realizó a 23ºC, 3000 lux y 16 horas de luz,incubándolas durante un período de tres meses.Se aplicó ANOVA y comparaciones múltiples de promedio mediante el test LSD (diferenciamínima significativa) al 5% de significancia, con excepción de la variable Tasa de propagaciónque se evaluó mediante el Test de Kruskall Wallis, aplicando el Test de Bonferroni paracomparaciones múltiples de promedios.En base a los análisis estadísticos realizados se puede observar que provocar unacauterización apical en la planta no tiene un efecto significativo en la regeneración de nuevosmicrobulbillos, ni en ninguno de los otros parámetros analizados.4.1.1.2. Cultivo de microbulbillos de diferentes genotipos de R. splendens y del genotiposeleccionado Nº 363.Los microbulbillos se sembraron en medio de cultivo MS adicionado con 2.2, 4.4, 11.1, 22.2 Mde meta-topolina (MTP) y 1.7, 3.4, 8.5 y 17.0 M de Paclobutrazol (PBZ), solos o encombinación, además del tratamiento testigo sin la adición de reguladores de crecimiento. Seutilizaron 10 repeticiones por tratamiento, sembrando en cada frasco microbulbillos con unpeso igual o superior a 1.0 g. La incubación se realizó a 23ºC, 3000 lux y 16 horas de luz,incubándolas durante un período de tres meses.Cuadro 2. Tratamientos aplicados a diferentes genotipos de R. splendensTratamiento MTP (µM) PBZ (µM)1 (Testigo) 0 02 2,2 03 4,4 04 11,1 05 22,2 06 0 1,77 0 3,48 0 8,59 0 17,010 2,2 1,711 4,4 3,412 22,2 17,0MTP: MetatopolinaPBZ: PaclobutrazolInforme Técnico y de Gestión Final 8
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“Aplicaciones biotecnológicas en el mejoramiento genético de especies de RhodophialachilenasSe analizaron los datos correspondientes a los parámetros:Peso de plantaPeso de bulboN° de brotesLargo de brotesDiámetro de bulboHiperhidricidadContaminaciónIndice de multiplicación: (N° bulbos finales – N° bulbos iniciales)/N° bulbos inicialesIndice de crecimiento: (Peso fresco final – peso fresco inicial)/Peso fresco inicialDiferencia de peso (Peso final – peso inicial).Para cada parámetro se verificó si la distribución de los datos se ajusta a una distribuciónnormal mediante la prueba de Shapiro-Wilks. Luego se realizó la prueba de Levene’s paracorroborar la homocedasticidad o heterocedasticidad de las varianzas de los tratamientos. Encaso de no ajustarse a una distribución normal (lo que sucedió en todos los parámetrosestudiados) o resultar varianzas heterocedásticas se realizó el test de Kruskal Wallis, paraluego realizar la comparación múltiple de promedios de Bonferroni.4.1.1.3. Regeneración de microbulbillos de R. bagnoldii y R. montana en medio líquidoadicionado con retardantes de crecimiento.Se realizaron dos ensayos en forma independiente con microbulbillos de diferentes genotiposde R. bagnoldii y R. montana, cultivado en medio adicionado con 0.85, 1.7, 3.4 y 6.8 M dePaclobutrazol (PBZ), además de un medio de Cultivo sin reguladores de crecimiento (Testigo 1)y de un medio de cultivo adicionado solo con 4.4 M de MTP (Testigo 2).Se aplicó un ANOVA y comparaciones múltiples de promedio mediante el test LSD (diferenciamínima significativa) al 5% de significancia, con excepción de la variable Tasa de propagaciónque se evaluó mediante el test de Kruskall Wallis, aplicando el Test de Bonferroni paracomparaciones múltiples de promedios.En el caso del ensayo con R. bagnoldii para la evaluación estadística fueron eliminadosalgunos tratamientos debido a la pérdida de material por contaminación.4.1.1.4. Efecto de distintos sistemas de cultivo in vitro.Se comparó el efecto de distintos métodos para el Cultivo in vitro en R. splendens, R. ananucay R.montana.1. Cultivo en medio sólido.2. Cultivo en medio líquido estacionario con base de algodón hidrófilo3. Cultivo en medio líquido en agitación orbital.4. Cultivo en sistema de inmersión temporal (SIT); utilizando 20 mL de medio de cultivo(SIT 20), 40 mL (SIT 40), y 60 mL (SIT 60), con una frecuencia de inmersión de 3minutos cada 12 horas.En todos los casos se utilizó medio MS suplementado con vitaminas, reguladores decrecimiento (0,54 M de ANA y 4,4 M de BAP), 30 g/L de sacarosa y en el medio solidificadocon agar se agregaron 8 g/L.Informe Técnico y de Gestión Final 9
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