enfermedad vesicular porcina - Oficina Regional de la FAO para ...

Capítulo 2.1.3. — Swine vesicular diseaseLos cultivos se examinan dos veces al día. Si se observa efecto citopático (ECP), se recoge elsobrenadante y se utiliza de antígeno en el ELISA para la identificación del virus. En los cultivos negativosno se aprecia ningún efecto después de 48 o 72 horas, aunque se mantienen en observación durante 3días más. Cuando se aísla el virus de heces en las que la cantidad de virus presente puede ser baja, puedeser necesario un tercer pase del cultivo celular.b) Métodos inmunológicos• EnzimoinmunoensayoPara la detección del antígeno vírico de la EVP se ha preferido utilizar un ELISA indirecto tipo “sándwich” enlugar de la prueba de fijación del complemento. La prueba es la misma que se utiliza para el diagnóstico dela FA. Se recubren dos hileras de pocillos de las placas ELISA con antisuero de conejo contra el virus de laEVP. Este es el suero de captura. Se añaden las suspensiones de los sueros problema a cada una de lashileras. Se incluyen también los controles apropiados. En la siguiente fase se añade el suero detector decobaya, seguido de la adición del suero anticobaya de conejo conjugado con peroxidasa de rábano. Sehace un lavado exhaustivo entre cada etapa para eliminar los reactivos que no se hayan unido. La reacciónpositiva se pone de manifiesto si se produce una reacción de color al añadir un cromógeno(ortofenilendiamina) y un substrato (H 2 O 2 ). En el caso de las reacciones fuertemente positivas el resultadoserá evidente a simple vista, pero los resultados se pueden leer también por espectrofotometría a 492 nm,en cuyo caso una lectura de absorbancia de ≥0,1 por encima del nivel de fondo indica una reacción positiva.Como alternativa a los antisueros de cobaya y de ratón, se pueden emplear también anticuerposmonoclonales apropiados (MAb), adheridos a la placa ELISA y utilizados como anticuerpo de captura oconjugados con peroxidasa como anticuerpo de rastreo.Para estudiar la variación antigénica entre las cepas del virus EVP, se puede utilizar también un ELISAbasado en los MAb. Los antígenos virales obtenidos en cultivos celulares son capturados por un antisuerode conejo hiperinmune frente al virus de la EVP adherido a la fase sólida. Después se hacen reaccionar conun grupo de MAb apropiados, y la unión de los MAb a las cepas de campo se compara con la unión a lascepas originales. Una unión fuerte indica la presencia de epítopos compartidos por la cepa original y lascepas de campo (1).c) Muestras fecalesi) Se resuspende el material fecal (aproximadamente 20 g) en una cantidad mínima de tampón fosfato(0,04 M de tampón fosfato o PBS).ii)iii)iv)Se deja en agitación o en un homogenizador rotatorio a 4°C durante toda la noche.Se clarifica por centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos, en una centrífuga de alta velocidad.Se recoge el sobrenadante y se inoculan cinco tubos de células IB-RS 2 con 0,2 ml por tubo. Sepermite la adsorción a 37°C durante 1 hora, sin agitación. Se lavan los tubos con PBS tres veces. Seañade medio de mantenimiento sin suero (2 ml/tubo), y se incuban a 37°C colocados en una gradillagiratoria o en un aparato alternativo apropiado que permita la agitación de los medios de cultivo.v) El sobrenadante restante se centrifuga a 28.000 rpm durante tres horas. Esto concentrará cualquiervirus que haya en el sobrenadante en bajas cantidades.vi) Se desecha el sobrenadante, y el precipitado se resuspende en 2 ml de PBS, sonicándolobrevemente. Se añade un volumen igual de Freón y se agitan 2–3 ml. Se centrifugan a 4.000 rpmdurante 10 minutos en una centrífuga de mesa. Se elimina el sobrenadante.vii)Se inoculan cinco tubos de cultivo de tejidos como en el paso (iv).viii) Los tubos se incuban a 37°C durante 3 días, observándolos diariamente en busca de la aparición deECP.ix)Si no hay pruebas de ECP transcurridos tres días, los cultivos celulares se congelan y descongelan, yse realiza un pase ciego en tubos de células IB-RS-2 frescas. Se incuban durante tres días más,examinando los tubos diariamente como antes.x) Se recoge el sobrenadante de los tubos que muestren ECP y se confirma la presencia del virus de laEVP mediante la técnica ELISA (u otra prueba apropiada).xi) Si no hay ECP después del segundo pase, la muestra se declarará como NVD (ningún virusdetectado).d) Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicosLos métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos pueden utilizarse para la detección del genoma víricode la EVP en material clínico utilizando la trascripción inversa, seguida de la reacción en cadena de la152 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.3. — Enfermedad vesicular porcinapolimerasa (PCR), y para establecer las relaciones entre los aislados del virus de la EVP, mediante ladeterminación de las secuencias de nucleótidos de parte del genoma. La secuenciación deaproximadamente 200 nucleótidos dentro del gen 1D, que codifica la principal proteína estructural VP1, hapermitido agrupar las cepas del virus de la EVP en función de la homología de sus secuencias, y relacionarepidemiológicamente las cepas causantes de la enfermedad en distintas regiones o en épocas diferentes(2). Con el fin de mejorar la sensibilidad del diagnóstico, se han desarrollado las técnicas que utilizan laPCR. Se ha descrito una PCR que combina la extracción de RNA, mediante el uso de columnas de gel desílice, comercialmente disponibles, con una trascripción inversa acoplada a la PCR (RT-PCR), utilizandopara esto cebadores que corresponden a regiones muy conservadas de los genes 1C y 1D (7). La técnicaes rápida, detecta todos los genotipos del virus de la EVP y es suficientemente sensible para su uso enmuestras obtenidas de casos de sospecha de enfermedad clínica. Cuando se sospeche de infecciónsubclínica o cuando las muestras se recojan después de determinarse clínicamente la enfermedad, una RT-PCR anidada, más sensible, puede combinarse con un método de extracción de RNA más elaborado, paraconformar un sistema de detección tan sensible, al menos, y considerablemente más rápido, como el pasemúltiple en cultivo de tejidos. Varios laboratorios han desarrollado ensayos alternativos de PCR utilizandodiferentes protocolos (3, 10, 11).2. Pruebas serológicasNormalmente la enfermedad vesicular porcina se diagnostica sólo con los datos aportados por las pruebasserológicas. Debido a la naturaleza subclínica o leve de la enfermedad, la primera sospecha de la enfermedad setiene con frecuencia después de las pruebas serológicas rutinarias que se realizan para la vigilancia de laenfermedad o para el certificado de exportación. Para la detección de anticuerpos contra el virus de la EVP sehan utilizado la prueba de neutralización vírica (NV), la de inmunodifusión doble, la de inmunodifusión radial, lade contra-inmunoelectroforesis y el ELISA (1, 4, 5). Las pruebas de NV y ELISA se han utilizado másfrecuentemente. La prueba de NV es la prueba estándar aceptada, pero tiene la desventaja de que lleva 2–3 díascompletarla, y requiere instalaciones para cultivo celular. El ELISA es más rápido, y puede estandarizarse conmayor facilidad. Una pequeña proporción de los sueros procedentes de animales que no han estado previamenteexpuestos al virus de la EVP reaccionarán positivamente en pruebas serológicas de detección de anticuerposcontra el virus de la EVP. El ELISA de competición que emplea el MAb 5B7 (MAC-ELISA) ha sido una técnicafiable para la detección de anticuerpos de la EVP (1). Hasta el 1%, aproximadamente, de los resultados de lossueros de cerdos normales son dudosos o positivos mediante el MAC-ELISA, y deben probarse de nuevomediante la prueba de NV. De estos sueros, también resultarán positivos en la prueba de NV hasta el 10%,aproximadamente (es decir, el 0,1% de la población original). Se pueden considerar como no infectados losanimales que den positivo mediante ELISA pero negativo en la prueba de NV. Deben recogerse muestrasrepetidas de animales que den positivo en ambas pruebas y también de sus cohortes. Una titulación constante odecreciente del título en el animal positivo y la ausencia de anticuerpos contra el virus de la EVP en las cohortesconfirma el estado del animal positivo como un “positivo aislado”. Se desconocen los factores responsables de laaparición de los “animales positivos aislados”. La reactividad serológica cruzada con el virus de la EVP podríadarse debido a la infección por otro picornavirus, aunque aún sin identificar, o puede deberse a factoresinespecíficos presentes en el suero. Puede resultar útil la identificación del isotipo del anticuerpo que se halla enlos sueros positivos (1), puesto que los sueros de los cerdos infectados contienen normalmente IgG específicasola o IgG e IgM, mientras que los sueros de los “animales positivos aislados” contienen, exclusivamente, IgM.a) Neutralización vírica (prueba prescrita para el comercio internacional)La microprueba cuantitativa de NV de detección de anticuerpos frente al virus de la EVP se lleva a caboutilizando células IB-RS-2 (o células de cerdo susceptibles apropiadas) en placas de microtitulación defondo plano para cultivos de tejidos.Se hace crecer el virus en monocapas de células IB-RS-2 y, después de añadir un volumen igual deglicerol, se guarda a –20°C. Se ha observado que el virus de la EVP es estable en estas condicionesdurante al menos 1 año. Antes de probar los sueros, se inactivan a 56°C durante 30 minutos. Un medioapropiado para el cultivo es el medio completo de Eagle/LYH con antibióticos.Esta es una prueba de volúmenes iguales en la que se utilizan volúmenes de 50 µl.i) A partir de una dilución 1/4, se hacen diluciones seriadas con un factor de dilución 2 de los sueros enlas placas, empleando dos hileras de pocillos para cada uno de los sueros problema.ii)Se añade el virus previamente titulado. Cada volumen de 50 µl de suspensión vírica contienealrededor de 100 DICC 50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular).iii)iv)Se incluyen los siguientes controles: un suero fuertemente positivo, un suero débilmente positivo y unsuero negativo, un control celular, un control de medio de cultivo y una titulación del virus utilizadapara calcular el título vírico real empleado en la prueba.Se cubren las placas y se incuban a 37°C durante 1 hora.Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 153

Capítulo 2.1.3. — Swine vesicular diseasev) Se prepara una suspensión celular de 10 6 células/ml en medio con suero bovino al 10% a fin defavorecer el crecimiento celular. Se añaden 50 µl de esta suspensión celular a cada pocillo.vi) Se sellan las placas con cinta sensible a la presión y se incuban a 37°C durante 2–3 días.Alternativamente, las placas pueden taparse con cubiertas no herméticas e incubarse a 37°C en unaatmósfera con dióxido de carbono al 5% durante 2-3 días.vii) Al cabo de 48 horas, se pueden realizar las lecturas al microscopio. Finalmente se fijan las placas y,normalmente, se tiñen al tercer día. La fijación se realiza con formalina/solución salina al 10% durante30 minutos. La tinción se realiza sumergiendo las placas durante 30 minutos en azul de metileno al0,05% preparado en formalina al 10%. Las placas se enjuagan con agua corriente.viii) Los tapices celulares teñidos de azul constituyen los resultados positivos; los pocillos negativos estánvacíos. Los títulos se expresan por la dilución final del suero presente en las mezclas de suero/virusque corresponden al 50% a punto final. La prueba se considerará válida cuando la cantidad de viruspor pocillo realmente utilizada se encuentre entre 10 1,5 y 10 2,5 DICC 50 , y el título del suero estándarpositivo se encuentre dentro de los límites del doble de su título esperado.ix)Interpretación de los resultados: En el Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de laOIE/FAO (véase nota a pie de página 1), se considera negativo un título de NV inferior o igual a 1/11.Un título comprendido entre 1/16 y 1/32 es dudoso, y se considera positivo un título igual o superior a1/45. Sin embargo, dado que los títulos dependen del sistema celular empleado, los laboratorioshabrán de establecer sus propios criterios tomando como referencia los reactivos estándares que seencuentran disponibles en el Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la OIE/FAO.b) EnzimoinmunoensayoEn el ELISA desarrollado por Brocchi et al. (1), el antígeno vírico de la EVP es capturado en la fase sólidautilizando el MAb 5B7. A continuación se evalúa la capacidad de los sueros problema para inhibir la unióndel anticuerpo MAb 5B7 conjugado con peroxidasa al antígeno capturado. Finalmente se detecta lacantidad del MAb conjugado unido, mediante la adición de substrato y cromógeno.i) Se revisten las placas ELISA con 50 µl/pocillo de MAb 5B7 a una dilución de 10 µg/ml, en tampóncarbonato/bicarbonato, pH 9,6, y se incuban a 4°C durante toda la noche.ii)Se lavan las placas tres veces con PBS más Tween 20 al 0,05%, y se añaden 50 µl de antígeno de laEVP (el virus de la EVP se ha hecho crecer en células IB-RS-2, se ha clarificado, filtrado e inactivado)a una dilución óptima predeterminada. La dilución óptima del antígeno se determina mediante lastitulaciones de doble entrada del antígeno y del MAb conjugado que definen la dilución de trabajo,presentando un valor de absorbancia situado en la parte superior de la región lineal de la curva detitulación del antígeno (entre 1,5 y 2,0 unidades de densidad óptica). A continuación se incuban lasplacas a 37°C durante 1 hora.iii) Después de tres lavados adicionales, se incuban 50 µl de los sueros problema diluidos (noinactivados) y de los sueros control con el antígeno capturado a 37°C durante 1 hora. Los sueros sesometen a diluciones seriadas con un factor de dilución 3 directamente en los pocillos de las placasELISA, añadiendo 10 µl de suero a 65 µl de tampón (dilución 1/7,5) transfiriendo a continuación 25 µl alos pocillos consecutivos, que contienen 50 µl de tampón mezclando y desechando finalmente 25 µl.iv)Después de 1 hora de incubación, se añaden 25 µl de una dilución óptima de MAb 5B7 conjugado conperoxidasa (véase la etapa (ii)) a cada pocillo, y se incuban las placas a 37°C, durante 1 hora más.v) Después de una serie final de lavados, se inicia la reacción colorimétrica mediante la distribución de50 µl por pocillo de la solución substrato (0,5 mg/ml ortofenilendiamina en tampón fosfato/citrato, pH 5,más H 2 O 2 al 0,02%).vi)Transcurridos 10 minutos, se detiene la reacción añadiendo 50 µl de ácido sulfúrico 2 N. Se lee laabsorbancia a 492 nm utilizando un lector de microplacas.El antígeno, los sueros y el conjugado se diluyen en PBS (pH 7,4) que contenga Tween 20 al 0,05% yextracto de levadura al 1%; el tampón de dilución para los sueros contiene, además, suero de ratón al 1,0%,bien recubriendo la placa o conjugado con peroxidasa, para impedir la unión inespecífica del suero de cerdoal MAb 5B7.vii)Controles: Cuatro pocillos de cada placa con todos los reactivos, excepto el suero problema, paraconfirmar la lectura de máxima absorbancia para el antígeno; el suero procedente de un cerdoconvaleciente a cuatro diluciones seleccionadas; el suero de un cerdo negativo y un suero estándar decerdo débilmente positivo.viii) Interpretación de los resultados: Las reacciones se expresan por el porcentaje de inhibición de lareacción del MAb con el antígeno de la EVP, causado por cada suero problema. Si el porcentaje deinhibición medio en las diluciones 1/7,5 y 1/22,5 es más del 70%, los sueros se consideran154 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Capítulo 2.1.3. — Enfermedad vesicular porcinafuertemente positivos. Los sueros que registren una media de más del 70% de inhibición en la dilución1/7,5, pero menos del 70% de inhibición en la dilución 1/22,5 se consideran débilmente positivos odudosos. Se consideran negativos los sueros que muestren menos del 70% de inhibición en ambasdiluciones. Deberán confirmarse todos los resultados positivos y los dudosos utilizando la prueba deNV.SUEROS DE REFERENCIA ESTÁNDAR PARA LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS DE LA EVPEl Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la FAO/OIE mantiene una serie de sueros dereferencia que han sido exhaustivamente validados por los Laboratorios de Referencia Nacionales de la EVP delos Estados Miembros de la Unión Europea.C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICOActualmente no existen vacunas disponibles comercialmente de EVP. Los sueros estándar pueden obtenerse delLaboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la OIE/FAO (véase nota a pie de página 1). Elanticuerpo MAb 5B7 puede conseguirse en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la enfermedad vesicularporcina, que se encuentra en Italia (véase el cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual).REFERENCIAS1. BROCCHI E., BERLINZANI A., GAMBA D. & DE SIMONE F. (1995). Development of two novel monoclonal antibodybasedELISAs for the detection of antibodies and the identification of swine isotypes against swine vesiculardisease virus. J. Virol. Methods, 52, 155–167.2. BROCCHI E., ZHANG G., KNOWLES N.J., WILSDEN G., MCCAWLEY J.W., MARQUARDT O., OHLINGER V.F. & DESIMONE F. (1997). Molecular epidemiology of recent outbreaks of swine vesicular disease: two geneticallyand antigenically distinct variants in Europe, 1987–1994. Epidemiol. Infect., 118, 51–61.3. CALLENS M. & DE CLERCQ K. (1999). Highly sensitive detection of swine vesicular disease virus based on asingle tube RT-PCR system and DIG-ELISA detection. J. Virol. Methods, 77, 87–99.4. DONALDSON A.I., FERRIS N.P., KNOWLES N.J. & BARNETT I.T.R. (1983). Comparative studies of United Kingdomisolates of swine vesicular disease virus. Res. Vet. Sci., 35, 295–300.5. GOLDING S.M., HEDGER R.S., TALBOT P. & WATSON J. (1976). Radial immunodiffusion and serumneutralisation techniques for the assay of antibodies to swine vesicular disease. Res. Vet. Sci., 20, 142–147.6. KITCHING R.P. & DONALDSON A.I. (1987). Collection and transportation of specimens for vesicular virusinvestigation. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 6, 263–272.7. LIN F., MACKAY D.K.J. & KNOWLES N.J. (1997). Detection of swine vesicular disease virus RNA by reversetranscription-polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 65, 111–121.8. LOXAM J.R. & HEDGER R.S. (1983). Swine vesicular disease: clinical signs, diagnosis, epidemiology andcontrol. Rec. sci. tech. Off. int. Epiz., 2, 11–24.9. MANN J.A. (1981). Swine vesicular disease. In: Virus Diseases of Farm Animals, Vol. 2, Gibbs E.P.J., ed.Academic Press, London, UK, 365–381.10. NUNEZ J.I., BLANCO E., HERNANDEZ T., GOMEX-TEJEDOR C., MARTIN M.I., DOPAZO J. & SOBRINO F. (1998). A RT-PCR assay for the differential diagnosis of vesicular viral diseases of swine. J. Virol. Methods, 72, 227–235.11. VANGRYSPERRE W. & DE CLERCQ K. (1996). Rapid and sensitive polymerase chain reaction based ondetection and typing of foot-and-mouth disease virus in clinical samples and cell culture isolates, combinedwith a simultaneous differentiation with other genomically and/or symptomatically related viruses. Arch.Virol., 141, 331–344.** *NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Enfermedad vesicular porcina (ver Cuadro en laparte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una listaactualizada: www.oie.int)Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 155