enfermedad vesicular porcina - Oficina Regional de la FAO para ...

Capítulo 2.1.3. — Swine vesicular diseaseLos cultivos se examinan dos veces al día. Si se observa efecto citopático (ECP), se recoge elsobrenadante y se utiliza de antígeno en el ELISA para la identificación del virus. En los cultivos negativosno se aprecia ningún efecto después de 48 o 72 horas, aunque se mantienen en observación durante 3días más. Cuando se aísla el virus de heces en las que la cantidad de virus presente puede ser baja, puedeser necesario un tercer pase del cultivo celular.b) Métodos inmunológicos• EnzimoinmunoensayoPara la detección del antígeno vírico de la EVP se ha preferido utilizar un ELISA indirecto tipo “sándwich” enlugar de la prueba de fijación del complemento. La prueba es la misma que se utiliza para el diagnóstico dela FA. Se recubren dos hileras de pocillos de las placas ELISA con antisuero de conejo contra el virus de laEVP. Este es el suero de captura. Se añaden las suspensiones de los sueros problema a cada una de lashileras. Se incluyen también los controles apropiados. En la siguiente fase se añade el suero detector decobaya, seguido de la adición del suero anticobaya de conejo conjugado con peroxidasa de rábano. Sehace un lavado exhaustivo entre cada etapa para eliminar los reactivos que no se hayan unido. La reacciónpositiva se pone de manifiesto si se produce una reacción de color al añadir un cromógeno(ortofenilendiamina) y un substrato (H 2 O 2 ). En el caso de las reacciones fuertemente positivas el resultadoserá evidente a simple vista, pero los resultados se pueden leer también por espectrofotometría a 492 nm,en cuyo caso una lectura de absorbancia de ≥0,1 por encima del nivel de fondo indica una reacción positiva.Como alternativa a los antisueros de cobaya y de ratón, se pueden emplear también anticuerposmonoclonales apropiados (MAb), adheridos a la placa ELISA y utilizados como anticuerpo de captura oconjugados con peroxidasa como anticuerpo de rastreo.Para estudiar la variación antigénica entre las cepas del virus EVP, se puede utilizar también un ELISAbasado en los MAb. Los antígenos virales obtenidos en cultivos celulares son capturados por un antisuerode conejo hiperinmune frente al virus de la EVP adherido a la fase sólida. Después se hacen reaccionar conun grupo de MAb apropiados, y la unión de los MAb a las cepas de campo se compara con la unión a lascepas originales. Una unión fuerte indica la presencia de epítopos compartidos por la cepa original y lascepas de campo (1).c) Muestras fecalesi) Se resuspende el material fecal (aproximadamente 20 g) en una cantidad mínima de tampón fosfato(0,04 M de tampón fosfato o PBS).ii)iii)iv)Se deja en agitación o en un homogenizador rotatorio a 4°C durante toda la noche.Se clarifica por centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos, en una centrífuga de alta velocidad.Se recoge el sobrenadante y se inoculan cinco tubos de células IB-RS 2 con 0,2 ml por tubo. Sepermite la adsorción a 37°C durante 1 hora, sin agitación. Se lavan los tubos con PBS tres veces. Seañade medio de mantenimiento sin suero (2 ml/tubo), y se incuban a 37°C colocados en una gradillagiratoria o en un aparato alternativo apropiado que permita la agitación de los medios de cultivo.v) El sobrenadante restante se centrifuga a 28.000 rpm durante tres horas. Esto concentrará cualquiervirus que haya en el sobrenadante en bajas cantidades.vi) Se desecha el sobrenadante, y el precipitado se resuspende en 2 ml de PBS, sonicándolobrevemente. Se añade un volumen igual de Freón y se agitan 2–3 ml. Se centrifugan a 4.000 rpmdurante 10 minutos en una centrífuga de mesa. Se elimina el sobrenadante.vii)Se inoculan cinco tubos de cultivo de tejidos como en el paso (iv).viii) Los tubos se incuban a 37°C durante 3 días, observándolos diariamente en busca de la aparición deECP.ix)Si no hay pruebas de ECP transcurridos tres días, los cultivos celulares se congelan y descongelan, yse realiza un pase ciego en tubos de células IB-RS-2 frescas. Se incuban durante tres días más,examinando los tubos diariamente como antes.x) Se recoge el sobrenadante de los tubos que muestren ECP y se confirma la presencia del virus de laEVP mediante la técnica ELISA (u otra prueba apropiada).xi) Si no hay ECP después del segundo pase, la muestra se declarará como NVD (ningún virusdetectado).d) Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicosLos métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos pueden utilizarse para la detección del genoma víricode la EVP en material clínico utilizando la trascripción inversa, seguida de la reacción en cadena de la152 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004