enfermedad vesicular porcina - Oficina Regional de la FAO para ...

Capítulo 2.1.3. — Enfermedad vesicular porcinapolimerasa (PCR), y para establecer las relaciones entre los aislados del virus de la EVP, mediante ladeterminación de las secuencias de nucleótidos de parte del genoma. La secuenciación deaproximadamente 200 nucleótidos dentro del gen 1D, que codifica la principal proteína estructural VP1, hapermitido agrupar las cepas del virus de la EVP en función de la homología de sus secuencias, y relacionarepidemiológicamente las cepas causantes de la enfermedad en distintas regiones o en épocas diferentes(2). Con el fin de mejorar la sensibilidad del diagnóstico, se han desarrollado las técnicas que utilizan laPCR. Se ha descrito una PCR que combina la extracción de RNA, mediante el uso de columnas de gel desílice, comercialmente disponibles, con una trascripción inversa acoplada a la PCR (RT-PCR), utilizandopara esto cebadores que corresponden a regiones muy conservadas de los genes 1C y 1D (7). La técnicaes rápida, detecta todos los genotipos del virus de la EVP y es suficientemente sensible para su uso enmuestras obtenidas de casos de sospecha de enfermedad clínica. Cuando se sospeche de infecciónsubclínica o cuando las muestras se recojan después de determinarse clínicamente la enfermedad, una RT-PCR anidada, más sensible, puede combinarse con un método de extracción de RNA más elaborado, paraconformar un sistema de detección tan sensible, al menos, y considerablemente más rápido, como el pasemúltiple en cultivo de tejidos. Varios laboratorios han desarrollado ensayos alternativos de PCR utilizandodiferentes protocolos (3, 10, 11).2. Pruebas serológicasNormalmente la enfermedad vesicular porcina se diagnostica sólo con los datos aportados por las pruebasserológicas. Debido a la naturaleza subclínica o leve de la enfermedad, la primera sospecha de la enfermedad setiene con frecuencia después de las pruebas serológicas rutinarias que se realizan para la vigilancia de laenfermedad o para el certificado de exportación. Para la detección de anticuerpos contra el virus de la EVP sehan utilizado la prueba de neutralización vírica (NV), la de inmunodifusión doble, la de inmunodifusión radial, lade contra-inmunoelectroforesis y el ELISA (1, 4, 5). Las pruebas de NV y ELISA se han utilizado másfrecuentemente. La prueba de NV es la prueba estándar aceptada, pero tiene la desventaja de que lleva 2–3 díascompletarla, y requiere instalaciones para cultivo celular. El ELISA es más rápido, y puede estandarizarse conmayor facilidad. Una pequeña proporción de los sueros procedentes de animales que no han estado previamenteexpuestos al virus de la EVP reaccionarán positivamente en pruebas serológicas de detección de anticuerposcontra el virus de la EVP. El ELISA de competición que emplea el MAb 5B7 (MAC-ELISA) ha sido una técnicafiable para la detección de anticuerpos de la EVP (1). Hasta el 1%, aproximadamente, de los resultados de lossueros de cerdos normales son dudosos o positivos mediante el MAC-ELISA, y deben probarse de nuevomediante la prueba de NV. De estos sueros, también resultarán positivos en la prueba de NV hasta el 10%,aproximadamente (es decir, el 0,1% de la población original). Se pueden considerar como no infectados losanimales que den positivo mediante ELISA pero negativo en la prueba de NV. Deben recogerse muestrasrepetidas de animales que den positivo en ambas pruebas y también de sus cohortes. Una titulación constante odecreciente del título en el animal positivo y la ausencia de anticuerpos contra el virus de la EVP en las cohortesconfirma el estado del animal positivo como un “positivo aislado”. Se desconocen los factores responsables de laaparición de los “animales positivos aislados”. La reactividad serológica cruzada con el virus de la EVP podríadarse debido a la infección por otro picornavirus, aunque aún sin identificar, o puede deberse a factoresinespecíficos presentes en el suero. Puede resultar útil la identificación del isotipo del anticuerpo que se halla enlos sueros positivos (1), puesto que los sueros de los cerdos infectados contienen normalmente IgG específicasola o IgG e IgM, mientras que los sueros de los “animales positivos aislados” contienen, exclusivamente, IgM.a) Neutralización vírica (prueba prescrita para el comercio internacional)La microprueba cuantitativa de NV de detección de anticuerpos frente al virus de la EVP se lleva a caboutilizando células IB-RS-2 (o células de cerdo susceptibles apropiadas) en placas de microtitulación defondo plano para cultivos de tejidos.Se hace crecer el virus en monocapas de células IB-RS-2 y, después de añadir un volumen igual deglicerol, se guarda a –20°C. Se ha observado que el virus de la EVP es estable en estas condicionesdurante al menos 1 año. Antes de probar los sueros, se inactivan a 56°C durante 30 minutos. Un medioapropiado para el cultivo es el medio completo de Eagle/LYH con antibióticos.Esta es una prueba de volúmenes iguales en la que se utilizan volúmenes de 50 µl.i) A partir de una dilución 1/4, se hacen diluciones seriadas con un factor de dilución 2 de los sueros enlas placas, empleando dos hileras de pocillos para cada uno de los sueros problema.ii)Se añade el virus previamente titulado. Cada volumen de 50 µl de suspensión vírica contienealrededor de 100 DICC 50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular).iii)iv)Se incluyen los siguientes controles: un suero fuertemente positivo, un suero débilmente positivo y unsuero negativo, un control celular, un control de medio de cultivo y una titulación del virus utilizadapara calcular el título vírico real empleado en la prueba.Se cubren las placas y se incuban a 37°C durante 1 hora.Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 153