Recomendaciones para la determinación de biomarcadores en el ...

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 27/01/2013. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.24 J.J. Gómez et alsistemas de preparación y envío de la muestra, así como derecepción de resultados.Pacientes susceptibles de determinaciones molecularesDada la dificultad de obtención de la muestra, el costeeconómico y el incremento de trabajo, es necesario haceruna correcta selección de los pacientes candidatos para elestudio de biomarcadores. A la espera de los resultados delos estudios en marcha con crizotinib y otros fármacos, demomento a nivel asistencial solo es preciso determinar lapresencia de mutaciones de EGFR en todos los pacientescon histología de carcinoma no escamoso y en los pacientesno fumadores, independientemente del tipo histológico quetengan.Aunque hasta el momento la decisión sobre a qué pacientesdebe realizarse el estudio de mutaciones de EGFR la hatomado mayoritariamente el oncólogo, es deseable que ladeterminación se haga sistemáticamente en el estudio diagnósticoinicial en pacientes con enfermedad avanzada. Estaaproximación deberá ser común para todos los biomarcadoresque se incorporen a la práctica diaria.Optimización de la obtención de la muestraCon el fin de obtener la mayor cantidad de material tumoralposible para la determinación, sería recomendable facilitarla existencia de vías de comunicación entre los facultativosque obtienen la muestra (especialmente neumólogos,cirujanos torácicos y radiólogos) y los patólogos correspondientes.Disponer de información clínica ----como por ejemploel hábito tabáquico---- ayudará a los patólogos a trabajar deacuerdo a los algoritmos propuestos. Esto también requerirárevisar los protocolos existentes en los centros respectoa la toma de muestras, conservación y transporte hasta losservicios de anatomía patológica.ambiente durante largos periodos de tiempo. Aunque con unmínimo de 150 células se pueden realizar estudios moleculares,es a partir de 300-1.000 cuando se obtienen resultadosfiables 52 . Si no se dispone de citología en fase líquida, unabuena opción es la fabricación de botones celulares.Ante biopsias de pequeño tamaño es importante observarla fijación (formol tamponado al 10% a pH de 7,2 durante 6 a24 h) y aprovechar todo el tejido. Para ello, se pueden reservarlos cortes del desbastado de los bloques de parafina parala extracción de ADN, colocando los cortes en tubos Eppendorf,y luego realizar secciones seriadas en portas tratadoscon adhesivos para tinciones de rutina e IHQ o FISH.En caso necesario, se pueden reutilizar preparaciones yateñidas para recuperar tejido y/o células, incluso de casosya archivados. Los resultados obtenidos a partir de preparacionescitológicas son superponibles a los de las biopsias ypiezas quirúrgicas, por lo que ambos tipos de muestras sonválidas para estudios moleculares 53 .Si se reciben biopsias intraoperatorias o tejido en fresco,es aconsejable seleccionar un fragmento de material tumoralrepresentativo y, mejor aún, otro de tejido no tumoraltambién, que se congele en no más de 30 min tras su extracciónpara su crioconservación, siendo de utilidad el uso deconservantes como RNA-later que preservan la calidad delARN.Algoritmo diagnósticoEn la figura 2 se propone un posible algoritmo diagnósticopara pacientes con CPNM avanzado, aunque hay que teneren cuenta que cada proceso diagnóstico debe adaptarse alas características individuales de cada paciente y el manejomultidisciplinar que debe tener esta patología.Preparación de la muestraEn el cáncer de pulmón se pueden destacar tres peculiaridades:a) la mayoría de los pacientes no son susceptiblesde tratamiento quirúrgico, por lo que las muestras disponiblespara realizar el diagnóstico suelen ser citologías obiopsias pequeñas. Por esta razón, es fundamental optimizarsu procesamiento para obtener la mayor informaciónútil posible; b) los avances científicos recientes están modificandolas estrategias diagnósticas y terapéuticas, y c) laheterogeneidad tumoral en estos carcinomas es relevante.Cualquiera que sea la entrada del paciente en el proceso,ha de ser evaluado en el comité de tumores del centro paradecidir las actuaciones a seguir, entre las que se encuentra latoma de muestras para el diagnóstico cito-histopatológico,fenotípico y molecular.Es aconsejable realizar una valoración y procesamientode la muestra citológica obtenida en cuanto se recibe enel laboratorio para informar de la representatividad, de lacalidad y de la celularidad del material disponible e intentarhacer una aproximación diagnóstica que facilite la continuidaddel proceso asistencial. Para ello, es recomendableutilizar citología en fase líquida, pues evita artefactos yextensiones defectuosas y permite obtener preparacionesde gran calidad para realizar estudios morfológicos, fenotípicosy obtener además ADN y/o ARN del material celularexcedente, pudiendo además conservarse a temperaturaInterpretación de resultadosLos resultados de las pruebas referentes a la presencia dela mutación en el gen del EGFR deben ser inequívocos. Sehan descrito numerosas mutaciones diferentes en este gen,pero solamente las que se centran en el exón 19 (delecionesalrededor del dominio LREA) y las mutaciones puntuales enel exón 21 (L858R) han demostrado tener valor predictivoen cuanto a la respuesta a los ITK-EGFR. Se han descritoademás otras mutaciones, mucho menos frecuentes, particularmenteen los codones 718 y 719 del exón 18, en elexón 21 (L861Q) y en el exón 20 (deleciones/inserciones)cuyo significado es incierto y están en continua revisión enla literatura.Cabe señalar también que los estudios moleculares permitendetectar un rango más o menos amplio de mutacionesen función de la técnica utilizada. Estas limitaciones convienereflejarlas en el informe, de manera que se conozcael alcance real del resultado que está valorando.Por otra parte, se desconoce el impacto clínico quepuede tener la detección de mutaciones por técnicas muysensibles, como la coamplificación a temperaturas de desnaturalizaciónmás bajas (COLD-PCR, COLD-pirosecuenciación,etc.), desaconsejándose en el momento actual su uso en elámbito asistencial.