Auto-HTAP - centre maladies rare cochin

Look 2100XL, UMAX Data Systems Inc., Taipei, Taiwan), suivie d’une analyse des spots d’un
point de vue qualitatif, quantitatif et statistique à l’aide du logiciel d’analyse d’images IMAGE
MASTER TM 2D PLATINUM © (version 5.0, Amersham Biosciences) possédant en particulier des
outils puissants d’analyse statistique particulièrement adaptés à la recherche biomédicale. Une
adaptation à l’analyse de blots 2D des macros utilisées pour l’analyse des gels 1D a été effectuée
dans notre laboratoire (56).
VI - 5 - 3 - c - Technique d'immunoblot quantitatif 2-D
Une fois la migration des protéines achevée, les protéines sont transférées sur des membranes de
PVDF puis mises en contact avec les sérums. La quantification des réactivités est réalisée en
densitométrie à l'aide d'un scanner haute résolution (Epson Perfection 1240S; Seiko Epson Corp.,
Nagano-Ken, Japon). Les membranes sont ensuite colorées à l'or colloïdal afin de révéler les
bandes protéiques transférées (Protogold®, British BioCell International, Cardiff, R.U.).
VI - 5 - 3 - d - Spectrométrie de masse
Grâce à des progrès en instrumentation (gains très importants en sensibilité et résolution), la
spectrométrie de masse permet aujourd’hui d'identifier rapidement une protéine repérée sur un
gel. La spectrométrie de masse permet de transformer des molécules dans leur état naturel en
ions à l'état gazeux et d'obtenir leur masse moléculaire en analysant leur rapport de masse/charge.
Dans notre projet, une fois révélées, les taches protéiques reconnues par les IgG d’un groupe de
patients donné mais pas par les autres groupes seront excisées à partir d’un gel identique à ceux
qui sont utilisés pour le transfert. Ces protéines seront ensuite soumises à une digestion enzyma-
tique par une endoprotéase, la trypsine. Les peptides obtenus sont caractéristiques de la protéine
à identifier et seront analysés en spectrométrie de masse MALDI-TOF-TOF (Matrix-Assisted
Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight-Time-of-Flight’). La spectrométrie de masse permet
de mesurer l’empreinte peptidique massique de la protéine
Le point isoélectrique et le poids moléculaire expérimentaux associés à l’empreinte peptidique
massique permettent l’identification des protéines en utilisant un moteur de recherche des ban-
ques de données protéiques. Le moteur de recherche MASCOT (Matrix Science London, GB)
disponible en version 8 biprocesseurs sur la plate-forme protéomique Paris Descartes permet une
identification rapide et un degré de confiance important des protéines candidates.
VI - 5 - 3 - e - Confirmation des cibles antigéniques identifiées
Nous confirmerons ensuite la pertinence des cibles des anticorps anti-CE, anti-fibroblastes et
anti-cellules musculaires lisses vasculaires par des tests ELISA à partir de protéines recombinan-
Auto-HTAP - Version n°1.1 du 19/10/2009 36/56