Les parasites du genre Perkinsus infectant les mollusques : focus ...

Les parasites du genre Perkinsus infectant les
mollusques :
focus sur les bénitiers de Polynésie française
Plan de la présentation
1-Contexte
2-Objectifs de l’étude
3-Résultats obtenus
4-Conclusions /Perspectives
D. Saulnier et al., Séminaire « Bénitier »
UPF, 1 er mars 2013
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1-Contexte
1-Infection à Bonamia ostreae :
2-Infection à Bonamia exitiosa :
3-Infection à Marteilia refringens :
4-Infection à Perkinsus marinus :
5-Infection à Perkinsus olseni :
6-Infection à Candidatus
Xenohaliotis californiensis :
7-Infection à un pseudo-Herpès :
Santé des Mollusques
Infections à déclaration obligatoire
OIE Code aquatique 2011
et espèces sensibles
Ostrea edulis, O. angasi, O. puelchana, O. chilensis, O.
denselammellosa, Crassostrea ariakensis (6 espèces, 2 genres)
Ostrea chilensis, O. angasi, O. edulis (3 espèces, 1 genre)
Ostrea edulis, O. angasi, O.puelchana, O. chilensis, Mytilus edulis,
M.galloprovincialis (6 espèces, 2 genres)
Crassostrea gigas, C. avirginica, C. ariakensis, C. rhizophorae, C.
corteziensis, Mya arenaria, Macoma balthica (7 espèces, 3 genres)
Austrovenus stutchburyi, Tridacna maxima, T. crocea, Pitar rostrata,
Ruditapes philippinarum, R. decussatus, Haliotis rubra, H. laevigata,
H. cyclobates, H. scalaris, Anadara trapezia, Crassostrea gigas, C.
ariakensis, C. sikamea, Pinctada maxima, P. fucata, P. sugillata, P.
martensii (18 espèces, 10 genres)
Haliotis cracherodii, H. sorenseni, H. rufescens, H. tuberculata, H.
corrugata, H. fulgens, H. wallalensis, H. discus-hannai, H. diversicolor
supertexta (9 espèces, 1 genre)
Haliotis diversicolor, H. laevegata, H. rubra, hybrides H. laevegata x H.
rubra (3 espèces, 1 genres)

Impact de maladies infectieuses chez les huîtres cultivées de
France métropolitaine

Cycle parasitaire de Perkinsus olseni chez la palourde R. philippinarum
D’après Choi et al. 2005
50 µm
Hypnospores de P. olseni dans les
branchies de l’huître perlière Pinctada
fucata, d’après Sanil et al. 2009
Trophozoites
dans le tissus
conjonctif du
manteau
(histologie)

Impact de Perkinsus olseni sur la santé des espèces sensibles
1-Croissance des mollusques ralentie
2-Effort de reproduction réduit
3-Apparition de nécroses tissulaires /
réactions inflammatoires / nodules
4-Episodes de mortalité
Selon Sanil et al, 2009, P. olseni serait responsable du déclin de P. fucata dans le
golfe de Mannar en Inde (côte sud-est).
Plus les niveaux d’infestation parasitaire sont importants (charge
parasitaire) et plus l’impact de P. olseni sur la santé des espèces
sensibles est grand.
Evolution de l’index de développement
gonadique (GSI) chez la palourde R.
philippinarum (Corée) selon la saison et la
charge parasitaire, Park et al. 2006

Carte de répartition des différentes espèces de Perkinsus
Les risques de dissémination du parasite
(d’après Petty et al, 2010)
-Transferts d’animaux de zones impactées vers des zones indemnes du fait
principalement des activités aquacoles
-Intervention de vecteurs de transmission : eaux de ballast des navires
commerciaux par exemple, prédateurs, importation de mollusques pour la
consommation humaine, pratiques liées à l’aquariophilie (Sheppard et al ,2008)
“Importation policies regarding importation of T. crocea into the USA,
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… need to be reexamined ».

2-Objectifs de l’étude
Le projet IBENI intègre un volet zoosanitaire qui consiste à évaluer plusieurs
méthodes de diagnostic moléculaire permettant la détection de Perkinsus olseni,
un agent infectieux d’importance zoo sanitaire reconnue.
Ce parasite est même à déclaration obligatoire auprès de l’OIE. Il est de plus
réputé capable d’infester des mollusques du genre Tridacna et Pinctada présents
en Polynésie française.
Il était important de savoir si cet agent infectieux était présent ou non en
Polynésie française afin de l’intégrer dans la gestion des transferts de mollusques
entre zones géographiques indemnes ou pas.
Les outils diagnostics utilisés lors de cette étude ont été validés à partir de
prélèvements tissulaires de bénitiers provenant de différentes îles de Polynésie
française.
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Origine des bénitiers et nature des prélèvements tissulaires
D'après Choi et al, 2010 il existe une forte corrélation entre les charges parasitaires dans un
organe particulier et la charge parasitaire dans l'animal entier
Branchies, masse viscérale ou manteau (palourde)
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Origine Tahiti Tatakoto Gambier Tubuai Hao Mopelia Manihi Takaroa Mataiva Aratika
Traitement individuel pool pool pool pool pool pool pool pool pool
Nombre
d’échant./
pool
Traitement des échantillons de tissus pour l’extraction d’ADN
/ 12 12 10 11 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
228 bénitiers, 24 extraits ADNs

Evaluation / développement de méthodes diagnostiques,
par biologie moléculaire
Méthodes de référence décrites dans le Manuel de l’OIE se déroulant en deux étapes,
utilisant la technique d’amplification en chaîne par la polymérase(PCR).
1 ère PCR ciblant la région ITS de l’ARN ribosomal de toutes les espèces de Perkinsus,
excepté P. qugwadi,
2 ème PCR ciblant la région ITS de l’ARN ribosomal de Perkinsus olseni uniquement,
la sensibilité de cette méthode est grande puisque 1 cellule parasitaire dans 30mg
de tissus total peut être détectée.
Une deuxième méthode diagnostique, par PCR en temps réel (qPCR), non décrite dans la
littérature scientifique, a dans un deuxième temps été développée au LEP afin de pouvoir
détecter et quantifier les niveaux d’infestation du bénitier par P. olseni.

3-Résultats obtenus
De l’ADN de Perkinsus sp. et de P. olseni est détecté en PCR classique (+)
Origine Identification des PCR de détection d’ADN PCR de détection d’ADN de
échantillons du genre Perkinsus Perkinsus olseni
B1 + +
TAHITI
B2 + -
B3 + +
TATAKOTO
Pool 1
Pool 2
-
-
-
+
GAMBIER
Pool 3
Pool 4
+
-
+
-
Pool 5 + -
TUBUAI
Pool 6 + -
Pool 7 + +
HAO
Pool 8
Pool 9
+
+
+
+
MOPELIA
Pool 10
Pool 11
-
-
+
+
Pool 12 - -
MANIHI
Pool 13 - +
Pool 14 - -
Pool 15 - -
TAKAROA
Pool 16 - +
Pool 17 + +
MATAIVA
Pool 18
Pool 19
-
-
-
+
ARATIKA
Pool 20
Pool 21
-
-
-
-
Bilan 24 échantillons 10+/24 = 42% 13+/24 = 54%
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De l’ADN de P. olseni est détecté par PCR en temps réel et la cible peut être quantifiée
- Entre 20 et 20 millions de copies du gène ITS de P. olseni présents dans un
échantillon tissulaire à analyser sont quantifiables, du fait de l’excellente efficacité
de la réaction PCRq, proche de 100%.
- Seules 20 copies du gène ITS de Perkinsus olseni sont détectables par PCRq.
Efficacité de 90.5 %
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Résultats de la PCRq
Echantillon Origine
Quantification (nb de copies/mg de
tissu analysé)
B1
32
B2
Tahiti
B3 9
Pool 1
Pool 2
Tatakoto
Pool 3
Pool 4
Gambier
Pool 5
63
Pool 6
Pool 7
Tubuai
Pool 8
Pool 9
Hao
1,8E+05
1,0E+04
Pool 10
Pool 11
Pool 12
Mopelia
Pool 13
Pool 14
Pool 15
Manihi
5
Pool 16
Pool 17
Takaroa
Pool 18
Pool 19
Mataiva
341
Pool 20
Pool 21
Aratika

Diagnostic de confirmation de la présence de Perkinsus en Polynésie
française
clonage des produits PCR obtenues avec les amorces spécifiques du genre Perkinsus ,
à partir des échantillons de bénitier B1, B2 et B3
Séquençage de 1 à 2 clones recombinants /origine de bénitier = 4 séquences,
Alignement des séquences ITS,
Analyse phylogénétique par l’algorithme NJM, 615 sites nucléotidiques analysées.
0.005
92
97
100
P4 bénitier B2
P1 Bénitier B1
Perkinsus mediterraneus isolate11
P6 bénitier B3
Perkinsus honshuensis isolate Mie3
P2 Bénitier B1
Perkinsus olseni isolate Mie13v
Perkinsus marinus isolate Kino0806

4-Conclusions / Perspectives
Démonstration de la présence de Perkinsus olseni et Perkinsus mediterraneus infestant
le bénitier en Polynésie française.
Démonstration de la capacité d’un laboratoire (LEP) présent en Polynésie française à
pouvoir diagnostiquer P. olseni, 1 des 7 agents responsable d’une maladie chez les
Mollusques à déclaration obligatoire auprès de l’OIE, par des outils moléculaires.
Développement d’un test de diagnostic quantitatif (PCRq) des infestations à P. olseni
très sensible : 20 copies/mg de tissus de bénitier, et rapide à mettre en œuvre : moins
de 3 heures à partir d’extraits ADNs.
PCRq : outil diagnostic d’intérêt pour les futures enquêtes d’intérêt épidémiologique et
l’évaluation de l’impact de la Perkinsiose à P. olseni sur les mollusques de Polynésie
française. En effet, d’après la littérature, plus les niveaux d’infestation parasitaire sont
importants (charge parasitaire) et plus l’impact de P. olseni sur la santé des espèces
sensibles est grand.

Existe-t-il d’autres mollusques que le bénitier, présents en Polynésie française, pouvant être
infestés par P. olseni : Pinctada margaritifera en particulier?
Quelle est la répartition géographique de P. olseni à l’échèle des nombreuses îles de Polynésie
française ?
Quelle est la relation entre la prévalence à P. olseni / niveaux d’infestation parasitaires et la
survenue d’épisodes de mortalité pouvant ou ayant pu survenir dans les cheptels de bénitier
présents en Polynésie française ?
Quel est l’impact des co-infections Perkinsus olseni / P. mediterraneus sur la santé des
cheptels de bénitier ?
Y a-t-il d’autres espèces de Perkinsus également présentes en Polynésie française :
P. marinus notamment ?
Peut-on visualiser en histologie les parasites du genre Perkinsus ? sachant que la totalité des
échantillons analysés par biologie moléculaire lors de cette étude ont également été traités, et
à un niveau individuel, afin de permettre des analyses ultérieures en histologie.
Possibilité de traiter en individuel certains lots de bénitiers trouvés fortement infectés par P.
olseni lors de cette étude et analysés en pool, par ex ceux dont l’origine est Hao.
Valorisation des travaux et analyses déjà réalisés sous forme d’une publication dans une revue
à comité de lecture.

Remerciements
L’essentiel du travail de laboratoire a été effectué par Hélène Boulet en CDD à mi temps
à l’U. de Polynésie française (10 sept - 10 déc. 2012) dans le cadre du projet IBENI et
accueilli au sein du Laboratoire Ecosystème Perlicole (LEP) de l’Ifremer Tahiti.
Cette étude a bénéficié de l’aide d’agents de la DRM et de l’IRSN : campagnes
d’échantillonnage en ce qui concerne certains des lots analysées ou/et traitement des
échantillons permettant de différer et grouper les analyses (extraction ADN et
histologie).
Maururu roa