人白介素32（IL-32）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究 ...

人 白 介 素 32(IL-32) 酶 联 免 疫 分 析 试 剂 盒 使 用 说 明 书
本 试 剂 盒 仅 供 研 究 使 用
检 测 范 围 :31.2 pg/ml - 2000 pg/ml
最 低 检 测 限 :7.8 pg/ml
特 异 性 : 本 试 剂 盒 可 同 时 检 测 天 然 或 重 组 的 人 IL-32, 且 与 其 他 相 关 蛋 白 无 交 叉 反 应 。
有 效 期 :6 个 月
预 期 应 用 :ELISA 法 定 量 测 定 人 血 清 、 血 浆 、 细 胞 培 养 上 清 或 其 它 相 关 生 物 液 体 中 IL-32 含
量 。
说 明
1. 试 剂 盒 保 存 :-20℃( 较 长 时 间 不 用 时 );2-8℃( 频 繁 使 用 时 )。
2. 浓 洗 涤 液 低 温 保 存 会 有 盐 析 出 , 稀 释 时 可 在 水 浴 中 加 温 助 溶 。
3. 中 、 英 文 说 明 书 可 能 会 有 不 一 致 之 处 , 请 以 英 文 说 明 书 为 准 。
4. 刚 开 启 的 酶 联 板 孔 中 可 能 会 含 有 少 许 水 样 物 质 , 此 为 正 常 现 象 , 不 会 对 实 验 结 果 造 成 任
何 影 响 。
概 述
IL-32 是 新 近 发 现 的 一 种 炎 症 细 胞 因 子 , 与 疾 病 的 发 生 、 发 展 有 着 密 切 的 关 系 。IL-32 存 在 4
种 剪 接 变 异 体 :IL-32α、IL-32β、IL-32γ 和 IL-32δ, 分 别 为 131 aa、188 aa、234 aa 和 178aa
蛋 白 质 。 人 IL-32 基 因 定 位 在 人 染 色 体 16q13.3 上 , 含 有 8 个 小 外 显 子 , 跨 长 约 为 5kb。 人 IL-32
mRNA 长 为 1.2 kb, 表 达 于 脾 、 胸 腺 、 白 细 胞 、 小 肠 、 结 肠 、 前 列 腺 、 卵 巢 、 睾 丸 里 , 且 在
免 疫 组 织 里 强 于 非 免 疫 组 织 。IL-32 是 一 种 分 泌 型 蛋 白 质 , 内 源 性 IL-32 的 分 子 量 为 27 kDa。
到 目 前 为 止 , 发 现 IL-32 的 主 要 作 用 是 诱 导 细 胞 因 子 的 产 生 。
实 验 原 理
用 纯 化 的 抗 体 包 被 微 孔 板 , 制 成 固 相 载 体 , 往 包 被 抗 IL-32 抗 体 的 微 孔 中 依 次 加 入 标 本 或 标
准 品 、 生 物 素 化 的 抗 IL-32 抗 体 、HRP 标 记 的 亲 和 素 , 经 过 彻 底 洗 涤 后 用 底 物 TMB 显 色 。TMB

在 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 转 化 成 蓝 色 , 并 在 酸 的 作 用 下 转 化 成 最 终 的 黄 色 。 颜 色 的 深 浅 和 样 品
中 的 IL-32 呈 正 相 关 。 用 酶 标 仪 在 450nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 (OD 值 ), 计 算 样 品 浓 度 。
试 剂 盒 组 成 及 试 剂 配 制
1. 酶 联 板 (Assay plate ): 一 块 (96 孔 )。
2. 标 准 品 (Standard):2 瓶 ( 冻 干 品 )。
3. 样 品 稀 释 液 (Sample Diluent):1×20ml/ 瓶 。
4. 生 物 素 标 记 抗 体 稀 释 液 (Biotin-antibody Diluent):1×10ml/ 瓶 。
5. 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 稀 释 液 (HRP-avidin Diluent):1×10ml/ 瓶 。
6. 生 物 素 标 记 抗 体 (Biotin-antibody):1×120μl/ 瓶 (1:100)
7. 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 (HRP-avidin):1×120μl/ 瓶 (1:100)
8. 底 物 溶 液 (TMB Substrate):1×10ml/ 瓶 。
9. 浓 洗 涤 液 (Wash Buffer):1×20ml/ 瓶 , 使 用 时 每 瓶 用 蒸 馏 水 稀 释 25 倍 。
10. 终 止 液 (Stop Solution):1×10ml/ 瓶 (2N H2SO4)。
需 要 而 未 提 供 的 试 剂 和 器 材
1. 标 准 规 格 酶 标 仪
2. 高 速 离 心 机
3. 电 热 恒 温 培 养 箱
4. 干 净 的 试 管 和 Eppendof 管
5. 系 列 可 调 节 移 液 器 及 吸 头 , 一 次 检 测 样 品 较 多 时 , 最 好 用 多 通 道 移 液 器
6. 蒸 馏 水 , 容 量 瓶 等
标 本 的 采 集 及 保 存
1. 血 清 : 全 血 标 本 请 于 室 温 放 置 2 小 时 或 4℃ 过 夜 后 于 1000 x g 离 心 20 分 钟 , 取 上 清 即 可
检 测 , 或 将 标 本 放 于 -20℃ 或 -80℃ 保 存 , 但 应 避 免 反 复 冻 融 。
2. 血 浆 : 可 用 EDTA 或 肝 素 作 为 抗 凝 剂 , 标 本 采 集 后 30 分 钟 内 于 2 - 8° C 1000 x g 离 心 15

分 钟 , 或 将 标 本 放 于 -20℃ 或 -80℃ 保 存 , 但 应 避 免 反 复 冻 融 。
3. 细 胞 培 养 物 上 清 或 其 它 生 物 标 本 :1000 x g 离 心 20 分 钟 , 取 上 清 即 可 检 测 , 或 将 标 本 放
于 -20℃ 或 -80℃ 保 存 , 但 应 避 免 反 复 冻 融 。
注 : 标 本 溶 血 会 影 响 最 后 检 测 结 果 , 因 此 溶 血 标 本 不 宜 进 行 此 项 检 测 。
标 本 的 稀 释 原 则 :
首 先 通 过 文 献 检 索 的 方 式 了 解 待 测 样 本 的 大 致 含 量 , 确 定 适 当 的 稀 释 倍 数 。 只 有 稀 释 至 标 准
曲 线 的 范 围 内 , 检 测 的 结 果 才 是 准 确 的 。 稀 释 的 过 程 中 , 应 做 好 详 细 的 记 录 。 最 后 计 算 浓 度
时 , 稀 释 了 “N” 倍 , 标 本 的 浓 度 应 再 乘 以 “N”。
标 准 品 的 稀 释 原 则 :2 瓶 , 每 瓶 临 用 前 以 样 品 稀 释 液 稀 释 至 1ml, 盖 好 后 静 置 10 分 钟 以 上 ,
然 后 反 复 颠 倒 / 搓 动 以 助 溶 解 , 其 浓 度 为 2000 pg/ml, 做 系 列 倍 比 稀 释 后 , 分 别 稀 释 2000
pg/ml,1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.2 pg/ml, 样 品 稀 释 液
直 接 作 为 标 准 浓 度 0 pg/ml, 临 用 前 15 分 钟 内 配 制 。
如 配 制 1000 pg/ml 标 准 品 : 取 0.5ml( 不 要 少 于 0.5ml)2000 pg/ml 的 上 述 标 准 品 加 入 含 0.5ml
样 品 稀 释 液 的 Eppendorf 管 中 , 混 匀 即 可 , 其 余 浓 度 以 此 类 推 。
生 物 素 标 记 抗 体 的 稀 释 原 则 :
临 用 前 以 生 物 素 标 记 抗 体 稀 释 液 稀 释 , 稀 释 前 根 据 预 先 计 算 好 的 每 次 实 验 所 需 的 总 量 配 制
( 每 孔 100μl), 实 际 配 制 时 应 多 配 制 0.1-0.2ml。 如 10μl 生 物 素 标 记 抗 体 加 990μl 生 物 素 标
记 抗 体 稀 释 液 的 比 例 配 制 , 轻 轻 混 匀 , 在 使 用 前 一 小 时 内 配 制 。
辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 的 稀 释 原 则 :
临 用 前 以 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 稀 释 液 稀 释 , 稀 释 前 根 据 预 先 计 算 好 的 每 次 实 验 所 需 的
总 量 配 制 ( 每 孔 100μl), 实 际 配 制 时 应 多 配 制 0.1-0.2ml。 如 10μl 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和
素 加 990μl 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 稀 释 液 的 比 例 配 制 , 轻 轻 混 匀 , 在 使 用 前 一 小 时 内
配 制 。
操 作 步 骤
实 验 开 始 前 , 请 提 前 配 置 好 所 有 试 剂 , 试 剂 或 样 品 稀 释 时 , 均 需 混 匀 , 混 匀 时 尽 量 避 免 起 泡 。

每 次 检 测 都 应 该 做 标 准 曲 线 。 如 样 品 浓 度 过 高 时 , 用 样 品 稀 释 液 进 行 稀 释 , 以 使 样 品 符 合 试
剂 盒 的 检 测 范 围 。
1. 加 样 : 分 别 设 空 白 孔 、 标 准 孔 、 待 测 样 品 孔 。 空 白 孔 加 样 品 稀 释 液 100μl, 余 孔 分 别 加 标
准 品 或 待 测 样 品 100μl, 注 意 不 要 有 气 泡 , 加 样 将 样 品 加 于 酶 标 板 孔 底 部 , 尽 量 不 触 及 孔 壁 ,
轻 轻 晃 动 混 匀 , 酶 标 板 加 上 盖 或 覆 膜 ,37℃ 反 应 120 分 钟 。
为 保 证 实 验 结 果 有 效 性 , 每 次 实 验 请 使 用 新 的 标 准 品 溶 液 。
2. 弃 去 液 体 , 甩 干 , 不 用 洗 涤 。 每 孔 加 生 物 素 标 记 抗 体 工 作 液 100μl( 取 1μl 生 物 素 标 记 抗
体 加 99μl 生 物 素 标 记 抗 体 稀 释 液 的 比 例 配 制 , 轻 轻 混 匀 , 在 使 用 前 一 小 时 内 配 制 ),37℃,60
分 钟 。
3. 温 育 60 分 钟 后 , 弃 去 孔 内 液 体 , 甩 干 , 洗 板 3 次 , 每 次 浸 泡 1-2 分 钟 ,350μl/ 每 孔 , 甩 干 。
4. 每 孔 加 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 工 作 液 ( 同 生 物 素 标 记 抗 体 工 作 液 ) 100μl,37℃,60
分 钟 。
5. 温 育 60 分 钟 后 , 弃 去 孔 内 液 体 , 甩 干 , 洗 板 5 次 , 每 次 浸 泡 1-2 分 钟 ,350μl/ 每 孔 , 甩 干 。
6. 依 序 每 孔 加 底 物 溶 液 90μl,37℃ 避 光 显 色 (30 分 钟 内 , 此 时 肉 眼 可 见 标 准 品 的 前 3-4 孔
有 明 显 的 梯 度 蓝 色 , 后 3-4 孔 梯 度 不 明 显 , 即 可 终 止 )。
7. 依 序 每 孔 加 终 止 溶 液 50μl, 终 止 反 应 ( 此 时 蓝 色 立 转 黄 色 )。 终 止 液 的 加 入 顺 序 应 尽 量
与 底 物 液 的 加 入 顺 序 相 同 。 为 了 保 证 实 验 结 果 的 准 确 性 , 底 物 反 应 时 间 到 后 应 尽 快 加 入 终 止
液 。
8. 用 酶 联 仪 在 450nm 波 长 依 序 测 量 各 孔 的 光 密 度 (OD 值 )。 在 加 终 止 液 后 15 分 钟 以 内 进
行 检 测 。
注 :
1. 用 户 在 初 次 使 用 试 剂 盒 时 , 应 将 各 种 试 剂 管 离 心 数 分 钟 , 以 便 试 剂 集 中 到 管 底 。
2. 每 次 实 验 留 一 孔 作 为 空 白 调 零 孔 , 该 孔 不 加 任 何 试 剂 , 只 是 最 后 加 底 物 溶 液 及 2N H2SO4。
测 量 时 先 用 此 孔 调 OD 值 至 零 。
3. 为 防 止 样 品 蒸 发 , 试 验 时 将 反 应 板 放 于 铺 有 湿 布 的 密 闭 盒 内 , 酶 标 板 加 上 盖 或 覆 膜 。

4. 未 使 用 完 的 酶 标 板 或 者 试 剂 , 请 于 2-8℃ 保 存 。 标 准 品 、 生 物 素 标 记 抗 体 工 作 液 、 辣 根 过
氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 工 作 液 请 依 据 所 需 的 量 配 置 使 用 。 请 勿 重 复 使 用 已 稀 释 过 的 标 准 品 、 生
物 素 标 记 抗 体 工 作 液 或 、 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 亲 和 素 工 作 液 。
5. 建 议 检 测 样 品 时 均 设 双 孔 测 定 , 以 保 证 检 测 结 果 的 准 确 性 。
洗 板 方 法
手 工 洗 板 方 法 : 吸 去 ( 不 可 触 及 板 壁 ) 或 甩 掉 酶 标 板 内 的 液 体 ; 在 实 验 台 上 铺 垫 几 层 吸 水 纸 ,
酶 标 板 朝 下 用 力 拍 几 次 ; 将 推 荐 的 洗 涤 缓 冲 液 至 少 0.3ml 注 入 孔 内 , 浸 泡 1-2 分 钟 。 根 据 需
要 , 重 复 此 过 程 数 次 。
自 动 洗 板 : 如 果 有 自 动 洗 板 机 , 应 在 熟 练 使 用 后 再 用 到 正 式 实 验 过 程 中 。
计 算
以 标 准 物 的 浓 度 为 横 坐 标 ( 对 数 坐 标 ),OD 值 为 纵 坐 标 ( 普 通 坐 标 ), 在 半 对 数 坐 标 纸 上
绘 出 标 准 曲 线 , 根 据 样 品 的 OD 值 由 标 准 曲 线 查 出 相 应 的 浓 度 ; 再 乘 以 稀 释 倍 数 ; 或 用 标 准
物 的 浓 度 与 OD 值 计 算 出 标 准 曲 线 的 直 线 回 归 方 程 式 , 将 样 品 的 OD 值 代 入 方 程 式 , 计 算 出
样 品 浓 度 , 再 乘 以 稀 释 倍 数 , 即 为 样 品 的 实 际 浓 度 。
注 意 事 项
1. 当 混 合 蛋 白 溶 液 时 应 尽 量 轻 缓 , 避 免 起 泡 。
2. 洗 涤 过 程 非 常 重 要 , 不 充 分 的 洗 涤 易 造 成 假 阳 性 。
3. 一 次 加 样 时 间 最 好 控 制 在 5 分 钟 内 , 如 标 本 数 量 多 , 推 荐 使 用 排 枪 加 样 。
4. 请 每 次 测 定 的 同 时 做 标 准 曲 线 , 最 好 做 复 孔 。
5. 如 标 本 中 待 测 物 质 含 量 过 高 , 请 先 稀 释 后 再 测 定 , 计 算 时 请 最 后 乘 以 稀 释 倍 数 。
6. 在 配 制 标 准 品 、 检 测 溶 液 工 作 液 时 , 请 以 相 应 的 稀 释 液 配 制 , 不 能 混 淆 。
7. 底 物 请 避 光 保 存 。
8. 不 要 用 其 它 生 产 厂 家 的 试 剂 替 换 试 剂 盒 中 的 试 剂 。