Etude d'un vaccin contre la rage animale, à virus inactivé ... - OIE

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1982, 1 (3), 799-809
Etude d'un vaccin contre la rage animale,
à virus inactivé, préparé à partir
d'encéphale ovin
J. BLANCOU*, M.F.A. AUBERT*, L. ANDRAL* et J. GODENIR**
Résumé : Parmi les modes possibles de production de vaccins antirabiques
(à virus inactivé), celui de l'utilisation d'encéphales ovins paraît un
des plus économiques et des plus pratiques lors des campagnes de vaccination
du chien en particulier dans les pays de la zone tropicale.
Les conditions pratiques de production de ce type de vaccin, les titres
en virus obtenus selon l'âge des ovins, les valeurs antigéniques des lots
fabriqués, les titres en anticorps et/ou la résistance à l'épreuve observés
après leur administration au chien (ou au renard) sont rapportés et discutés.
L'étude de ces données indique que les vaccins de ce type répondent aux
recommandations de l'Organisation Mondiale de la Santé. Cependant,
s'ils sont conservés à l'état liquide, ils doivent être utilisés dans les six mois
qui suivent leur fabrication dans les conditions décrites.
Plusieurs explications de l'extension actuelle de la rage dans le monde sont
possibles.
L'une d'entre elles est la résurgence des grandes épizooties de rage selvatique,
particulièrement en Europe et en Amérique du Nord, contre lesquelles les
mesures de prophylaxie s'avèrent d'application très difficile.
L'autre est la difficulté que rencontrent un grand nombre de pays d'Afrique,
d'Asie ou d'Amérique du Sud à venir à bout des épi-enzooties de rage
canine — les plus redoutables pour l'homme — par les méthodes de prophylaxie
sanitaire ou médicale classiques.
L'efficacité de cette dernière, qui consiste en une vaccination de masse de
la population canine, n'est plus à démontrer. Elle reste donc toujours vive-
* Ministère de l'Agriculture, Direction de la Qualité, Services Vétérinaires, Centre National
d'Etudes sur la Rage, BP 9, 54220 Malzéville (France).
** En stage au Centre National d'Etudes sur la Rage.

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ment recommandée, par l'Organisation Mondiale de la Santé, comme « l'une
des armes les plus importantes en matière de contrôle de la rage » (7). Mais
elle se heurte en pratique à la difficulté d'approvisionnement de certains pays
en vaccin antirabique, ou au coût de cet approvisionnement. C'est pourquoi,
après avoir envisagé les diverses solutions pratiques à cette difficulté, une des
propositions les plus concrètes retenues en commission des experts de
l'O.M.S. est celle de favoriser la fabrication, par chacun des pays concernés,
des réserves de vaccins antirabiques nécessaires à leurs campagnes de vaccination
de masse. Une telle proposition n'est concevable, et acceptable, que si les
vaccins ainsi produits sont de prix inférieur à ceux existant sur le marché international,
et d'innocuité et efficacité correspondantes aux normes de l'O.M.S.
(4).
Les types de vaccins qui, techniquement, répondent le mieux à ces exigences
du moins dans une première étape sont les vaccins à virus inactivé (plus
sûrs) produits sur encéphales d'animaux (moins chers) : souris, rats, lapins,
petits ou grands ruminants.
Nous avons choisi, dans la présente communication, de rapporter les résultats
obtenus avec un vaccin produit sur encéphale d'agneau. C'est cette espèce
qui, après d'autres auteurs (2, 3, 5), nous a paru en effet la plus répandue et la
moins onéreuse, d'achat ou d'élevage, dans la plupart des pays concernés par
la rage canine.
Animaux
MATÉRIEL ET MÉTHODES
MATÉRIEL
• Ovins : les ovins utilisés étaient de race croisée Ile-de-France, adultes
(mères), jeunes non sevrés (1 mois) ou juste sevrés (2 mois).
• Chiens : les chiens utilisés pour le titrage d'anticorps post-vaccinaux
étaient des chiens croisés Beagles ou anglo-normands âgés de plus de trois
mois.
• Souris : les souris Swiss, E.O.P.S. utilisées pour le titrage des virus et des
sérums, ou le contrôle des vaccins, étaient de souche OF1 âgées de 3 à 4 semaines
achetées aux Etablissements IFFA-CREDO (69210 Saint-Germain-sur-
PArbresle, France).
Souche de virus
Nous avons employé la souche fixe Challenge Virus Standard (C.V.S.) ellemême
dérivée de la souche Pasteur isolée d'un bovin français en 1882.
Matériel de laboratoire
Outre le matériel usuel nécessaire aux manipulations ou titrages des virus,
sérums et vaccins, nous avons utilisé, pour le broyage des encéphales, un

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broyeur Ultra-Turrax Janke et Kunkel KG 170 w, type TP 18-10 à tige 18 K de
220 mm. Pour les injections intradermiques de contrôle d'activité du vaccin a
été utilisé pour un groupe de chiens, le « Dermojet » AKRA (23 bis, rue
L. Berthou, 64000 Pau, France).
Produits chimiques
L'agent d'inactivation du virus était la Bêta Propiolactone (« B.P.L. »)
pure (OCH2 CH2 CO) Fluka A G Buchs SG (commercialisée par les Etablissements
O.S.I., 141, rue de Javel, 75015 Paris).
• Le phénol rajouté pour éviter les contaminations bactériennes ultérieures
du virus inactivé était du phénol pur, cristallisé, Rhône-Poulenc.
• L'hydroxyde d'alumine, agent adsorbant du virus et adjuvant de
l'immunité, contenant 2,46 mg/ml d'Al + + +
, nous a été aimablement fourni
par les Laboratoires R. Bellon (Usine de la Croisette, Villaines-les-Rochers,
37190 Azay-le-Rideau).
MÉTHODES
Nous ne décrirons ici que la méthode de fabrication des vaccins étudiés, les
méthodes de contrôle du vaccin, par le test des National Institutes of Health
(N.I.H.) ou des sérums par le test de séro-neutralisation sur souris, étant parfaitement
décrites et standardisées par l'O.M.S. (4).
La fabrication du vaccin étudié peut être résumée en trois étapes successives
:
Première étape : Inoculation des ovins
Les ovins sont inoculés par trépanation à l'aide d'une chignolle ordinaire,
munie d'une mèche à bois de 2 mm de diamètre. La trépanation se fait, après
incision et réclinaison et désinfection de la peau et des muscles peauciers sousjacents,
en un point défini comme le milieu d'une ligne imaginaire joignant la
base de l'oreille au centre d'une autre ligne joignant le sommet des deux arcades
osseuses des orbites (Figure 1).
L'inoculum est déposé, à travers l'effraction osseuse ainsi réalisée à l'aide
d'une aiguille de 16 mm (5/10), dans le cortex cérébral. Cet inoculum est constitué
par 0,5 ml de suspension de cerveaux de souris infectées par la souche
C.V.S., et titrant au moins 10 5
Doses létales souris par voie cérébrale. Les
lésions ainsi créées cicatrisent spontanément dans les jours suivants, où les
ovins sont observés quotidiennement.
Seconde étape : Récolte du virus rabique
Les ovins présentent les premiers symptômes de rage 4 à 7 jours après l'inoculation,
et meurent du 5 e au 9 e jour après cette inoculation, selon leur âge. Ils
sont sacrifiés en phase agonique (paralysie, dyspnée) par saignée totale et la

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totalité de leur encéphale est aussitôt extraite selon les méthodes classiques (4)
puis soit traitée immédiatement, soit conservée à - 30 °C durant les quelques
jours qui précèdent le traitement.
Troisième étape : Inactivation du virus, préparation finale du vaccin
Les encéphales*, frais ou congelés, prédécoupés en petits fragments de
quelques grammes, sont pré-broyés dans un volume de soluté tamponné stérile
frais (4 °C) égal à trois fois leur poids. Ce pré-broyage s'effectue à l'Ultra-
Turrax dans un récipient de la hauteur de la tige, à la vitesse maxima (20 000
tours/minute) et durant trois minutes.
La sécurité de ce broyage, générateur d'aérosols de virus, est assurée par
une double enveloppe plastique (Figure 2). A l'issue de ce pré-broyage, un
titrage est effectué par inoculation intracérébrale à la souris et exprimé en dose
létale pour 50 p. 100 des souris par voie intracérébrale (DL 50
/i.c. / souris).
Le pré-broyat est alors additionné d'une quantité de soluté tamponné**
préchauffé à 37° telle que la suspension finale contienne 5 parties d'encéphale
pour 95 de soluté. Cette suspension est filtrée aseptiquement sur gaze stérile et
inactivée aussitôt par addition d'une partie pour cent d'une solution de B.P.L.
à 1/40 réalisée extemporanément. L'inactivation se poursuit alors durant une
heure à 37 °C puis 12 heures à + 4 °C, sous agitation constante, le pH étant
rectifié à 7 si nécessaire en fin d'inactivation. Le vaccin est alors complété par
addition de 2,5 p. 1000 de phénol et d'une partie d'hydroxyde d'alumine pour
trois parties de vaccin inactivé phénolé.
RÉSULTATS
Les résultats des essais faits sur divers lots de vaccins expérimentaux peuvent
être résumés par l'étude des trois critères les plus importants pour un vaccin
antirabique destiné au chien :
— le titre de la suspension virale avant inactivation,
— la valeur antigénique de la suspension après inactivation (test N.I.H.),
— le titre d'anticorps élaborés par les chiens vaccinés.
TITRE DE LA SUSPENSION VIRALE
AVANT INACTIVATION
Ce titre apparaît comme très différent selon que le virus provient du
broyage de l'encéphale d'un ovin adulte (poids moyen d'environ 90 grammes,
après « toilette » des méninges, tissus conjonctifs, vaisseaux, etc.) ou de celui
d'un agneau de 1 à 2 mois (poids moyen de 75 grammes).
* L'encéphale est constitué, dans nos essais, du cerveau, du cervelet et du bulbe rachidien.
** La formule de ce soluté est celle décrite par P. Lépine et coll. (5).

803
Figure 1
Inoculation intracérébrale de l'agneau (souche C.V.S.)
Figure 2
Broyage de la récolte de virus à l'Ultra-Turrax

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Les valeurs respectives moyennes des titres déterminés sur six sujets sont
présentées dans le Tableau I.
Tableau I. — TITRE DE VIRUS PAR GRAMME D'ENCÉPHALE
SELON LES CATÉGORIES D'OVINS
Catégorie de sujets Titre en virus par Intervalle de confiance
gramme d'encéphale au niveau P < 0,05
Brebis adulte 10-4.13 ± 0,73
Agneau non sevré 10-7.22 ± 0,39
Agneau juste sevré 10-7.2 ± 0,48
On constate que s'il n'existe pas de différence significative entre le titre
viral des agneaux non sevrés ou juste sevrés, ce titre est environ 1 200 fois plus
élevé que chez la brebis adulte.
Le gain apparent qui pourrait être escompté d'un poids plus important (90
grammes) de l'encéphale de l'adulte par rapport à celui du jeune (75 grammes)
est évidemment complètement annulé, si l'on considère la quantité de virus
rabique qu'il contient.
VALEUR ANTIGÉNIQUE
DE LA SUSPENSION VIRALE INACTIVÉE
Après vérification de la complète innocuité de la suspension virale inactivée
(par inoculation intracérébrale à des lots de dix souris) sa valeur est appréciée
par le test des N.I.H. utilisant la Préparation nationale de Référence (lot 009)
française comme étalon.
Elle est déterminée en faisant varier trois paramètres :
— la suspension antigénique : liquide ou lyophilisée*,
— la température de conservation de cette suspension : + 4°C, + 20 °C,
ou + 37 °C,
— la durée de conservation de cette suspension aussitôt après fabrication,
3 ou 6 mois plus tard.
L'ensemble des résultats de ces différents titrages en Dose protectrice pour
50 p. 100 des souris (ou en Unités Internationales par ml) est rassemblé dans le
Tableau II.
* La lyophilisation (9) de la suspension a été assurée après mélange dans le substrat saccharosé
recommandé par P. Lépine et coll. (5) en flacon type pénicilline, sur appareil Sérail type CS 3.

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Tableau II. — DOSE PROTECTRICE 50 % ET VALEURS ANTIGÉNIQUES
DES SUSPENSIONS VIRALES INACTIVÉES LIQUIDE OU LYOPHILISÉE
IMMÉDIATEMENT APRÈS FABRICATION ET APRÈS CONSERVATION A 4°,
20° OU 37 °C PENDANT 3 ET 6 MOIS
Température de conservation
Délais
De la suspension liquide
du titrage
(après fabrication) + 4 °C + 20 °C + 37 °C
Aussitôt
après fabrication
3 mois 1,92 ± 0,16
1,6

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intradermique recommandée anciennement chez le chien (8) et redécouverte
récemment chez l'homme (6) nous avons utilisé 36 chiens divisés en quatre
groupes* qui ont reçu respectivement, d'un lot de vaccin préparé trois mois
plus tôt et titrant 1,7 U.I./ml :
• groupe 1 : 0,2 ml administrés par voie intradermique avec une aiguille ;
• groupe 2 : 0,2 ml administrés par voie intradermique « sans aiguille »
(appareil Dermojet) à titre de contrôle de l'effet « technique d'injection intradermique
» du groupe 1 ;
• groupe 3 : 0,2 ml administrés par voie sous-cutanée à titre de contrôle de
l'effet « voie d'injection » des groupes 1 et 2 ;
• groupe 4 : 1 ml administré par voie sous-cutanée, à titre de contrôle de
l'effet « dose d'antigène » du groupe 3.
Le titre d'anticorps élaboré 25 à 40 jours après cette injection dans les quatre
groupes a été déterminé par la technique de séro-neutralisation sur souris
(4). Ils sont rassemblés dans le Tableau III et exprimés soit en Dose protectrice
pour 50 % des souris, soit en Unités Internationales par ml. Ce tableau n'indique
que la moyenne des titres par groupe, le détail des chiffres étant donné par
ailleurs dans la publication de Toma et coll. (« Vaccination antirabique du
chien par la voie intradermique » : à paraître).
De l'étude de ce tableau et de son analyse statistique il apparaît que
l'influence de la voie d'injection du vaccin est significative lorsqu'on considère
la réponse sérologique 25 jours après la vaccination (F = 20,7). Par
contre, lorsqu'on considère cette réponse 40 jours après la vaccination, la voie
d'injection n'a plus d'influence significative sur le titre d'anticorps élaborés,
bien que la voie intradermique paraisse la plus favorable à l'immunisation.
DISCUSSION - CONCLUSION
La fabrication d'un vaccin à virus inactivé à partir d'encéphales d'agneau
doit permettre d'obtenir un produit répondant à la fois aux exigences internationales
concernant la valeur antigénique des vaccins antirabiques à usage animal
et aux contraintes financières concernant ce type de production, dans les
pays envisageant une prophylaxie de masse de la rage canine.
Le titre du virus obtenu avant inactivation (10- 7,2 /g) n'est pas, en effet,
significativement inférieur à ceux que l'on peut obtenir sur souriceau (4 et 10)
ou sur cellules (4) actuellement considérés comme les meilleurs substrats de
réplication du virus rabique. Mais un tel titre ne peut être espéré que si l'ani-
* Cet essai a été fait à l'Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, Chaire des Maladies Contagieuses
(Professeur Toma) que nous remercions vivement.

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Tableau III. — TITRES D'ANTICORPS NEUTRALISANTS DÉTERMINÉS SUR SOURIS,
SUR DES SÉRUMS DE CHIEN SOUMIS A DIVERSES MODALITÉS
DE VACCINATION ANTIRABIQUE
Titre d'anticorps neutralisants
Groupe de chiens 25 jours après l'injection 40 jours après l'injection
DP 50
* U.I./ml** DP 50
* U.I./ml*
Voie dermique 1,65 1,7
0,2 ml de vaccin 2,1 1,7
(Dermojet) 2,2 1,7
2,2 1,75
2,3 0,8 ± 0,36 1,75 0,3 ± 0,1
2,3 1,95
2,3 1,95
2,45 1,95
2,55 2,1
Voie dermique 1,5 1,25
0,2 ml de vaccin 1,7 1,4
(aiguille) 1,7 1,5
1,8 1,75
2,05 0,35 ± 0,15 1,75 0,3 ± 0,2
2,05 1,95
2,05 2,15
2,1 2,2
2,1
Voie sous-cutanée 1,5 0,95
0,2 ml de vaccin 1,6 1,4
1,6 1,45
1,7 0,2 ± 0,03 1,55
1,7
1,6
1,75 1,7
1,75 1,7
2,05
0,13 ± 0,07
Voie sous-cutanée 1 1
1 ml de vaccin 1,35 1,3
1,35 1,4
1,5 1,5
1,7 0,21 ± 0,18 1,5 0,2 ± 0,2
1,7 1,7
U 1,7
1,75 2,2
2,2
* DP50 = Doses protectrices de chacun des sérums pour 50 % des souris (exposant du logarithme
décimal de la dilution finale neutralisante).
** U.I./ml = Unités Internationales par ml : moyenne pour le groupe. La DP 50
du sérum de référence
étant très élevée dans ces titrages (10~ 4,2 ) les titres des sérums testés paraissent relativement
faibles.

— 808 —
mal utilisé est très jeune (agneau non sevré, ou juste sevré). L'emploi de sujets
adultes fournirait, au contraire, une récolte de valeur très médiocre, dont
l'inactivation totale produirait un vaccin de valeur immunogène inacceptable.
La valeur antigénique du virus après inactivation mesurée par le test des
N.I.H. (3,18 à 4,4 U.I./ml) est également comparable à celle obtenue à partir
de virus répliqué sur souriceaux ou cellules. Mais, contrairement à ces derniers,
cette valeur antigénique a tendance à baisser assez rapidement pour des
raisons encore inexpliquées. Ceci doit inciter à ne pas réaliser de réserves trop
importantes de vaccins, et à les utiliser rapidement (dans les trois mois après
fabrication) sous peine d'être obligés d'augmenter la posologie vaccinale pour
compenser cette perte de valeur antigénique.
La voie d'administration du vaccin pourrait être, très avantageusement, la
voie intradermique. Cette dernière déjà étudiée chez l'animal et l'homme (8)
(1-6) semble bien entraîner, 25 jours après vaccination, une réaction humorale
supérieure à la voie sous-cutanée avec une dose de vaccin cinq fois moindre.
Le titre moyen d'anticorps (0,8 U.I./ml) obtenu par cette voie répond aux
normes internationales. Si, 40 jours plus tard, cette différence n'est pas significative,
elle reste tout de même en faveur de la voie intradermique. L'emploi
de cette voie devrait donc pouvoir être recommandé pour les vaccinations de
masse sous réserve d'une étude complémentaire en cours, qui vérifiera sur plusieurs
années la cinétique de l'immunité humorale comparée selon les voies
d'injection.
REMERCIEMENTS
Nous remercions vivement le Docteur K. Bögel, du Service de la Santé
Publique Vétérinaire de l'Organisation Mondiale de la Santé, pour ses encouragements
et son aide matérielle dans ces essais, ainsi que le Professeur
B. Toma pour sa précieuse collaboration aux essais sur chiens.
STUDY OF A VACCINE AGAINST ANIMAL RABIES,
USING AN INACTIVATED VIRUS PREPARED FROM SHEEP BRAIN
J. Blancou, M.F.A. Aubert, L. Andral and J. Godenir
Summary : Among the possible ways of manufacturing rabies vaccines
(inactivated virus), the use of sheep brain appears to be one of the most
economical and practical methods in vaccination campaigns of dogs, particularly
in tropical countries.
The practicalities of manufacturing this type of vaccine, the virus titres
obtained depending on the age of the sheep, the antigenic values of manufactured
vaccine batches, the antibody titres and/or resistance to challenge
observed after vaccination of dogs (or foxes) are reported and discussed.

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A study of these data indicates that vaccines of this type meet the
recommendations of the World Health Organization. However, if the
vaccines are kept in a liquid state, they must be used under described
conditions within six months after the date of manufacture.
ESTUDIO DE UNA VACUNA CONTRA LA RABIA ANIMAL,
DE VIRUS INACTIVADO, PREPARADA A PARTIR DE ENCÉFALO OVINO
J. Blancou, M.F.A. Aubert, L. Andral y J. Godenir
Resumen : Entre las posibles formas de producción de vacunas antirrábicas
(de virus inactivado), la del empleo de encéfalos ovinos parece que es
una de las más económicas y más prácticas en las campañas de vacunación
de perros, especialmente en países de zona tropical.
Se reseñan y discuten las condiciones prácticas de producción de este
tipo de vacuna, los títulos de virus obtenidos según la edad de los ovinos,
los valores antigénicos de los lotes fabricados, los títulos de anticuerpos
y/o la resistencia a la prueba observados después de administrarlos al
perro (o al zorro).
Al estudiar estos datos se ve que las vacunas de este tipo corresponden a
las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud. Sin
embargo, de conservarse en estado líquido, se las ha de emplear en los seis
meses que siguen a su fabricación en las condiciones descritas.
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