bio nÂ°37 - Direction des sciences du vivant - CEA

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•CEA_BIO_n37 9/10/07 12:00 Page 4 Développement d’antiparasitaires et d’herbicides à partir de la cible MGDG synthase Biotope 4 De la recherche fondamentale… Le laboratoire de physiologie cellulaire végétale (LPCV/iRTSV, Grenoble) est spécialisé dans l’étude de constituants et de processus essentiels pour le développement des cellules végétales. Dans le cadre de ces études, Éric Maréchal a mené une analyse structurale et fonctionnelle d’une des enzymes les plus importantes du métabolisme lipidique des plantes, la MGDG synthase. Cette enzyme synthétise le monogalactosyldiacylglycérol, le lipide majeur des plastes et unique au règne végétal. L’absence de mutants connus, l’importance pondérale de ce galactolipide ainsi que des études complémentaires montrent que la MGDG synthase est vitale et unique non seulement pour la biogenèse des plastes mais aussi pour la biogenèse de toutes les membranes des cellules végétales. Par conséquent, elle est essentielle au maintien de l’intégrité cellulaire. Parallèlement à ces études, deux équipes indépendantes décèlent en 1997 chez des parasites apicomplexes la présence d’un compartiment cellulaire végétal, en fait une forme vestigiale d’un chloroplaste dénommé par la suite « apicoplaste ». Ces parasites apicomplexes sont responsables de graves maladies tant pour l’homme que pour les animaux : paludisme, toxoplasmose, coccidiose, neosporose et piroplasmose. Considérant que l’apicoplaste était proche des chloroplastes de plantes, Éric Maréchal a émis l’hypothèse et démontré depuis que l’agent du paludisme, Plasmodium falciparum, et de la toxoplasmose, Toxoplasma gondii, possédaient une activité de synthèse de MGDG, et que les galactolipides étaient des composants des membranes parasitaires. Fort de ces travaux fondamentaux, il était naturel de © CEA/DSV conclure à la pertinence de cette enzyme comme cible novatrice pour sélectionner des molécules inhibitrices présentant non seulement des propriétés herbicides mais aussi antiparasitaires. … au développement d’un projet de valorisation Persuadée de l’importance des résultats obtenus, la cellule de valorisation de DSV protège la cible ainsi que des procédés de criblage par deux dépôts de brevets en 1999 et 2000 [ 1 ]. Jugeant que seule l’obtention de familles d’inhibiteurs de la MGDG synthase dûment protégées par des brevets peut permettre de présenter un dossier susceptible d’intéresser des industriels, la cellule de valorisation, en concertation avec Éric Maréchal, élabore un plan de valorisation et les actions nécessaires pour obtenir les moyens financiers indispensables au projet. > Recherche d’inhibiteurs par criblage sur la cible (phase 1 : 2000-2004) : en 2000, pas de chimiothèques ni de capacités de criblage haut débit au CEA. En conséquence, il est décidé d’approcher la société CEREP. Les tests biologiques sont réalisés au CEA pour les propriétés herbicides et dans les laboratoires de parasitologie de l’institut Jean-Roget (Grenoble) et de l’université de Montpellier pour les propriétés antiparasitaires. Pour le financement, une demande d’aide au transfert est présentée avec succès auprès d’Oséo-Anvar. Après une étape indispensable de miniaturisation et d’automatisation du test de criblage sur une MGDG synthase de plante, 24 000 molécules sont testées : deux inhibiteurs sont retenus pour leurs effets significatifs herbicides et antiparasitaires. > Synthèse chimique de familles de composés biologiquement actifs (phase 2 : 2005-2007): la cellule de valorisation de DSV introduit le projet auprès des chimistes du Service de chimie bio-organique et de marquage (Bernard Rousseau) avec le soutien de Pierre Legrain, chef de l’institut iBITEC-s à Saclay. Après analyse structurale des deux hits obtenus ÉRIC MARÉCHAL (iRTSV/LPCV) : eric.marechal@cea.fr www-dsv.cea.fr/lpcv ROMAN LOPEZ (iBiTec-S/Groupe de Chimie Combinatoire et Criblage à haut débit). roman.lopez@cea.fr www-dsv.cea.fr/lcb dans la phase précédente, Roman Lopez et son équipe élaborent un plan de synthèse chimique de dérivés desdits hits. Pour le financement, une demande d’aide au transfert complémentaire est obtenue auprès d’Oséo-Anvar. Fin 2005, la cellule de valorisation obtient un financement de l’ANR « Émergence et maturation des projets de biotechnologies ». Plusieurs centaines d’analogues ont depuis été synthétisés et testés : pour un certain nombre, leur activité herbicide et/ou antiparasitaire a été améliorée de plus d’un facteur 100, avec une baisse très significative des effets toxiques sur cellules humaines. Deux brevets ont été déposés en juin 2007 [ 2 ] protégeant pour l’un une famille de molécules antiparasitaires, pour l’autre une famille de molécules herbicides. La cellule de valorisation de DSV a lancé une campagne de prospection internationale en vue d’identifier les partenaires industriels les plus à même de prendre le relais pour développer ces herbicides et molécules antiparasitaires. RÉFÉRENCES Figure Des molécules herbicides (inhibant la croissance d’Arabidopsis thaliana à droite) ayant des propriétés antiparasitaires (inhibant la croissance de Toxoplasma gondii à gauche). 1 Brevet FR 9903434 (mars 1999) ; Brevet FR 0013976 (octobre 2000) 2 Brevets EP 07290683.7 et EP 07290684.5 (juin 2007). N° 37 _ DIRECTION DES SCIENCES DU VIVANT _ OCTOBRE 2007
•CEA_BIO_n37 9/10/07 12:00 Page 5 Développement de formes Tat inactivées hautement immunogènes: application contributive à un vaccin anti-VIH Bio-partenaires © CEA/DSV La préparation d’un vaccin capable de protéger contre les infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou de ralentir l’apparition des signes cliniques du Sida représente un enjeu majeur en termes de santé publique. C’est pourquoi de nombreux groupes de recherche focalisent leurs études sur la sélection de cibles vaccinales dérivées de protéines du VIH et sur l’évaluation de leur pouvoir vaccinant dans des modèles animaux appropriés. Parmi les cibles sélectionnées, le transactivateur transcriptionnel (Tat) du VIH est considéré comme un candidat particulièrement attractif car cette protéine possède un grand nombre d’activités biologiques qui pourraient jouer un rôle dans la dissémination virale et dans la progression de la maladie, et car la non- progression vers le stade Sida est corrélée à la présence d’une réponse immunitaire anti-Tat élevée. A Tat présente cependant l’inconvénient d’être faiblement immunogène, ce qui limite le potentiel vaccinant des candidats vaccins qui en dérivent. Nous avons donc cherché à augmenter son immunogénicité afin de contribuer à la mise en place de candidats vaccins anti-VIH plus efficaces. Différentes approches peuvent être envisagées pour moduler l’immunogénicité selon les caractéristiques de la protéine étudiée (1, 2). Nous avons pour notre part observé que la conformation hautement flexible de Tat le rend très sensible à la protéolyse. Or, on sait que le caractère faiblement immunogénique d’une protéine peut être dû à sa forte susceptibilité enzymatique. Donc, nous avons choisi de rendre Tat plus résistant à la protéolyse. L’approche que nous avons employée consiste à stabiliser sa conformation à l’aide de ligands. Nous avons complexé Tat à divers polysaccharides sulfatés et nous avons ainsi pu le rendre plus résistant à l’action enzymatique mais aussi, et surtout, plus immunogène chez la souris (fig. 1). Nous avons aussi observé que certaines activités biologiques de Tat sont inhibées en présence du ligand, ce qui suggère que la formation du complexe peut contribuer à la détoxification de la protéine. Ces résultats Figure 2 Le candidat vaccin Tat stabilisé induit une forte réponse immunitaire chez le macaque. A : Le dosage immunoenzymatique des anticorps anti-Tat présents dans les sérums indique que le candidat vaccin induit une forte réponse humorale chez les animaux vaccinés. B : Le dosage ELISPOT, de l’interféron gamma sécrété par les cellules du sang périphérique des animaux vaccinés indique que le candidat vaccin induit une réponse cellulaire. B ont conduit au dépôt d’un brevet protégeant l’utilisation de candidats vaccins Tat stabilisés hautement 1 immunogènes [ ]. Vers la preuve de concept Dans le cadre du plan de valorisation du brevet mis en place sous l’impulsion de la cellule de valorisation de © CEA/DSV DSV, nous avons projeté d’éprouver l’immunogénicité de l’un de nos candidats vaccins dans un modèle animal représentatif de l’infection par le VIH, le primate non humain. Cette MICHEL LEONETTI iBiTec-S/groupe de modulation de l’immunogénicité des protéines. michel.leonetti@cea.fr Figure 1 Lorsque Tat (Tat101) est complexé à un polysaccharide sulfaté (Hep6000), il induit des réponses en anticorps anti-Tat qui sont 10 à 300 fois supérieures à celles procurées par deux molécules Tat (Tat101 et Tat101Scam) présentant des caractéristiques similaires à celles de candidats vaccins développés par d’autres groupes de recherche. étape vers la preuve de concept était d’autant plus facile à construire que le CEA bénéficie d’une des meilleures équipes européennes pour réaliser ce type de projet, à savoir le Service d’immunovirologie dirigé par Roger Legrand. Pour résoudre le problème du financement, la cellule de valorisation a présenté ce projet avec succès à l’appel d’offres de l’ANR « Émergence et maturation de projets de biotechnologie à fort potentiel de valorisation ». Les premiers résultats de ces études d’immunogénicité, conduites chez le macaque cynomolgus, montrent que pour des doses injectées cinq fois inférieures à celles couramment utilisées lors de ce type d’études, et après une seule immunisation, le candidat vaccin Tat stabilisé est capable d’induire des lymphocytes T auxiliaires, des lymphocytes T cytotoxiques et des anticorps spécifiques (fig. 2). Cette observation indique que notre candidat vaccin stimule l’ensemble des acteurs de l’immunité adaptative antivirale. De plus, une proportion non négligeable des lymphocytes T spécifiques est polyfonctionnelle. Ce dernier point n’est pas le moindre, car la découverte récente du rôle des lymphocytes T polyfonctionnels dans la non-progression vers le stade Sida conduit à considérer que les vaccins anti-VIH doivent nécessairement induire ce type de cellules. Les résultats prometteurs des études d’immunogénicité ont conduit à envisager l’essai vaccinant, proprement dit. De nouvelles sources de financement étaient nécessaire. Forts des résultats précédents, nous avons proposé notre projet au Fonds de soutien à la maturation des projets innovants de DSV. Le projet a été accepté, ce qui a permis de lancer récemment l’essai vaccinant. Les résultats sont attendus dans le courant de l’année 2008. De grands groupes pharmaceutiques internationaux, approchés en 2006, ont déjà manifesté leur intérêt et attendent les résultats de cet essai. S’ils sont positifs, notre approche viendrait compléter leurs candidats vaccins anti- Sida. RÉFÉRENCES 1 J. Immunol (1998) 160 : 3820-3827 2 J. Biol. Chem. (2004) 279 : 50257-50266 3 Brevet n° 0403429, avril 2004. 5 OCTOBRE 2007 _ DIRECTION DES SCIENCES DU VIVANT _ N° 37
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