Oncognse des tumeurs respiratoires et urognitales - Service d ...

GETU
Groupe d’Etude des Tumeurs Urologique GETU
Centre de Recherches Chirurgicales et Service d’Urologie
__________________
Affiliation actuelle : INSERM EMI 03 37
"Oncogénèse des tumeurs respiratoires et urogénitales"
Le GETU est la structure de recherche qui anime l’activité scientifique du service d’Urologie de
l’hôpital Henri Mondor .Cette structure accueille au sein de l’AP-HP des urologues en formation dans
le cadre du DEA de Sciences chirurgicale ainsi que des chirurgiens d’universités hors de l’Ile de
France et des chercheurs étrangers. Ce groupe de recherche a pris naissance au Centre de Recherches
Chirurgicales en 1984, et a depuis obtenu plusieurs reconnaissances dans le cadre des EPST : (EA
Paris XII, Formation associé et puis Centre Claude Bernard, EMI INSERM. Le groupe appartient a
l’IFR10 (IM3) et est un des membres fondateurs du futur Centre de Recherche de l’INSERM dans le
cadre d’un département d’immuno-oncologie. Une part importante de l’activité d’enseignement et de
recherche du service d’urologie se déroule effectivement au CRCHM. et son objectif est de soutenir
l’activité clinique d’oncourologie y compris les aspects fonctionnels et mini invasifs de la chirurgie
oncologique et de former les cadres de la discipline.
L’Urologie est impliquée au CRCHM dans :
1° Une activité d’Enseignement des Techniques Laparoscopiques,
responsable Professeur CC Abbou, participants : docteur Salomon, docteur Hoznek
2° Des activités de recherche :
• La plus importante étant l’Oncologie Urologique, dirigée par le Professeur D Chopin, dans le
cadre de l'EMI INSERM 03-37.
• Une activité centrée sur la thérapie Tissulaire de l’incontinence urinaire, projet émergeant dont le
responsable est le Docteur R. Yiou (cette activité s'appuie sur deux EMI Inserm, celle du
Professeur D Chopin et celle du Professeur Gherardi Inserm E.00-11)
• Une activité d'évaluation et de recherche des techniques laparoscopiques et robotisées, activité
dirigée par le Professeur Abbou et le animée par le docteur Salomon et le docteur P. Anthiphon,
chirurgien en activité libérale.
Formation assurée par le GETU - 2000 - 2004
NOM DEA THESE IHP CCA POSITION ACTUELLE
3° cycle HM HM
PATARD J.J. 1996, Urologie oui PU-PH CHRU Rennes, 2004
SAINT F. 2001, Urologie oui oui PU-PH Amiens, 2004
de la TAILLE A. 2001, Urologie oui oui AP- HP Henri Mondor
VORDOS V. En thèse, Urologie oui oui AP-HP Henri Mondor
QUINTELA R. 2002 non oui Privé Brésil
WALLERAND H. en thèse, Urologie UCLA USA
ZINI L. 2003 en thèse, Urologie Interne CHRU de Lille
LECOEUR C. 2004 Vétérinaire
SWIEB S. 2004 Interne étranger Henri Mondor
DAHER A. 2002 Maître de Conférence Univ.Beyrouth
LE FRERE BELDA, MA 2003, Pathologie oui PH Pathologie HEGP

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Membres de l'Equipe (mai 2004)
NOM Statut ETP
ABBOU Claude PU-PH, Urologie Paris XII 0,3
CHOPIN Dominique PU-PH, Urologie Paris XII 0,5
LAGRANGE Jean-Léon PU-PH, Radiothérapie, Paris XII 0,3
JOUAULT Hélène MCU-PH Université Paris XII 0,3
KOUYOUMDJIAN J.Claude MCU-PH, Université Paris XII 0,3
FIET Jean Faculté Pharmacie, Paris V 1
VACHEROT Francis MC Université Paris XII 0,3
ALLORY yves AHU Pathologie 0,3
DE LA TAILLE Alexandre CCA Urologie 0,3
VORDOS Dimitri CCA Urologie 0,3
HOZNEK Andras PH Urologie 0,3
SALOMON Laurent PH Urologie 0,3
GIL DIEZ DE MEDINA Sixtina PH Urologie 1
MAILLE Pascale IE Contractuelle AP-HP (Claude Bernard) 1
SOYEUX Pascale Agent technique contractuelle Université 1
HUGUENIN Sandra Thèse, Univ. Paris XII 1
BAKKAR Ashraf Thèse, Univ. Paris XI 1
NICOLLE Gaëlle Thèse, Univ. Paris XII 1
SOARES QUERIRES Luis Thèse, Univ. Paris XIII 1
WALLERAND Hervé Thèse, Univ. Paris XII 1
LECOEUR Constant DEA, Paris XII 1
TERRY Stéphane DEA, Université Paris Sud 1
SWIEB Salem DEA Univ. Paris XII 1
DELEVALLEZ Guillaume
Contrat Apprentissage Inserm BTS
Biochimie
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I. RESUME DES Projets SCIENTIFIQUES
1. Oncogénèse Urogénitale
Oncogenèse prostatique. Nous avons identifié, grâce à un modèle cellulaire, un nouveau gène dans le
cancer prostatique hormonorésistant codant pour une protocadhérine appelée protocadhérine-PC
(pPC). Son expression est induite au cours de l'acquisition de la résistance aux agents proapoptotiques.
Une de nos hypothèses de travail est que la pPC serait impliquée dans la modification de
la distribution intra-cellulaire de la ß-caténine et l'activation du récepteur des androgènes. Les objectifs
sont : 1) d’identifier les partenaires protéiques qui sont associés aux fonctions de cette protéine, 2) de
développer des outils pour bloquer spécifiquement les fonctions de cette protéine, 3) d’évaluer le rôle
de la protocadhérine-PC comme nouveau marqueur biologique du cancer de la prostate via la création
de puces à tissu et du développement d’anticorps, 4) de situer la protocadhérine-PC par rapport aux
autres anomalies moléculaires observées au stade de l’échappement hormonal.
Oncogenèse urothéliale. Nous avons les premiers, identifié les mutations activatrices du gène du
récepteur FGFR3, présentes dans 40% des cas incidents. Ces mutations définissent ainsi un groupe
alternatif de tumeurs par rapport à celles qui présentent des mutations de P53 en ce qui concerne le
stade, le grade et la progression tumorale. Le profil de mutation de ces deux gènes pose les bases
d’une classification moléculaire des tumeurs urothéliales (TU). Nous avons démontré le rôle des
récepteurs aux facteurs de croissance épidermique dans un modèle de cicatrisation de l’urothélium et
dans la prolifération de lignées cellulaires de tumeurs urothéliales. Les objectifs sont d’utiliser ces
observations et ces modèles pour
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• caractériser ou hiérarchiser les altérations moléculaires critiques de la progression tumorale, dans
une approche de type épidémiologie moléculaire
• identifier des éléments de réponse à la thérapeutique
• tester de nouvelles approches thérapeutiques centrées sur la signalisation des tyrosines kinases et
des molécules d’adhésion.
Autogreffes de cellules musculaires « précurseur » dans les incontinences par insuffisance
sphinctérienne.
Les incontinences urinaires et fécales des pathologies associées une baisse du tonus sphinctérien
posent des problèmes thérapeutiques non résolus. Nous proposons une nouvelle approche
thérapeutique basée sur l’autogreffe de cellule précurseur musculaire (cpm). Nous avons montré chez
le rat que des autogreffes cpm dans un sphincter urétral préalablement détruit par électrocoagulation
aboutit à la formation de nouvelles fibres musculaires fonctionnelles qui augmentent la force de
contraction du sphincter. Le but du projet présenté est de restituer, par une autogreffe de cpm, des
sphincters urétral et anal physiologiques ayant une activité tonique basale dans un modèle
d’insuffisance sphinctérienne développé sur le gros animal (la truie). Les objectifs spécifiques sont :
a. Une évaluation fonctionnelle sphinctérienne urétrale et anale par bilan manométrique et
électrophysiologique du sphincter normal et lésé suivant notre modèle,
b. La mise au point de techniques de culture de cpm en condition grade clinique et leur marquage à
l’aide de marqueurs repérables en IRM.
c. La mise au point de techniques d’injection intrasphinctérienne urétrale de cpm par voie
endoscopique,
d. L’évaluation de la greffe de cpm par les méthodes précédemment citées.
Planification et simulation d'interventions endoscopique standardisées et robotisées
Ce projet a pour objectif d’adapter les techniques de chirurgie laparoscopique classiques ou robotisées
en fonction de l’anatomie corporelle rétropéritoneale et lésionnelle rénale. Il est basé sur la
reconstruction d’image et le logiciel Chir (INRIA).
II. 10 publications sélectionnées
.
1. Daher A., De Boer W.I., Le Frère Belda M.A., Kheuang L., Abbou C.C., Radvanyi F., M.C. Jaurand, Thiery
J.P., Gil Diez de Medina S., Chopin D.K. Growth, differentiation and Senescence of Normal Human
Urothelium in organ like culture. European Urology, 2004
2. Huguenin, S., Vacherot, F., Kheuang, L., Fleury-Feith, J., Jaurand, M. C., Bolla, M., Riffaud, J. P., and
Chopin, D. K. Antiproliferative effect of nitrosulindac (NCX 1102), a new nitric oxide-donating nonsteroidal
anti-inflammatory drug, on human bladder carcinoma cell lines. Mol Cancer Ther, 3: 291-298,
2004
3. Antiphon, P., Hoznek, A., Benyoussef, A., de lataille, A., Cicco, A., Elard, S., Gettman, M. T., Katz, R.,
Vordos, D., Salomon, L., Chopin, D. K., and Abbou, C. C. Complete solo laparoscopic radical
prostatectomy: initial experience. Urology, 61: 724-728; discussion 728-729, 2003.
4. Bakkar, A. A., Wallerand, H., Radvanyi, F., Lahaye, J. B., Pissard, S., Lecerf, L., Kouyoumdjian, J. C.,
Abbou, C. C., Pairon, J. C., Jaurand, M. C., Thiery, J. P., Chopin, D. K., and de Medina, S. G. FGFR3 and
TP53 gene mutations define two distinct pathways in urothelial cell carcinoma of the bladder. Cancer Res,
63: 8108-8112, 2003
5. Daher, A., de Boer, W. I., El-Marjou, A., van der Kwast, T., Abbou, C. C., Thiery, J. P., Radvanyi, F., and
Chopin, D. K. Epidermal growth factor receptor regulates normal urothelial regeneration. Lab Invest, 83:
1333-1341, 2003
6. Katz, R., Nadu, A., Olsson, L. E., Hoznek, A., de la Taille, A., Salomon, L., and Abbou, C. C. A simplified
5-step model for training laparoscopic urethrovesical anastomosis. J Urol, 169: 2041-2044, 2003.
7. Yiou, R., Yoo, J. J., and Atala, A. Restoration of functional motor units in a rat model of sphincter injury by
muscle precursor cell autografts. Transplantation, 76: 1053-1060, 2003
8. Chopin; D., Barei-Moniri, R., Maille, P., Le Frère Belda, M.A., Muscatelli-Groux, B., Merendino, N.,
Lecerf, L. , Stoppaciaro, A. and Velotti, F. Human urinary bladder transitional cell carcinomas acquire the
functional FAS Ligand during tumor progression. Am J Pathol, 162 : 1139-1149, 2003
9. De La Taille, A. Rubin, M.A., Chen, M.W., Vacherot, F., De Medina, S.G., Burchardt, M., Buttyan, R. and
Chopin, D. Beta-Catenin-related anomalies in apoptosis-resistant and hormone-refractory prostate cancer
cells. Clin Cancer Res, 9 : 1801-1807, 2003
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10. Chen, M. W., Vacherot, F., De La Taille, A., Gil-Diez-De-Medina, S., Shen, R., Friedman, R. A., Burchardt,
M., Chopin, D. K., and Buttyan, R. The emergence of protocadherin-PC expression during the acquisition of
apoptosis-resistance by prostate cancer cells. Oncogene, 21: 7861-7871, 2002.
III. Différents protocoles de recherche clinique et enquêtes épidémiologiques en santé publique
en cours
1. Facteurs professionnels et paramètres clinico-biologiques du cancer vésical. Responsable
scientifique : J.C. PAIRON: ARC, CNAMTS, Ministère de l’Emploi et de la Solidarité, Ligue
contre le Cancer
2. Etude des mutations du récepteur des androgènes dans les cancers de la prostate localisés et les
cancers métastatiques avant et pendant le traitement par déprivation androgénique et après
échappement hormonal. Responsable scientifique : D. CHOPIN, PHRC National
3. Evaluation prospective d’un test de surveillance des récidives du cancer de la vessie par analyse de
l’ADN urinaire, D CHOPIN PHRC National
IV. Principaux résultats et prospective scientifique
IV.1. Progression tumorale
IV.1.1. Oncogénèse prostatique. Identification d'un gène de résistance à l'apoptose dans le cancer
prostatique hormonorésistant : la protocadhérine-PC. F. Vacherot, A. de la Taille, J. Fiet.
Il y a plus de 50 ans que Charles Huggins a démontré l'utilité de la castration dans le traitement du
cancer avancé de la prostate. Ce traitement est exceptionnellement curatif, une population cellulaire
devenant inévitablement résistante au traitement hormonal, ces cellules étant également résistantes aux
traitements non hormonaux comme la radiothérapie et la chimiothérapie. Afin d'identifier le produit de
gènes associés au développement de l'hormonorésistance, nous avons sélectionné, à partir de la lignée
cellulaire LNCap hormonosensible, deux variants hormonorésistants utilisant le TPA et la privation en
sérum qui entraîne l'apoptose de 80% des cellules LNCap parentales. Après 5 cycles de traitement, 2
variants ont pu être sélectionnés : LNCap-TR (résistante au TPA) et LNCap-SSR (résistante à la
privation en sérum).
Privation en
sé rum
Expansion
des cellules vivantes
Sélection répétée
X 4
LNCaP-SSR
ATG ATG TAA
Exon
10 nM TPA
Expansion
des cellules vivantes
Sélection répétée
X 4
LNCaP-TR
Forme
membranaire
C C
D C C C C
Forme
membranaire
NLS
Site de fixation
à la β-caténine
Figure 1 :le modèle cellulaire
Figure 2 : Structure de la protocadhérine PC (pPC)
Grâce à ce modèle cellulaire (figure 1), le produit d'un nouveau gène fortement exprimé dans les
lignées TR-SRR a été identifié par hybridation différentielle. Ce gène code pour un nouveau membre
des protocadhérines, la protocadhérine-PC (figure 2). Nos résultats démontrent le rôle antiapoptotique
de la protocadhérine-PC et suggèrent fortement son implication dans la transition de l'adénocarcinome
prostatique vers le stade hormonorésistant.
Nous avons montré l'existence d'une liaison entre la betacaténine et la protocadhérine-PC associée à
une re-localisation nucléaire de la betacaténine et une activation de la voie de transcription LEF/TCF.
Ces observations nous ont amenés à étudier dans un premier temps, l'expression de la betacaténine au
niveau du cancer de la prostate , et nous avons observé une localisation anormale nucléaire de la
betacaténine dans 60% des cancers hormonorésistants, alors qu'il n'y a aucune mutation, ou
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exceptionnellement, de la betacaténine dans le cancer de la prostate. Les hypothèses actuelles sur les
altérations de la betacaténine dans la progression du cancer de la prostate, sont que la betacaténine est
capable d'entrer dans le noyau par un mécanisme indépendant du complexe APC et pourrait
éventuellement se lier aux récepteurs des androgènes et être responsable d'un des mécanismes de son
activation en l'absence du ligand. Nous avons envisagé d’etudier de façon plus précise la fonction de la
pPC, et de developper des outils pour bloquer son action.
Projet Actuel
L'objectif de notre démarche de recherche est de caractériser les modifications induites au
niveau du tissu prostatique par la privation androgénique et d’identifier des anomalies
moléculaires critiques impliquées dans l’acquisition de la résistance au traitement hormonal du
cancer prostatique afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, nous
avons récemment caractérisé un nouveau membre de la famille des protocadhérines, la
protocadhérine-PC. Son expression est induite au cours de l’acquisition de la résistance aux
stimuli apoptotiques et elle est sur exprimée dans le cancer en échappement hormonal. La
transfection des cellules prostatiques par un vecteur permettant l’expression de la
protocadhérine-PC leur confère une résistance à l’apoptose induite par le phorbol ester. Son
mécanisme d'action serait associé à la β-caténine qui vient d'être décrite comme nouveau coactivateur
du récepteur des androgènes
Les objectifs spécifiques de ce projet sont de préciser le rôle de la protocadhérine-PC dans la
transition vers l'hormonorésistance du cancer de la prostate et de placer cette altération
moléculaire parmi celles décrites à ce stade. Nous évaluerons également le rôle de marqueur de
la protocadhérine-PC.
Afin de répondre à ces objectifs, nous proposons de réaliser les expérimentations suivantes.
a- Relation Protocadhérine-PC, récepteur des androgènes et la β-caténine
Nous avons observé dans un modèle in vivo de xénogreffe que l’augmentation de la protocadhérine-
PC est associée avec la suppression des androgènes et nous avons démontré un rôle antiapoptotique de
cette protéine. En collaboration avec l’équipe de Ralph Buttyan (Columbia, NY) nous avons observé,
dans un modèle de double hybride chez la levure, que la protocadhérine-PC est capable de se lier avec
la protéine FHL2 qui est un co-activateur du RA.
Il nous semble important d'évaluer si l’activité de la protocadhérine-PC serait associée à l'activation du
récepteur des androgènes. Pour cela plusieurs approches seront étudiées. Dans un premier temps, les
cellules LNCaP, TR et SSR qui sont des lignées possédant une forme mutée du RA seront transfectées
avec un plasmide contenant les éléments de réponse au RA couplé à un gène reporter qui est la
luciférase. La mesure de l’activité de la luciférase nous indiquera si l’activité transcriptionnelle du RA
serait plus important ou non au niveau des cellules LNCaP-TR et SSR qui sont des lignées
surexprimant la protocadhérine-PC comparé à lignée parentale LNCaP. Par ailleurs les cellules
tumorales prostatiques (DU 145 et PC 3) ne possédant pas de RA, seront co-transfectées avec des
plasmides contenant les ADNc codant pour ces deux protéines. L'activation du RA sera visualisée
selon la technique décrite précédemment. Dans l'hypothèse où la protocadhérine-PC serait capable
d'activer les activités transcriptionnelles du RA, une immunoprécipitation sera réalisée afin d’étudier
les liaisons protocadhérine-PC et RA.
La β-caténine a été récemment décrite comme un nouveau co-activateur du RA. Nous disposons au
laboratoire des vecteurs d’expression exprimant la β-caténine (la forme sauvage et mutée). Selon le
protocole d’étude similaire de celui du récepteur des androgènes, nous étudierons le rôle de la
protocadhérine-PC dans la délocalisation de la β-caténine qui pourrait conduire à l'activation du RA.
Dans l’objectif de pouvoir contrôler l’expression de la protocadhérine-PC et de pouvoir ainsi étudier
sa régulation, nous créons, à partir des lignées LNCaP, PC-3 et DU 145, des lignées inductibles
utilisant les systèmes T-Rex et Ecdysone (Invitrogen). Nous avons obtenu 2 clones issus de la lignée
PC3 qui produisent de façon inductible la protocadhérine-PC. La sélection des clones issus des lignées
LNCaP et DU 145 transfectées avec le plasmide contenant l’ADNc de la protocadhérine-PC est
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actuellement en cours. L’obtention de ces cellules nous permettra d’approfondir nos connaissances sur
les mécanismes moléculaires mis en jeux par la protocadhérine-PC pour permettre aux cellules
tumorales de résister à l’apoptose induite par le traitement hormonal.
b– Identifier les mécanismes moléculaires associés à la surexpression de la protocadhérine-PC
Pour déterminer les gènes qui pourraient être régulés par la protocadhérine-PC et qui participeraient à
la progression tumorale et à l’échappement hormonal, nous envisageons d’utiliser la technique des
puces à ADN. Nous comparerons le niveau d’expression des gènes des cellules surexprimant la
protocadhérine-PC (LNCaP-TR, SSR, LNCaP-T6-2) comparé à la lignée parentale LNCaP. Selon les
résultats obtenus, nous utiliserons ensuite les cellules contenant le système inductible de la
protocadhérine-PC pour étudier la régulation des gènes cibles qui auraient été identifiés. Ces données
devraient nous permettre de mieux comprendre les fonctions de la protocadhérine-PC et d’identifier de
nouvelles cibles thérapeutiques. Pour l’analyse du transcriptome seront utilisés les puces U133A et
U133B avec au minimum 10 microgrammes d’ARN par échantillon. Les données du transcriptome et
du génome seront analysées en collaboration avec les services de l’Institut Curie, de Statistiques
(Directeur Bernard Asselain) et de Bioinformatique (Directeur Emmanuel Barillot).
c– Mise au point des protocole pour inhiber l'expression du gène de la protocadhérine-PC
Nos études ont démontrés une surexpression de la protocadhérine PC dans le cancer en échappement
hormonal. L’inhibition de l’expression de cette protéine constitue donc une approche thérapeutique
potentielle. Pour cela nous envisageons de développer l’approche d’interférence d’ARN pour inhiber
l'expression de cette molécule et de bloquer ainsi ses fonctions.
L’interférence d’ARN consiste en un mécanisme d’inhibition spécifique des gènes. Ce phénomène est
provoqué par l’activation du complexe RISC (RNA-induced silencing complex) qui clive un ARNm
cible empêchant donc sa traduction. Ce complexe est activé par des siRNA (small interfering ARN)
qui sont de courts oligonucléotides double brins de 21 nucléotides environ et dont l’extrémité 3’ est
libre sur 2 nucléotides
Pour réprimer l'expression de la protocadhérine PC, nous utiliserons dans un premier temps les
cellules LNCaP-TR et SSR pour la mise au point des séquences de nucléotides permettant d'inhiber
spécifiquement l'expression de la cette protéine. Le design des séquences ainsi que leur synthèse
seront confiés à la société Dharmacon Reseach. Plusieurs siRNA seront testés afin de définir la
séquence la plus efficace. L’inconvénient de l’interférence par des siRNA est que le phénomène ne
dure pas plus de 48h à 72h. A ce stade, il reste toujours de la protéine endogène. Pour surmonter ce
problème, nous construirons, dans un second temps, des vecteurs d’expression permettant de produire
des shRNA (transcrits RNA sous forme d’épingle à cheveux qui seront ensuite clivés par le complexe
DICER pour aboutir à des siRNA). Ces vecteurs seront ensuite transfectées dans les cellules LNCaP-
TR et SSR pour évaluer leur efficacité de bloquer l’expression de la protocadhérine PC à long terme.
Nous envisageons également de construire des vecteurs d’expression de shRNA.
d- Production et fonctions des anticorps monoclonaux anti-protocadhérine-PC
Nous avons obtenu un anticorps monoclonal (clone C32) reconnaissant spécifiquement la
protocadhérine-PC sur tissus prostatiques humains et par ELISA. D’autres souris sont actuellement en
cours d’immunisation. Nous espérons ainsi obtenir de nouveaux anticorps reconnaissant différents
épitopes de la molécule. L’obtention de ces anticorps nous permettra de développer notre projet de
recherche sur l’étude des mécanismes d'action de la protocadhérine PC, mais aussi d'évaluer la
protocadhérine-PC comme marqueur biologique du cancer de la prostate.
e- Evaluation de l’effet des anticorps anti-protocadhérine-PC sur des cellules tumorales prostatiques
Une des étapes de la caractérisation de la fonction de la protocadhérine-PC passe par l’étude de l’effet
de la présence des anticorps anti-protocadhérine-PC sur le développement et la croissance in vitro et in
vivo des cellules résistantes à l’apoptose (LNCaP-TR et -SSR). Il est donc prévu d’étudier dans un
premier temps, le comportement de ces cellules cultivées en présence des anticorps ou microinjectées
avec ces protéines et d’évaluer leur sensibilité plus accrue aux différents stimuli apoptotiques.
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f- Mise au point d’un dosage ELISA de la Protocadhérine-PC
La poursuite de l’obtention d’anticorps monoclonaux sera de mettre au point un dosage ELISA. Nous
disposons un appareil, le BIAcore, nous permettant d'analyser l'affinité des anticorps vis-à-vis de la
protocadhérine-PC et de les sélectionner ensuite en fonction de leur reconnaissance aux différents
épitopes. Cette première étape nous permettra d'isoler les anticorps intéressants qui seront ensuite
utilisés dans la mise au point du test d'ELISA. L'anticorps ayant la meilleure affinité vis-à-vis de la
protocadhérine-PC sera fixé sur plaque de 96 puits et utilisé pour la capture de la protéine
recombinante. Après lavage des protéines non fixées, la détection du complexe antigène/anticorps se
fera par l'incubation avec un mélange de plusieurs anticorps monoclonaux biotinylés, suivie d'une
étape de révélation avec de la streptavidine couplée à un traceur fluorescence.
g- Création d’une banque de Tissue MicroArrays
La technique des tissue microarrays est un outil performant, rapide et rentable pour étudier l’intérêt
clinique des nouvelles molécules Elle a pour finalité de concentrer sur 1 lame plusieurs centaines
d’échantillons pouvant provenir de plusieurs centaines de patients différents (voir principe ci après).
Nous avons entrepris, sur la cohorte de patients du service d’urologie de l’Hôpital Henri Mondor, en
collaboration avec le service d’anatomopathologie, de réaliser une puce à tissu comprenant 30
échantillons d’adénome de la prostate obtenus après résection transuréthrale de la prostate ou
adénomectomie, 250 tissus de cancer de la prostate au stade localisé (après prostatectomie radicale par
voie coelioscopique ou par voie rétropubienne) et 50 tissus de patients présentant un cancer de la
prostate en hormono-échappement ayant bénéficié d’une résection transuréthrale de la prostate pour
obstacle sous vésical. Pour chacun de ces patients, les données cliniques et anatomopathologiques sont
collectées sur fichier informatisé anonymisé qui a permis l’évaluation des différentes techniques
chirurgicales utilisées dans le service d’urologie.
h- Place de la protocadhérine-PC dans le cancer de la prostate en échappement hormonal
La comparaison de l’expression de la protocadhérine-PC aux autres molécules impliquées dans le
cancer de la prostate en échappement hormonal sera étudiée par RT-PCR quantitative et/ou
immunohistochimie. Les transcrits concernés sont ceux : du récepteur des androgènes ; des familles de
facteurs de croissance et de leurs récepteurs comme EGF, FGF, IGF et HARP ; certains marqueurs
neuroendocriniens comme l’adrénomédulline, des marqueurs des gènes de résistance à l’apoptose
comme bcl2 et la clustérine.
IV.1. 2. Oncogénèse urothéliale. D., Chopin, J.L Lagrange, D. Vordos
Deux types de recherches sont développées :
• l’utilisation de modèles in vitro pour évaluer de nouvelles thérapeutiques
• l’étude des altérations moléculaires et génétiques des tumeurs urothéliales dans un but
étiopathogénique et pronostique
IV.1. 2.1 - Modèles in vitro de culture de l'urothélium
Nous avons étudié la croissance, la différentiation et la sénescence de l'urothélium humain normal
dans un modèle de culture pseudo organo typique. Des explants d'urothélium humain normal ont été
micro disséqués et placés sur des membranes semi poreuses prétraitées par différents composants de la
matrice extra cellulaire avec un milieu défini. Ces cultures ont été maintenues pour une durée de 30
jours pendant laquelle nous avons étudié la prolifération cellulaires par l'incorporation de Brdu, la
différentiation par l'expression des cytokératines et de l'uroplakine. Nous avons également étudié
l'expression des facteurs de croissance de la famille de l'EGF par RT-PCR quantitative, ainsi que la
sénescence en mesurant l'expression des transcrits de p16 et l'activité β-galactosidase endogène,
Utilisant le collagène 4 qui est le composant de la matrice le plus efficace. Nous pouvons utiliser ce
modèle à l'état d'équilibre du 15 ème au 30 ème jour. Dans les 15 premiers jours, on un pic de
prolifération(15%) qui s'associe à la production d'HB-EGF d'amphiréguline et de TGF-α. A partir du
15 ème jour la prolifération retombe à 3 à 5 %. L'expression des cytokératines et de l'uroplakine est
stable a confluence. Une activité significative de sénescence apparaît à J.25. Ces résultats montrent
que ce modèle maintient les caractéristiques de l'urothélium humain in vivo et peut être utilisé entre le
15 ème et le 25 ème jour. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour étudier l'implication des facteurs de
croissance de la famille de l'EGF et celle du récepteur à l'EGF au cours de la cicatrisation urothéliale.
Les mécanismes de cicatrisation étant en partie impliqués et déviés au cours de la cancérogenèse
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urothéliale. Utilisant à partir du 15 ème jour nous avons réalisé des cultures à confluence nous avons
réalisé des blessures circulaires de 4 mm de diamètre la régénération a été étudiée dans un milieu
défini grâce à un analyseur d'images à 4, 24 et 28 heures. La prolifération a été étudiée par
incorporation de Brdu et l'expression des facteurs de croissance par RT-PCR. Le rôle du récepteur à
l'EGF a été étudié utilisant des anticorps bloquants ainsi que des inhibiteurs de l'activité tyrosine
kinase de ce récepteur (AG1478). Nous avons étudié le rôle de l'amphiréguline de l'EGF du TGF-α et
de l'HBEGF à des doses réceptives de 20 ng/ml, 100 ng/ml ml, 20 ng/ ml et 20 ng/ml. Dans ce modèle
la cicatrisation spontanée est obtenue en 48 heures. Elle est inhibée par l'AG418 et les anticorps de 50
et 30 % respectivement. Cette inhibition s'accompagne d'une inhibition de la prolifération et de la
migration cellulaire. La régénération est marquée par une augmentation de production de gène
HBEGF au niveau des ARN sans changement au niveau de la quantité du récepteur. Cette cicatrisation
est accélérée par l'addition exogène de TFG-α HB-EGF et TGF-α. Il n'y a pas d'effet de l'EGF par luimême.
Ces résultats montrent qu'il existe une boucle autocrine impliquant le récepteur à l'EGF et l'HBEGF
dans la cicatrisation urothéliale et que le récepteur à l'EGF est donc une cible potentielle pour contrôler
la prolifération des cellules urothéliales
Figure 1 : Effet d’un inhibiteur de l’EGFR (AG1478) sur la cicatrisation urotheliale
A
4h
B
24h
C
48h
Serum free
D
E
F
AG1478
IV 1. 2.2 - Modèle in vitro de la thérapie ciblée des tumeurs urothéliales sur le récepteur à l'EGF
La surexpression du récepteur à l'EGF au cours de la cancérogénèse et de la progression des tumeurs
urothéliales est bien établie. Nous avons mis en évidence une relation entre la surexpression du
récepteur à l'EGF et la prolifération cellulaire ainsi que le pronostic. Nous avons également établi une
lignée cellulaire qui présente une amplification du gène de récepteur et qui répond aux facteurs de
croissance de la famille de l'EGF (lignée 1207). Ces éléments associés au rôle du récepteur à l'EGF
dans la cicatrisation urothéliale nous a amené à étudié le rôle des inhibiteurs spécifiques du récepteur à
l'EGF comme thérapeutiques potentielles dans le cancer urothéliale. En collaboration avec les
laboratoires Astra Zeneca, nous avons étudié les faits du Gefitinib (Iressa). Nous avons étudié
l'expression des récepteurs Erb-B (1, 2 et 3) sur 6 lignées cellulaires (D24, J82, RT112, SD 24 SD148
10-07). Il existe une corrélation entre le niveau d'expression des transcrits et le niveau des protéines.
Parmi les ligands exprimés de façon endogène par ces lignées cellulaires, le TGF-α, l' HEBGF et
l'amphériguline sont les plus importants. L'EGF est peu ou pas exprimé. L'Epiréguline est exprimé
dans SD24 et SD148. Nous avons observé en utilisant deux inhibiteurs l'AG14 78 et le ZT 18 39, un
effet significatif sur la prolifération est observé avec les lignées 64 7V et 1207. Ces résultats montrent
alors qu'il existe un effet dose du ZT 18 89 sur la lignée 1207 avec une IC50 à 0,25 µM. Cette
diminution de la prolifération s'associe à une augmentation de la proportion des cellules en phase GA.
8

GETU
Les résultats de l'étude de la signalisation du récepteur à l'EGF montrent que la sensibilité aux
inhibiteurs de ce récepteur n'est pas liée à son expression mais à son activation. En effet, seules les
lignées 64 7V et 1207 possèdent une autophosphorylation du REGF avec une activation de la voie des
MAK et également de la voie Akt qui est impliquée dans la résistance à l'apoptose. Nous avons étudié
la phosphorisation spontanée du récepteur de la Tyrosine 1068 sur 29 tumeurs urothéliales de la vessie
et cette phosphorisation est retrouvée dans 46 % des tumeurs superficielles et 81 % des tumeurs
invasives. Ces résultats suggèrent que l'effet du Gefitinib (Iressa, ZD 1839) ne dépend pas de
l'expression du récepteur mais de l'incubateur spécifique de sa voie de signalisation. Cette observation
peut avoir des implications cliniques importantes pour l'utilisation de ces nouvelles moléculaires en
cancérologie.
a)
Figure 2 a et b : Inhibition dose dépendante de la viabilité et de la phosphorylation
Du REGF par ZD1839.
Inhibitory effect of IRESSA
100
inhibition (%)
80
60
40
20
1207
0
0 0,5 1 1,5 2
Concentration (µM)
b)
Dans le cadre de ce projet, nous voulons préciser les indications de la thérapie ciblée sur l'EGFR dans
les tumeurs urothéliales de la vessie.
9

GETU
IV. 1.2.3 - Epidémiologie moléculaire. Analyse génomique, D. Chopin, JP. Pairon
Le projet analyse les étapes critiques moléculaires et génétiques des tumeurs urothéliales en tenant
compte des facteurs étiologiques moyens qui sont le tabac et l'exposition professionnelle, nous avons
généré les résultats suivants :
Analyse épidémiologique
Dans le cadre d’une étude épidémiologique prospective, cas- contrôle multicentrique regroupant les
centres suivants de l’AP-HP : Henri Mondor, Ambroise Paré, Bichat, Tenon et, le Centre
Intercommunal de Créteil, nous avons inclus 250 cas incidents de cancer de la vessie chez des
individus de sexe masculin, d'origine caucasienne et parallèlement, 250 individus porteurs d'adénome
de prostate comme témoins. Une enquête professionnelle et environnementale a été effectuée chez
tous les cas, une analyse de l’intoxication tabagique a été effectuée chez les cas et les témoins. Une
analyse à ce stade a permis de caractériser cette cohorte quant à l’intoxication tabagique et aux
expositions professionnelles.
Influence du tabagisme
Il existe une nette sur représentation des fumeurs et des ex-fumeurs chez les cas par rapport aux
témoins p

GETU
Les résultats de cette étude épidémiologique démontrent l’importance du tabac et des facteurs
d’exposition professionnel dans l’oncogénèse des tumeurs de la vessie et la gravité des formes liées au
tabac.
Pathologie moléculaire du cancer vésical, génotype des voies de carcinogenèse et agressivité tumorale
Depuis de nombreuses années, la notion de deux maladie au sein du spectre que représentent les
tumeurs urothéliales de la vessie « two pathways of urothelial carcinoma » est suggérée sur un
faisceau d’arguments :
• Les études épidémiologiques ont montré que la majorité des tumeurs invasives (80%) se
présentent comme telles au diagnostic initial sans antécédent de tumeurs superficielles
• Les cartographies des pièces de cystectomie qui montrent des modes d’invasions différents entre
les tumeurs papillaires diffuses qui poussent comme des fronts et se limitent le plus souvent à
l’effraction de la lamina propria, et l’invasion pénétrante en flèche du muscle des tumeurs
infiltrantes dérivés des CIS,
• Le risque de progression très différent des tumeurs papillaires par rapport aux tumeurs solides non
papillaires
• L’association à du carcinome in situ des tumeurs papillaires G1 G2 qui progressent
• Le risque majeur de progression du CIS diffus en l’absence de traitement.
Nous avons contribué à la caractérisation sur le plan génétique de ce concept. En effet nous avons
identifié que les mutations du gène FGFR3 étaient l’altération génétique la plus fréquente dans les
tumeurs urothéliales de la vessie et caractérisaient les tumeurs papillaires et de bas grade, ayant un
faible taux de récidive à l’inverse de celle de TP53. Nous avons, les premiers, fait l’observation que
les mutations de ces deux gènes étaient mutuellement exclusives, au diagnostic initial, et définissaient
une voie génétique alternative dans l’oncogenèse vésicale (figure 1). Ces résultats et ceux de nos
études épidemiologiques nous incitent à évaluer ces mutations en fonction du contexte étiologique, ce
qui permettrait de mieux comprendre les mécanismes endogènes et exogènes de la carcinogénèse
vésicale. C’est dans ce cadre que nous pourrons progresser dans l’identification des altérations clés des
différentes voies de progression tumorale, en utilisant les nouvelles techniques d’analyse du vivant à
haut débit sur des groupes de tumeurs ayant déjà un classifiant génotypique.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
FGFR3mut/p53wt
FGFR3wt/P53wt
FGFR3wt/P53mut
FGFR3mut/P53mut
TA T1 T2-T4
Figure 1 : Génotypage de 86 tumeurs urothéliales au diagnostic initial. Les doubles mutations sont quasiexclusives.
Il existe une très forte association significative entre le stade (Ta-T1/T2->T2) le grade (G1-G2/G3) et
les génotypes FGFR3 mut-TP53wt versus FGFR2wt-TP53mut. (OR=29.07 95% IC 5.26-160.66 et OR= 12.73
95% IC 3.07-52.78) . Il existe un groupe important de tumeurs n’ayant aucune des mutations de ces deux gènes.
Ces deux mutations constituent les bases d’une caractérisation moléculaire des tumeurs urothéliales, et
fournissent un canevas d’analyse des autres altérations génétiques et moléculaires connues ou non décrites dans
les tumeurs urothéliales.
11

GETU
Etapes du projet et Bases Méthodologiques
L’objectif général de ce projet est de caractériser sur le plan moléculaire et génétique, les tumeurs
urothéliales de la vessie au diagnostic initial en fonction de l’intoxication tabagique et de l’exposition
professionnelle.
Les objectifs spécifiques sont :
1. d’identifier des mécanismes exogènes et endogènes de carcinogenèse vésicale en fonction des
mutations de p53 et de FGFR3
2. de caractériser d’autres altérations génétiques ou moléculaires connues ou non, en fonction des
expositions et du génotype p53/ FGFR3 par l’utilisation des techniques d’analyse à haut débit :
puce a tissus, puce à ADN (transcrits et CGH)
3. d’identifier des signatures d’exposition professionnelles et ou de l’intoxication tabagique, et de
disposer de marqueurs étiologiques
4. d’améliorer la prise en charge de ces tumeurs par une classification moléculaire tenant
également compte des facteurs étiologiques.
La Méthodologie
Collection biologique, caractéristiques anatomocliniques, épidemiologiques et analyses :
Les données clinico-pathologiques (endoscopiques et histologiques) ont fait l’objet d’un consensus
urologique et anatomopathologique dans le cadre du Comité de Cancérologie de l’Association
Française d’Urologie, résumé dans le rapport de l’AFU sur les tumeurs superficielles rédigé en 2001
par D Chopin et B Gattegno. L’ensemble de ces variables codées de façon exclusive est relevé sur une
base de données relationnelle anonymisée.
Les données épidémiologiques font l’objet d’un questionnaire standardisé recueilli auprès des patients
par des enquêteurs et sont analysées en aveugle par une équipe de Médecine du Travail, de l'Institut
Inter Universitaire de Médecine du Travail de Paris, Ile de France.
Tumorothèque : Ce projet s’appuie donc sur la constitution d’une banque de tissus et de sang total. Les
prélèvements proviennent de trois hopitaux : Bichat, Tenon et Henri Mondor. Ils sont centralisés dans
le cadre de la tumorothéque des services de pathologie respective. Actuellement nous utilisons une
technique de triple extraction qui permet d’isoler, à partir d’un même prélèvement broyé dans le
thiocyanate de guanidine, à l'aide d'un gradient de chlorure de césium, l’ADN, l’ARN et les protéines.
L’isolement de l’ADN contrôle est réalisé à partir du sang total. Cette méthodologie nous permet
d’avoir accès non seulement aux anomalies de l’ADN, mais également à l’ARN et pour une partie aux
protéines. L’inconvénient de cette technique est son coût en consommables et temps technique.
Cependant la qualité d’obtention du matériel permet la conservation et le transport des échantillons
dans les différents laboratoires impliqués dans l’étude.
Mutations : Les tumeurs utilisées dans ce projet seront génotypées pour P53 et FGFR3 qui
caractérisent deux voies spécifiques de carcinogenèse utilisant la technique de DHPLC. Après
amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), nous avons réalisé une PCR
de l’ADN tumoral et génomique pour chaque prélèvement et pour chaque exon étudié. Dans le cas de
P53, nous avons étudié les exons 2 à 11 et en ce qui concerne le FGFR3, les exons 7, 10 et 15. En ce
qui concerne les mutations de P53, on utilise une matrice de 100 nanogrammes de l’ADN génomique.
Les amorces utilisées dans l’étude des mutations du gène P53 et FGFR3 ont fait l’objet de
publications.
Utilisation des Puces à ADN : L'analyse des nouveaux gènes potentiellement impliqués dans les
groupes de tumeurs que nous avons définis sera effectuée dans le cadre de la plateforme de l’IFR10 de
Créteil. Pour l’analyse du transcriptome, les puces Affymetrix U133 Plus seront utilisées avec 5 µg
d’ARN par échantillon. Pour l’analyse du génome, nous utiliserons les puces CGH produites par le
laboratoire de Dan Pinkel UCSF, les expériences que nous avons déjà effectuées sur quarante
échantillons montrent que 300ng d’ADN par hybridation sont suffisants.
Tissu Micro-Arrays/Immunohistochimie : La constitution de tissu micro-array apparaît comme
indispensable pour évaluer rapidement les gènes candidats identifiés par les puces à ADN. On
considère que 3 prélèvements par tumeurs sont souhaitables pour avoir un échantillon représentatif.
Les analyses immunohistochimiques seront dans certains cas particuliers effectuées sur coupes
congelées. Nous étudierons en particulier les voies de signalisation des EGFs (ligands, récepteurs).
12

GETU
Analyse : Une des étapes limitantes dans les études faisant appel à la technologie des puces est
l’analyse. Nous avons mis en place des outils d’analyse en collaboration notamment avec l’Institut
Curie (UMR144) et la société ISoft dans le cadre d’un projet financé par le ministère de la Recherche
(Biogen 74, Réseau GenHomme – BioIngénierie 2001). Ce projet initial a été poursuivi dans le cadre
d’un projet européen (http://isoft.free.fr/hkis/) et une plate-forme d’analyse sera disponible au mois
d’Octobre
Nombre de sujets nécessaires /nombre de prélèvements : Dans la précédente étude épidémiologique
nous avons pu collecter 150 prélèvements sang/tumeurs sur 250 patients inclus. L’objectif est de
disposer de 300 prélèvements compte tenu de l’expérience acquise et de la sélection des centres
structurés pour la collection de prélèvement dans le cadre de la démarche tumorothèque à l’AP-HP
,nous estimons raisonnable de collecter sur ces 3 centres 200 cas incidents sur 2 ans. Nous estimons
ainsi disposer de 60 cas de tumeurs de non fumeurs et de 60 cas de patients exposés a des
carcinogènes professionnels. Le génotypage des tumeurs a été effectuée sur 110 cas et le sera sur
l’ensemble des prélèvements réalisés. L’analyse genomique sera réalisé sur 3 groupes de 60 tumeurs
non-fumeurs/Exposés/fumeurs
Résultats attendus
L'analyse des altérations génétique et moléculaire des gènes critiques des tumeurs urothéliales dans le
cadre de ce projet pourrait :
- Apporter une aide pour relier les expositions aux carcinogènes au processus tumoral
- Proposer une prise en charge médico-sociale optimale chez les patients en améliorant la
reconnaissance de leur origine professionnelle
- Apporter les bases moléculaires pour la compréhension de la carcinogenèse urothéliale et
l’identification de cibles moléculaires
V. Thérapie Cellulaire de l’Incontinence Urinaire par Insuffisance sphincterienne Activités de
Recherche . Dr R Yiou
Evaluation de l'autogreffe de cellules précurseurs musculaires dans un modèle d'insuffisance
sphinctérienne urétrale chez la truie.
L’incontinence urinaire d’effort affecte 10% des femmes actives et 40% des femmes de plus de 60
ans, soit au total près d’1,5 millions de femmes en France. Les dépenses publiques allouées à
l’incontinence urinaire s’élèvent à plus de deux milliards d’euros par an en France. Il s’agit donc d’un
véritable problème de santé publique.
Les principaux facteurs étiologiques de l’incontinence urinaire sont les traumatismes obstétricaux, les
accouchements multiples et la chirurgie pelvienne, en raison des dommages musculaires et
aponévrotiques qu’ils engendrent. Une hypermobilité vésico-urétrale et/ou une insuffisance
sphinctérienne urétrale sont présentes dans la majorité des cas. L’insuffisance sphinctérienne urétrale
est le résultat d’une baisse du tonus sphinctérien. Parmi les principales options thérapeutiques –
médicaments, rééducation et chirurgie – seule la chirurgie a démontré une réelle efficacité dans les
formes sévères d’insuffisance sphinctérienne. La mise en place d’une bandelette sous urétrale
synthétique ou aponévrotique ou l’injection péri urétrale de substances inertes, visant à augmenter la
résistance à l’écoulement urinaire, constituent les traitements chirurgicaux de premières intentions.
Cependant, le taux de récidives à long terme de ces techniques est relativement élevé.
Chez l’homme, l’incontinence urinaire survient habituellement après une intervention sur la prostate
lorsque le sphincter urétral a été lésé. La rééducation ou des injections péri urétrales sont rarement
efficaces et la seule possibilité thérapeutique est bien souvent la mise en place d’un sphincter artificiel.
V.1 Justification de la recherche
Nous proposons une nouvelle stratégie thérapeutique de l’insuffisance sphinctérienne visant à
augmenter le tonus sphinctérien par une autogreffe de cellules précurseurs musculaires (cpm).
L’insuffisance sphinctérienne urétrale peut être considérée comme une myopathie complexe affectant
un petit muscle et est donc candidate pour un traitement par injection de cpm.
13

GETU
Depuis 1998, le Dr R. Yiou a initié une activité de recherche à l’EMI 11 INSERM et au Centre de
Recherches Chirurgicales de l’hôpital Henri Mondor dans le but de mettre au point les bases
anatomiques et biologiques de la thérapie cellulaire de l’insuffisance sphinctérienne.
Il a montré que le sphincter strié urétral, bien qu’ayant une origine embryologique différente
(mésoderme splanchnique) des muscles striés squelettiques (somites), dispose d’un programme de
différentiation myogénique standard impliquant l’activation de cellules précurseurs musculaires
sphinctériennes intrinsèques (cellules satellites) (Yiou et al., Anatomy and Embryology, 2003). Ce
travail a ouvert de nouvelles perspectives de traitement de l’insuffisance sphinctérienne, s’inspirant
des connaissances acquises dans le cadre des myopathies génétiquement déterminées. En effet, des
traitements connus pour favoriser la régénération des muscles striés squelettiques et agissant
directement ou indirectement sur les cpm sont désormais applicables au sphincter strié urétral. Il a été
montré à l’aide d’un modèle de lésion sphinctérienne transitoire chez la souris, que des cpm extraites
de muscle de la patte interagissent avec les cpm sphinctériennes pour former de nouvelles fibres
musculaires mosaïques et accélérer le processus de régénération (Yiou et al., 2002). Yiou et al. (2003)
ont ensuite testé chez le rat l’autogreffe de cpm sur une lésion irréversible entraînant une fibrose et
dénervation. Ces expériences ont établi que des cpm injectées peuvent se développer dans ce contexte
et activent le bourgeonnement des terminaisons nerveuses locales résiduelles. Ceci aboutit à la
formation de nouvelles fibres musculaires innervées qui augmentent la force de contraction
sphinctérienne obtenue par stimulation électrique. Ces résultats donnent une justification à la greffe de
cpm dans le traitement de l’insuffisance sphinctérienne car cette pathologie se caractérise sur le plan
histopathologique par une perte de fibres musculaires et une dénervation chronique.
L’objectif principal du projet présenté est de démontrer qu’une greffe de cpm peut reconstituer un
sphincter physiologique, c'est-à-dire capable de développer une activité tonique basale permanente,
assurant la continence urinaire. La notion d’activité tonique sphinctérienne constitue la principale
originalité de ce projet de greffe de cpm. En effet, les fibres musculaires sphinctériennes sont de type
I (fonctionnement en mode anaérobie) et ont donc la particularité d’exercer des contractions toniques
prolongées. S’il est bien établi que la greffe de cpm peut améliorer la force de contraction
électrostimulée d’un muscle squelettique détruit (contraction de type tétanique), il reste à déterminer si
le tonus basal du muscle est aussi modifié. En d’autres termes, les cpm injectées dans un sphincter
urétral ont-elles la capacité de former des fibres de type I Les résultats de nos travaux préliminaires
concernant l’action trophique des cpm sur les terminaisons nerveuses résiduelles chez le rat permettent
d’envisager cette éventualité.
IV. 2 Résultats attendus
A l’aide du modèle de lésion sphinctérienne urétrale chez la truie, nous chercherons à déterminer si
une greffe intrasphinctérienne de cellules précurseurs musculaires extraites de muscles périphériques
peut augmenter le tonus sphinctérien. Nous déterminerons la valeur fonctionnelle des fibres
musculaires résultant de la différenciation des cellules injectées par une double analyse histologique
et urodynamique. L’étude histologique déterminera le type des fibres nouvellement formées (fibres de
type I ) ainsi que leur état d’innervation. Le bilan urodynamique étudiera le tonus sphinctérien basal
et après électrostimulation par la mesure de la pression urétrale. L’utilisation d’un logiciel de
reconstruction tridimensionnelle (Surfdriver), à partir de plusieurs coupes histologiques équidistantes
d’un sphincter traité et un suivi IRM permettra d’évaluer le volume musculaire créé. L’analyse du
rapport volume musculaire créé / nombre de cellules injectées apportera les données nécessaires pour
une future application chez l’homme.
IV. 3 Résultats préliminaires
Le modèle pré clinique d’insuffisance sphinctérienne urétrale chez la truie
Afin de développer un modèle pré clinique d’insuffisance sphinctérienne, nous avons étudié au cours
des années 2002-2004 (DEA des Dr L. Zini et C. Lecoeur) les caractéristiques morphologiques et
urodynamiques de l’appareil sphinctérien de la truie. Il a été établi que le sphincter strié urétral de cet
animal présente des ressemblances anatomiques et fonctionnelles avec le sphincter de l’homme ; en
particulier, il est composé d’une forte proportion en fibres de type I (figure 1) et développe une activité
tonique basale quantifiable.
14

GETU
figure 1 : étude immunohistochimique du sphincter strié urétral de truie avec un anticorps anti myosine type I et
II montrant la présence de fibres à action tonique
Nous avons mis au point une méthode d’évaluation sphinctérienne tout à fait originale comprenant :
• Un bilan urodynamique qui mesure la tonicité du sphincter strié urétral (figure 2).
• Une étude du volume sphinctérien fonctionnel par IRM (collaboration avec l’Ecole Vétérinaire
d’Alfort) (figure 3) et par histologie avec reconstruction tridimensionnelle à partir de coupes
histologiques numérisées à intervalles réguliers (logiciel Surfdriver) (figure 4).
figure 2 : bilan urodynamique sur un animal anesthésié montre une pression de clôture correspondant à la force
de contraction tonique basale du sphincter strié urétral.
figure 3 : IRM du sphincter strié urétral de la truie.
figure 4 : Reconstruction 3D du sphincter strié urétral à partir de coupes histologiques numérisées.
figure 5 : Reconstruction 3D du sphincter lésé.
15

GETU
Nous avons établi un modèle de lésion sphinctérienne par électrocoagulation. Cette lésion entraîne une
abolition du tonus sphinctérien (figure 6) et une perte définitive des fibres musculaires et de leur
innervation (figure 5,7).
Figure 6: Abolition la pression intra urétrale un mois après lésion du sphincter.
Figure 7 : Aspect histologique du sphincter strié urétral après lésion médiale.
Mise au point de l’injection intra sphinctérienne et du suivi in vivo de l’autogreffe de cellules
précurseur musculaire
Nous avons développé une méthode d’extraction et de culture de cellules précurseurs musculaires de
truie à partir de fibres musculaires isolées. Ces cellules peuvent être cultivées en milieu grade clinique
et forment des fibres musculaires exprimant des marqueurs myogéniques (Desmine) et de cellules
souches (Pax7) (figure 8). En collaboration avec l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort et
L’université Paris VI, nous avons mis au point différentes techniques de marquage cellulaire pour
suivre l’évolution des cpm in vivo :
• Marquage par adénovirus GFP (figure 9).
• Marquage par nanoparticules de Fer permettant un suivi in vivo par IRM (figure 10).
Figure 8 : Aspect des cultures de cellules précurseur musculaire de truie après 10 jours, avec immuno-marquage
anti-desmine.
16

GETU
Figure 9 : Marquage des cellules précurseur musculaire avec un adénovirus GFP.
Figure 10 : Marquage par des nanoparticules de Fer des fibres musculaire permettant un suivi par IRM, in vitro.
Nous avons ensuite testé la faisabilité de l’injection intrasphinctérienne de cpm après repérage
anatomique par voie vaginale. Nous avons établi que le sphincter strié occupe les deux derniers
centimètres de l’urètre et est facilement identifiable par voie vaginale et extériorisation de l’urètre.
Après lésion par électrocoagulation de la circonférence de l’urètre, une cicatrice fibreuse est visible.
Le repérage par voie vaginale du sphincter urétral normal ou lésé est donc aisé. Il est ensuite possible
d’introduire d’une aiguille souple de 7Fr (18Ga) de diamètre externe et de 400 mm de longueur
(Porges). Cette aiguille permet d’injecter les cellules par voie vaginale.
Sont donc considérés comme acquis pour la réalisation du projet :
• La description anatomique de l’appareil sphinctérien chez la truie
• Un modèle de lésion sphinctérienne avec évaluation histologique et urodynamique
• Une méthode de culture de cellules précurseurs musculaires
• Une méthode de marquage cellulaire par des adénovirus GFP et des nanoparticules de Fer
• Une méthode d’injection intrasphinctérienne par voie vaginale
Objectifs de la recherche
L’objectif principal de notre projet est donc d’évaluer par des méthodes d’imagerie médicale (IRM),
histologiques et urodynamiques l’effet d’une autogreffe de cellules précurseurs musculaires sur le
sphincter urétral de truies rendues incontinentes.
Nous allons tester l’hypothèse selon laquelle des cpm extraites de muscles périphériques et injectées
dans le sphincter urétral irréversiblement détruit du même animal peuvent former de nouvelles fibres
musculaires fonctionnelles.
Nous étudierons les capacités des cpm à migrer dans un sphincter lésé et déterminerons le nombre de
sites d’injection nécessaire pour couvrir la totalité d’un sphincter.
Références :
1. Yiou R, Zini L, Lecoeur C, Atala A, Chopin D, Abbou CC. La thérapie cellulaire de l’incontinence urinaire
par autogreffe de cellules précurseur musculaire. Prog Urol. 2004, Feb;14(1):93-100
2. Yiou R, Yoo J, Atala A. Restoration of functional motor units in a rat model of sphincter injury by muscle
precursor cell autografts. Transplantation. 2003 Oct 15;76(7):1053-60
3. Yiou R, Lefaucheur JP, Atala A. The regeneration process of the striated urethral sphincter involves activation
of intrinsic satellite cells. Anat Embryol (Berl). 2003 May;206(6):429-35
17

GETU
VI. Laparoscopie Urologique, CC. Abbou, P. Antiphon, L. Salomon
VI. 1. Enseignement
Cet enseignement organisé par le Pr CC Abbou se déroule au CRCHM dans le cadre d’un DIU Paris
XII, Faculté de Médecine de Clermond-Ferrand en partenariat avec la Société Storz. Cet enseignement
a permis la formation de plus de 400 participants en 5 ans par groupe de 12 personnes.
VI. 2. Travail de recherche : P. Antiphon, L. Salomon, D. Chopin, CC. Abbou
Planification et simulation d'interventions endoscopique standardisées et robotisées.
Ce travail a été effectué en collaboration avec l'équipe ChIR et l'INRIA. L'objectif de ce travail est
d'optimiser la position des trocarts au cours de la lomboscopie rétropéritonéale pour la chirurgie
laparoscopique du rein et de simuler l'utilisation de robot compte tenu des contraintes spécifiques liées
à cet abord chirurgical. La méthode est basée sur la mise au point d'un modèle anatomique en trois
dimensions. La modélisation des déplacements per opératoires en utilisant le logiciel Stars (Simulation
and Transfert Architecture for Robotic Surgery) qui a été mis au point pour la chirurgie cardiaque. Les
résultats de cette étude que l'acquisition des données anatomiques était plus aisée à partir de scanner
qu'en IRM. La segmentation à été réalisée à partir d'images en deux dimensions manuelles les organes
étant définis par l'injection de produits de contraste. Cette segmentation, compte tenu de la faible
différente de densité entre les organes intra abdominaux, n'a pas pu être automatisée contrairement aux
structures cutanées et osseuses. La reconstruction a été effectuée en plaçant le patient en position
opératoire (décubitus latérale avec un billot) ce qui a permis de simuler le déplacement des organes
rétro péritonéaux liés à la position chirurgicale. La reconstruction en 3 dimensions a été réalisée en
utilisant le logiciel Nuage qui permet une reconstruction en 3 dimensions de chaque élément de la
région lombaire aussi bien le rein que les éléments pariétaux.
18

La segmentation
GETU
Segmentation manuelle 2D des tissus mous.
Contrôle du résultat de la segmentation.
Reconstruction 3D de la fosse lombaire droite
19

GETU
L'acquisition de cette modélisation a été effectuée au cours d'interventions laparoscopiques réelles
utilisant des clichés per opératoires en 2 dimensions et la mise en place de repères métalliques cutanés
et également sur la face postérieure du rein.
La calibration est en fait en comparant les images pré et post opératoires. Cette méthode a permis de
définir les zones cibles de l'organe et les points d'entrée possibles au niveau cutané. L'optimisation des
critères de placement des trocarts a été définis par des algorithmes mathématiques.
Le placement des trocarts a été pondérés en fonction des critères suivants :
• la dextérité (minimisation de l'angle entre les points d'entrée et les cibles de l'organe opéré).
• La séparation (maximalisation de l'espace entre le trocart et l'évitement des collisions externes.
• L'inversion (minimisation du risque de travailler à contre caméra)
• La symétrie (maximalisation de la vision du champ laparoscopique
• L'obstruction (minimisation du risque de collisions internes entre les instruments)
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100% Obstruction 100% Séparation 100% Inversion
100% Dextérité 25% O 25% S 25% I 25% D 0% O 26% S 33% I 41% D
Le positionnement des trocarts peut donc être envisagé en fonction de chacun de ces critères
séparément ou en fonction d'une pondération de chacun d'entre eux, ce qui permet de calculer et
d'identifier de l'anatomie du patient la position optimale théorique des trocarts. Dans ce travail nous
avons également étudié les conséquences spécifiques du placement des instruments de l'assistant et
simulé les possibilités d'utilisation du robot et du risque de collision potentielle en fonction de la
position opératoire et de l'anatomie du patient.
En conclusion, ce travail permet une approche théorique et une simulation des interventions
laparoscopiques ainsi que l'utilisation potentielle de la robotique chirurgicale en prévoyant les
impossibilités et les conflits techniques possibles entre les instruments.
__________________________
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GROUPE D'ETUDES DES TUMEURS UROLOGIQUES
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