72841-Platelia Toxo IgM.pdf - BIO-RAD

PLATELIA TOXO IgM 72841
96 TESTS
QUALITATIVE DETECTION OF IgM ANTIBODIES TO
TOXOPLASMA GONDII IN HUMAN SERUM OR
PLASMA BY ENZYME IMMUNOASSAY

1. INTENDED USE
Platelia Toxo IgM is an immunoassay using immunocapture format for
qualitative detection of IgM antibodies to T. gondii in human serum or plasma.
2. CLINICAL VALUE
T. gondii is a protozoan causing infection in numerous species of mammals
and birds. Toxoplasmosis, frequent in humans and animals, are more typically
silent. The prevalence of this infection in the population, established using
serological tests, may differ depending upon the country of origin and the age.
Toxoplasmosis during pregnancy has been implicated in serious congenital
abnormalities (in particular, impaired brain functions) and sometimes stillbirth.
Demonstration of Toxo IgG antibody in women prior to conception provides
assurance of fetal protection from possible toxoplasmosis during pregnancy.
Predisposition to severe toxoplasmosis infection is common in persons known
to have Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), or who are otherwise
immunocompromised. These infections are mainly due to reactivation of
T. gondii cysts present prior to the HIV infection.
Specific diagnosis of T. gondii infection can be complicated and isolation of
the parasite is rare. Serologic confirmation of T. gondii antibody is indicative of
exposure to the parasite and has become widely accepted as a means to
determine immune status and susceptibility to infection. Screening of several
isotypes allows either the dating of the T. gondii and the implementation of
appropriate therapy in case of recent infection or the proposal of prophylactic
recommendations: hygiene-diet guidelines in pregnant women, chemoprophylaxy
in immunocompromised population.
3. PRINCIPLE
Platelia Toxo IgM is a qualitative test for detection of IgM antibodies to
T. gondii in human serum or plasma by enzyme immunoassay with capture of
the IgM on the solid phase.
Anti-human µ-chains antibodies are coated on the solid phase (wells of the
microplate). A mixture of the T. gondii antigen and the monoclonal anti-
T. gondii antigen antibody labeled with peroxydase is used as the conjugate.
The test uses the following steps :
• Step 1
Patients samples, calibrator and controls are diluted 1/21 and then distributed
in the wells of the microplate. During this incubation of one hour at 37°C, IgM
antibodies present in the sample bind to the anti-µ antibodies coated on the
microplate wells. After incubation, IgG and other serum proteins are removed
by washings.
2

• Step 2
The conjugate (mixture of T. gondii antigen and anti-T. gondii monoclonal
antibody labeled with peroxydase) is added to the microplate wells. During this
incubation of one hour at 37°C, the conjugate binds to the specific IgM anti-
T. gondii antibodies that were eventually captured on the microplate. The
unbound conjugate is removed by washings at the end of the incubation.
• Step 3
The presence of immune-complexes (Anti-human µ-chains / IgM anti-T. gondii
/ T. gondii Antigen / anti-T. gondii monoclonal antibody labeled with
peroxydase) is demonstrated by the addition in each well of an enzymatic
development solution.
• Step 4
After incubation at room temperature (+18-30°C), the enzymatic reaction is
stopped by addition of 1N sulfuric acid solution. The optical density reading
obtained with a spectrophotometer set at 450/620 nm is proportional to the
amount of IgM antibodies to T. gondii present in the sample.
4. PRODUCT INFORMATION
Supplied quantities of reagents have been calculated to allow 96 tests. All
reagents are exclusively for in vitro diagnostic use.
Label Nature of reagents Presentation
R1 Microplate Microplate: (Ready-to-use):
12 strips with 8 breakable wells, coated with
anti-human µ chains
1
R2
R3
Concentrated
Washing
Solution (20x)
Negative
Control
Concentrated Washing Solution (20x):
TRIS-NaCl buffer (pH 7.4), 2% Tween ® 20
Preservative :< 1.5% ProClin 300
Negative Control:
Human serum negative for IgM antibodies to
T. gondii, and negative for HBs antigen,
anti-HIV1, anti-HIV2 and anti-HCV
Preservative : < 1.5% ProClin 300
R4 Calibrator Calibrator:
Human serum reactive for IgM antibodies to
T. gondii, and negative for HBs antigen,
anti-HIV1, anti-HIV2 and anti-HCV
Preservative : < 1.5% ProClin 300
1 x 70 mL
1 x 0.75 mL
1 x 0.75 mL
3

Label Nature of reagents Presentation
R5 Positive Positive Control:
1 x 0.75 mL
Control Human serum reactive for IgM antibodies to
T. gondii, and negative for HBs antigen,
anti-HIV1, anti-HIV2 and anti-HCV
Preservative : < 1.5% ProClin 300
R6a Antigen T. gondii Antigen:
Lyophilized T. gondii antigen
2 x qs 14 mL
For storage conditions and expiration date, please refer to the indications
stated on the box.
5. WARNINGS AND PRECAUTIONS
The reliability of the results depends on correct implementation of the following
Good Laboratory Practices:
• Do not use expired reagents.
• Do not mix or associate within a given run reagents from different lots.
REMARK: For Washing Solution (R2, label identification: 20x colored
green), Chromogen (R9, label identification: TMB colored turquoise)
and Stopping Solution (R10, label identification: 1N colored red), it is
possible to use other lots than those contained in the kit, provided
these reagents are strictly equivalent and the same lot is used within
a given test run.
REMARK: In addition, the Washing Solution (R2, label identification:
20x colored green) can be mixed with the 2 other washing solutions
4
R6b
Conjugate
(101x)
Conjugate (101x):
Murine monoclonal antibody anti-T. gondii
(P30) labeled with peroxydase
Preservative : < 1.5% ProClin 300
R7 Diluent Diluent for samples and conjugate
(Ready-to-use):
TRIS-NaCl buffer (pH 7.7), bovine serum
albumin, 0.1% Tween ® 20 and phenol red.
Preservative : < 1.5% ProClin 300
R9
R10
Chromogen
TMB
Stopping
Solution
1 x 0.4 mL
1 x 80 mL
Chromogen (Ready-to-use):
1 x 28 mL
3.3’.5.5’ tetramethylbenzidine (< 0.1%),
H 2 O 2 (

included in various Bio-Rad reagent kits (R2, label identifications: 10x
colored blue or 10x colored orange) when properly reconstituted,
provided only one mixture is used within a given test run.
• Before use, wait for 30 minutes to allow reagents to reach room temperature
(+18-30°C).
• Carefully reconstitute or dilute the reagents avoiding any contamination.
• Do not carry out the test in the presence of reactive vapors (acid, alkaline,
aldehyde vapors) or dust that could alter the enzyme activity of the
conjugate.
• Use glassware thoroughly washed and rinsed with deionized water or,
preferably disposable material.
• Washing the microplate is a critical step in the procedure: follow the
recommended number of washings cycles and make sure that all wells are
completely filled and then completely emptied. Incorrect washings may lead
to inaccurate results.
• Do not allow the microplate to dry between the end of the washings
operation and the reagent distribution.
• Never use the same container to distribute the conjugate and the
development solution.
• The enzymatic reaction is very sensitive to metal or metal ions.
Consequently, do not allow any metal element to come into contact with the
various solutions containing the conjugate or the chromogen.
• Chromogen solution (R9) should be colorless. The appearance of a blue
color indicates that the reagent cannot be used and must be replaced.
• Use a new pipette tip for each sample.
• Check the pipettes and other equipments for accuracy and correct
operations.
HEALTH AND SAFETY INSTRUCTIONS
Human origin material used in the preparation of reagents has been tested and
found non-reactive for hepatitis B surface antigen (HBs Ag), antibodies for
hepatitis C virus (anti-HCV), and to human immunodeficiency virus (anti-HIV1
and anti-HIV2). Because no method can absolutely guarantee the absence of
infectious agents, handle reagents of human origin and patient samples as
potentially capable of transmitting infectious diseases:
• Any material, including washings solutions, that comes directly in contact
with samples and reagents containing materials of human origin should be
considered capable of transmitting infectious diseases.
• Wear disposable gloves when handling samples and reagents.
• Do not pipette by mouth.
• Avoid spilling samples or solutions containing samples. Spills must be
rinsed with bleach diluted to 10 %. In the event of a spill with an acid, it
5

must be first neutralized with sodium bicarbonate, and then cleaned with
bleach diluted to 10% and dried with adsorbent paper. The material used
for cleaning must be discarded in a contaminated residue container.
• Patient samples, reagents containing human origin material, as well as
contaminated material and products should be discarded after
decontamination only:
- either by immersion in bleach at the final concentration of 5 % of sodium
hypochloride during 30 minutes,
- or by autoclaving at 121°C for 2 hours at the minimum.
CAUTION: Do not introduce solutions containing sodium hypochloride
into the autoclave
• Avoid any contact of reagents, including those considered as not
dangerous, with skin and mucosa.
• Chemical and biological residues must be handled and disposed off in
accordance with Good Laboratories Practices.
• All reagents in the kit are exclusively for in vitro diagnostic use.
Caution: Some of the reagents contain ProClin 300 < 1.5%
R43: May cause sensitisation by skin contact
S28-37: After contact with skin, wash immediately with plenty of
Xi - Irritant water and soap. Wear suitable gloves
6. SAMPLES
1. Serum and plasma (EDTA, heparin or citrate) are the recommended sample
types.
2. Observe the following recommendations for handling, processing and
storage of blood samples:
• Collect all blood samples observing routine precaution for venipuncture.
• For serum, allow samples to clot completely before centrifugation.
• Keep tubes stoppered at all times.
• After centrifugation, separate the serum or plasma from the clot or red
cells in a tightly stoppered storage tube.
• The specimens can be stored at +2-8°C if test is performed within
7 days.
• If test will not be completed within 7 days, or for shipment, freeze the
samples at -20°C or colder.
• Do not use samples that have been thawed more than 3 times.
Previously frozen specimens should be thoroughly mixed (Vortex) after
thawing prior to testing.
6

3. Samples containing 90 g/l of albumin or 100 mg/l of unconjugated bilirubin,
lipemic samples containing the equivalent of 36 g/l of triolein (triglyceride),
and hemolysed samples containing up to 10 g/l of hemoglobin do not affect
the results.
4. Do not heat the samples
7. ASSAY PROCEDURE
7.1 Materials required but not provided
• Vortex mixer.
• Microplate reader equipped with 450 nm and 620 nm filters (*).
• Microplate incubator thermostatically set at 37±1°C (*).
• Automatic, semi-automatic or manual microplate washer (*).
• Sterile distilled or deionized water.
• Disposable gloves.
• Goggles or safety glasses.
• Adsorbent paper.
• Automatic or semi-automatic, adjustable or preset, pipettes or multipipettes,
to measure and dispense 10 µL to 1000 µL, and 1 mL, 2 mL and
10 mL.
• Graduated cylinders of 25 mL, 50 mL, 100 mL and 1000 mL capacity.
• Sodium hypochloride (bleach) and sodium bicarbonate.
• Container for biohazard waste.
• Disposable tubes.
(*) Consult our technical department for detailed information about the
recommended equipment.
7.2 Reagents reconstitution
• R1: Allow 30 minutes at room temperature (+18-30°C) before opening the
bag. Take out the carrier tray, return unused strips in the bag immediately
and check the presence of desiccant. Carefully reseal the bag and store it at
+2-8°C.
• R2: Dilute 1/20 the washing solution R2 in distilled water: for example 50 mL
of R2 and 950 mL of distilled water to get the ready-to-use washing
solution. Prepare 350 mL of diluted washing solution for one plate of
12 strips if washing manually.
• R3, R4, R5: Dilute 1/21 in Diluent (R7) (example: 300 µL of R7 + 15 µL of
Calibrator or Control).
• R6a: T. gondii Antigen is lyophilized. For running 6 strips, reconstitute one
vial of lyophilized antigen by adding 14 mL of Diluent (R7). Mix thoroughly.
Once diluted, the antigenic solution (R6a+R7) must be perfectly clear.
7

• R6 (R6a+R6b) - Conjugate working solution: Add 140 µL of conjugate (R6b)
to each vial of reconstituted T. gondii antigen (diluted R6a). Mix thoroughly.
The conjugate working solution must be reconstituted at least 1 hour before
use.
7.3 Storage and validity of opened and / or reconstituted reagents
The kit must be stored at +2-8°C. When the kit is stored at +2-8°C before
opening, each component can be used until the expiration date indicated on
the outer label of the kit.
• R1: Once opened, the strips remain stable for up to 8 weeks if stored at
+2-8°C in the same carefully closed bag (check the presence of desiccant).
• R2: Once diluted, the Washing Solution can be kept for 2 weeks at +2-30°C.
Once opened, the concentrated Washing Solution stored at +2-30°C, in
absence of contamination, is stable until the expiration date indicated on
the label.
• R3, R4, R5, R6b, R7: Once opened and without any contamination, the
reagents stored at +2-8°C are stable for up to 8 weeks.
• R6 (R6a+R6b): Once reconstituted, the conjugate working solution is stable
for 8 hours at room temperature (+18-30°C) or 2 weeks at +2-8°C.
• R9: Once opened and without any contamination, the reagent stored at
+2-8°C is stable for up to 8 weeks.
• R10: Once opened and without any contamination, the reagent stored at
+2-8°C is stable until the expiration date indicated on the label.
7.4 Procedure
Strictly follow the assay procedure and Good Laboratory Practices.
Before use, allow reagents to reach room temperature (+18-30°C).
The use of breakable wells requires a special attention during handling.
Use calibrator and controls with each run to validate the assay results.
1. Carefully establish the distribution and identification plan for calibrator,
controls and patients samples.
2. Prepare the diluted Washing Solution (R2) [Refer to Section 7.2].
3. Take the carrier tray and the strips (R1) out of the protective pouch [Refer to
Section 7.2].
4. Prepare the conjugate working solution R6 (R6a+R6b) [Refer to Section 7.2].
5. In individually identified tubes, dilute Calibrator (R4) and Controls (R3, R5)
and patients samples (S1, S2…) in Diluent (R7) to give a 1/21 dilution:
300 µL of Diluent (R7) and 15 µL of sample. Vortex diluted samples.
6. Strictly following the indicated sequence below, distribute in each well with
200 µL of diluted calibrator, controls and patient samples:
8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R3 S5 S13
B R4 S6
C R4 S7
D R5 S8
E S1 S9
F S2 S10
G S3 S11
H S4 S12
7. Cover the microplate with an adhesive plate sealer, then press firmly onto
the plate to ensure a tight seal. Incubate the microplate immediately in a
thermostat controlled water bath or in a dry incubator for 1 hour ± 5 minutes
at 37°C ± 1°C.
8. At the end of the first incubation period, remove the adhesive plate sealer.
Aspirate the content of all wells into a container for biohazard waste
(containing sodium hypochloride). Wash microplate 4 times with 350 µL of
the Washing Solution (R2). Invert the microplate and gently tap on
adsorbent paper to remove remaining liquid.
9. Distribute immediately 200 µL of the conjugate working solution (R6) in all
wells. The solution must be shaken gently before use.
10. Cover the microplate with an adhesive plate sealer, then press firmly onto
the plate to ensure a tight seal. Incubate the microplate immediately in a
thermostat controlled water bath or in a dry incubator for 1 hour ± 5 minutes
at 37°C ± 1°C.
11. At the end of the second incubation period, remove the adhesive plate
sealer. Aspirate the content of all wells into a container for biohazard waste
(containing sodium hypochloride). Wash microplate 4 times with 350 µL of
the Washing Solution (R2). Invert the microplate and gently tap on
adsorbent paper to remove remaining liquid.
12. Quickly distribute into each well and away from light 200 µL of Chromogen
solution (R9). Allow the reaction to develop in the dark for 30 ± 5 minutes
at room temperature (+18-30°C). Do no use adhesive plate sealer during
this incubation.
13. Stop the enzymatic reaction by adding 100 µL of Stopping Solution (R10) in
each well. Use the same sequence and rate of distribution as for the
development solution.
14. Carefully wipe the plate bottom. Read the optical density at 450/620 nm
using a plate reader within 30 minutes after stopping the reaction. The strips
must always be kept away from light before reading.
9

15. Before reporting results, check for agreement between the reading and the
distribution plan of plate and samples.
8. INTERPRETATION OF RESULTS
8.1 Calculation of the Cut-Off value (CO)
The Cut-Off value (CO) corresponds to the mean value of the optical densities
(OD) of the cut-off Control duplicates (R4):
CO = mean of OD R4
8.2 Calculation of the Sample Ratio
Sample result is expressed by Ratio using the following formula:
Sample Ratio = Sample OD/CO
8.3 Quality Control
Include the calibrator and controls for each microplate and for each run, and
analyse the obtained results. For validation of the assay, the following criteria
must be met:
• Optical density values:
CO ≥ 0.300
0.80 x CO < OD R4 Repl.1 < 1.20 x CO
0.80 x CO < OD R4 Repl.2 < 1.20 x CO
(Individual OD of each replicate of the Cut-Off control (R4) must not differ more
than 20% of the CO value).
• Optical density ratios:
Ratio R3 (OD R3 / CO) ≤ 0.30
Ratio R5 (OD R5 / CO) ≥ 1.80
If those quality control criteria are not met, the test run should be repeated.
8.4 Interpretation of results
Sample Ratio Result Interpretation
Ratio < 0.80 Negative The sample is considered non reactive for the
presence of IgM antibodies to T. gondii.
0.80 ≤ Ratio < 1.00 Equivocal The sample is considered equivocal for the
presence of IgM antibodies to T. gondii. The
result must be confirmed by another test done
on a second sample drawn at least 3 weeks
later after the first examination.
Ratio ≥ 1.00 Positive The sample is considered reactive for the
presence of IgM antibodies to T. gondii.
10

8.5 Trouble Shooting Guide
Non validated or non repeatable reactions are often caused by:
• Inadequate microplate washings.
• Contamination of negative samples by serum or plasma with a high
antibody titer.
• Contamination of the development solution by chemical oxidizing agents
(bleach, metal ions...).
• Contamination of the Stopping Solution.
9. PERFORMANCES
Performances of Platelia Toxo IgM were evaluated at 2 sites using a total of
863 samples from pregnant women and blood donors.
9.1 Prevalence
Prevalence of anti-Toxo IgM antibodies using Platelia Toxo IgM was
estimated on a panel of 500 samples from pregnant women. 15 samples were
positive for anti-Toxo IgM antibodies. Prevalence measured with Platelia
Toxo IgM assay is established at 3% (15/500).
9.2 Specificity
Specificity was estimated using a panel of 737 samples found negative with
Platelia Toxo IgM TMB (72751) from 2 sites located in France and split as
follows:
• 154 sera from blood donors
• 583 sera from pregnant women
Tested population
/ site
Site 1
Site 2
Pregnant
women
Blood
donors
Pregnant
women
Number
of sera
Negative Equivocal Positive Specificity
102 102 0 0
154 154 0 0
481 480 1 0
Total 737 736 1 0
* Equivocal results were considered as positive for calculation of specificity.
[IC 95%] = 95% confidence interval.
100.0%
(102/102)
[97.1%-100%]
100.0%
(154/154)
[98.1%-100%]
99.8%
(480/481)
[99.8%-99.9%]
99.9%
(736/737)
[99.25%-100%]
11

9.3 Sensitivity
Sensitivity was estimated using a panel of 69 samples found positive with
Platelia Toxo IgM TMB (72751), from 2 sites located in France and split as
follows:
• 4 sera from blood donors
• 65 sera from pregnant women
Platelia
Toxo IgM
(72841)
Platelia Toxo IgM TMB (72751)
Equivocal* Positive Total
Negative 0 0 0
Equivocal* 8 0 8
Positive 1 60 61
Total 9 60 69
Relative sensitivity: 69/69 100,0% [IC 95% = 94,8% - 100,0%]
* Equivocal results were considered as positive for calculation of sensitivity.
[IC95%] = 95% confidence interval.
The discrepant positive sample with Platelia Toxo IgM assay was confirmed
positive with an ISAGA method.
In addition, 57 samples from a panel of 19 seroconversions were tested. Among
these 19 seroconversions, 18 were detected in a comparable way and one
seroconversion presented a shift of one sample in favour of the reference method.
9.4 Cross Reactivity
A panel of 205 samples including 167 positive samples for CMV, Rubella, EBV,
HSV, VZV, mumps, measles and HIV and 38 positive samples for rheumatoid
factor, auto-antibodies and heterophile antibodies along with myeloma
samples were tested with Platelia Toxo IgM and a commercialized EIA assay
for screening of anti-T. gondii IgM antibodies.
Among theses samples, 2 were found positive and concordant with the EIA kit
used for comparison: 1 sample positive for anti-EBV and 1 sample positive for
anti-HSV 2 IgG.
9.5 Precision
• Within-run precision (repeatability):
In order to evaluate intra-assay repeatability, one negative and three positive
samples were tested 32 times during the same run. The ratio (Sample OD/CO)
was determined for each sample. Mean of ratio, Standard Deviation (SD) and
Coefficient of Variation (%CV) for each specimen are listed in the table below:
12

Within-run precision (repeatability)
N=32
Negative
Sample
Low Positive
sample
Positive
sample
High Positive
Sample
Ratio (Sample OD/CO)
Mean 0.05 1.92 3.23 4.49
SD 0 0.04 0.07 0.10
% CV 5.0% 2.1% 2.3% 2.3%
• Between-run precision (reproducibility) :
In order to evaluate inter-assay reproducibility, the four samples (one negative
and three positive) were tested in duplicate in two runs per day over a 20 days
period. The concentration (AU/ml) was determined for each positive sample.
Results for the negative sample are expressed in ratio. Mean of concentrations
and ratio, Standard Deviation (SD) and Coefficient of Variation (%CV) for each
of the four specimens are listed in the table below:
Between-run precision (reproducibility)
N=80
Negative
Sample
Low Positive
sample
Positive
sample
High Positive
Sample
Ratio (Sample OD/CO)
Mean 0.04 2.05 3.28 4.64
SD 0.01 0.06 0.10 0.14
% CV 21.0% 2.8% 3.1% 3.0%
10. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
Diagnosis of T. gondii infection can only be established on the basis of a
combination of clinical and biological data. The result of a single test of
titration of anti-T. gondii IgM antibodies does not constitute sufficient proof for
the diagnosis of a recent infection.
• Diagnosis of a recent infection can only be made with complete patient
information including clinical and biological data (significant increase of anti-
T. gondii IgG antibodies on 2 patient sera drawn at 3 weeks interval and
tested in the same run, presence of anti-T. gondii IgM at a significant level,
demonstration of low IgG avidity).
• Presence of anti-T. gondii IgM antibodies does not constitute a sufficient
proof to confirm a recent infection because IgM can persist several months
or even years after infection. When IgM are detected, a quantitative
determination of anti-T. gondii IgG antibodies should be performed, as well
as a follow-up of the evolution of anti-T. gondii antibodies on at least a
second serum sampled three weeks later.
13

• If a sample is tested too early during a recent primo-infection, anti-T. gondii
IgM antibodies could be not yet present. If a suspicion exists, a second
sample should be drawn about 3 weeks later on which IgM testing will be
performed again.
11. QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURER
All manufactured reagents are prepared according to our Quality System,
starting from reception of raw material to commercialization of the final
product. Each lot is submitted to quality control assessments and is released
to the market only after conforming to pre-defined acceptance criteria. The
records related to production and controls of each single lot are kept within
Bio-Rad.
12. REFERENCES
1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis.
Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443.
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D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER
J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal
markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315.
3. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G.,
WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii
infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for
infected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, 2900-2906.
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immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in
pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J.
Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913.
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Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by
determination of anti-Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin.
Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977.
6. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the
diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158.
7. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease
of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB
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SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in
patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the
specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting.
Immunol.Infect. Dis. 1993; 3, 63-69.
14

9. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE
D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation
of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies
to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115.
10. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS
1993; 7, 299-316.
15

PLATELIA TOXO IgM 72841
96 TESTS
DETECTION QUALITATIVE DES ANTICORPS IgM
ANTI-TOXOPLASMA GONDII DANS LE SERUM OU
LE PLASMA HUMAIN PAR METHODE
IMMUNOENZYMATIQUE

1. DOMAINE D’UTILISATION
Platelia Toxo IgM est un test immunoenzymatique de type immunocapture
pour la détection qualitative des anticorps IgM dirigés contre T. gondii dans le
sérum ou le plasma humain.
2. INTERET CLINIQUE
T. gondii est un protozoaire capable d’infecter de nombreuses espèces de
mammifères et d’oiseaux. Ces infections, courantes chez l’homme et les
animaux, se déroulent le plus souvent de façon inapparente sur le plan
clinique. La prévalence de cette infection dans la population, détectée par la
présence d’anticorps spécifiques dans le sérum, est variable en fonction de la
région et de l’âge.
Cette infection peut, dans le cas d’une primo-infection de la mère au cours de
la grossesse, être la cause de graves séquelles pour le foetus (en particulier
une altération des fonctions cérébrales) ou même d’avortement. Une immunité
même ancienne de la mère, démontrée par la présence d’anticorps IgG dès le
début de la grossesse, protège le fœtus de l’infection par ce parasite.
La deuxième population sensible à cette infection est représentée par les
patients immuno-déprimés, dont les malades atteints de SIDA. Ces infections
sont dues, presque exclusivement, à une infection à partir d’un foyer
parasitaire (kyste) quiescent du patient, préexistant à l’infection par le virus HIV.
Le diagnostic de certitude de l’infection toxoplasmique est apporté par la mise
en évidence du parasite, mais sa recherche par examen direct est difficile pour
ne pas dire aléatoire. La sérologie représente la base du diagnostic et du suivi
de la toxoplasmose. La mise en évidence d’anticorps spécifiques permet
d’affirmer une contamination par T. gondii ; l’étude combinée des anticorps
appartenant à différents isotypes permet généralement de dater l’infection et
d’orienter la thérapeutique en cas d’infection récente, ou de proposer des
mesures prophylactiques adaptées au risque de survenue d’une
toxoplasmose : mesures hygiéno-diététiques chez les femmes enceintes non
immunisées, chimioprophylaxie chez les sujets immunodéprimés séropositifs
pour T. gondii.
18

3. PRINCIPE
Platelia Toxo IgM est un test permettant la détection qualitative des
anticorps IgM anti-T. gondii dans le sérum ou le plasma humain par une
méthode immunoenzymatique avec immuno-capture des IgM sur phase
solide.
Des anticorps anti-chaîne µ humaines sont utilisés pour sensibiliser la
microplaque. Un mélange d’antigène T. gondii et d’anticorps monoclonal antiantigène
T. gondii marqué à la peroxydase est utilisé comme conjugué. La
mise en œuvre du test comprend les étapes suivantes :
• Etape 1
Les échantillons à étudier ainsi que le calibrateur et les contrôles sont dilués au
1/21 puis déposés dans les cupules de la microplaque. Durant cette
incubation de 1 heure à 37°C, les IgM présentes dans l’échantillon sont
captées par les anticorps anti-µ fixés sur les cupules de la microplaque. Les
IgG et les autres protéines sériques sont éliminées par les lavages pratiqués à
la fin de l’incubation.
• Etape 2
Le conjugué (mélange d’antigène T. gondii et d’anticorps monoclonal anti-
T. gondii marqué à la peroxydase) est déposé dans toutes les cupules de la
microplaque. Durant cette incubation de 1 heure à 37°C, si l’échantillon testé
contient des anticorps IgM spécifiques du T. gondii, ceux-ci vont fixer le
conjugué. Le conjugué en excès non lié est éliminé par les lavages pratiqués à
la fin de l’incubation.
• Etape 3
La présence des complexes immuns (anti-chaîne µ humaine / IgM anti-
T. gondii / Antigène T. gondii / Anticorps monoclonal anti-T. gondii marqué à la
peroxydase) éventuellement formés est révélée par l’addition dans chaque
cupule d’une solution de révélation enzymatique.
• Etape 4
Après incubation à température ambiante (+18-30°C), la réaction enzymatique
est stoppée par addition d’une solution d’acide sulfurique 1N. La densité
optique lue à 450/620 nm, interprétée par rapport à une valeur seuil, permet de
confirmer ou d’infirmer la présence d’IgM anti-T. gondii dans l’échantillon
testé.
19

4. COMPOSITION DE LA TROUSSE
Les réactifs sont fournis en quantité suffisante pour réaliser 96 déterminations.
Tous les réactifs sont destinés à l’usage exclusif du diagnostic in vitro.
Etiquetage Nature des réactifs Présentation
R1 Microplate Microplaque : (prêt à l’emploi) :
12 barrettes de 8 cupules à puits sécables
sensibilisées par des anticorps
anti-chaînes µ humaines
1
R2
R3
Concentrated
Washing
Solution (20x)
Negative
Control
Solution de lavage (20x) :
Tampon TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween ® 20.
Conservateur : < 1,5% ProClin 300
Contrôle Négatif :
Sérum humain négatif en IgM anti-T. gondii,
en antigène HBs et en anticorps anti-HIV1,
anti-HIV2 et anti-HCV
Conservateur : < 1,5% ProClin 300
R4 Calibrator Calibrateur :
Sérum humain réactif pour les IgM
anti-T. gondii, et négatif en antigène HBs et
en anticorps anti-HIV1, anti-HIV2 et anti-HCV
Conservateur : < 1,5% ProClin 300
R5
Positive
Control
Contrôle Positif :
Sérum humain réactif pour les IgM
anti-T. gondii, et négatif en antigène HBs et
en anticorps anti-HIV1, anti-HIV2 et anti-HCV
Conservateur : < 1,5% ProClin 300
R6a Antigen Antigène T. gondii :
Antigène T. gondii sous forme lyophilisée
R6b
Conjugate
(101x)
Conjugué (101 x) :
Anticorps monoclonal d’origine murine anti-
T. gondii (P30) couplé à la peroxydase
Conservateur : < 1,5% ProClin 300
R7 Diluent Diluant pour échantillons et conjugué :
(prêt à l’emploi) :
Tampon TRIS-NaCl (pH 7,7), sérum albumine
bovine, 0,1% Tween ® 20 et rouge de phénol.
Conservateur : < 1,5% ProClin 300
1 x 70 mL
1 x 0,75 mL
1 x 0,75 mL
1 x 0,75 mL
2 x qsp 14 mL
1 x 0,4 mL
1 x 80 mL
20

R9
Etiquetage Nature des réactifs Présentation
Chromogen Chromogène (prêt à l’emploi):
1 x 28 mL
TMB 3,3’,5,5’ tétraméthylbenzidine (< 0,1%),
H 2 O 2 (

• Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin des lavages et la
distribution des réactifs.
• Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solution
de révélation.
• La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ions métalliques.
Par conséquent, aucun élément métallique ne doit entrer en contact avec
les différentes solutions contenant le conjugué ou le chromogène.
• Le Chromogène (R9) doit être incolore. L’apparition d’une coloration bleue
indique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé.
• Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque échantillon.
• Vérifier l’exactitude des pipettes et le bon fonctionnement des appareils
utilisés.
CONSIGNES D’HYGIENE ET DE SECURITE
Les composants d’origine humaine utilisés dans la préparation des réactifs
ont été testés et trouvés non réactifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B
(Ag HBs), les anticorps dirigés contre le virus de l’hépatite C (anti-VHC) et les
anticorps dirigés contre les virus de l’immunodéficience humaine (anti-VIH1 et
anti-VIH2). Du fait qu’aucune méthode ne peut garantir de façon absolue
l'absence d’agents infectieux, considérer les réactifs d’origine humaine ainsi
que tous les échantillons de patients comme potentiellement infectieux et les
manipuler avec les précautions d'usage :
• Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons et les
réactifs d’origine humaine ainsi que les solutions de lavage comme des
produits contaminés.
• Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs et des
échantillons.
• Ne pas pipeter à la bouche.
• Eviter les éclaboussures d’échantillons ou de solutions les contenant.
Nettoyer les surfaces souillées avec de l’eau de javel diluée à 10 %. Si le
liquide contaminant est un acide, neutraliser au préalable les surfaces
souillées avec du bicarbonate de soude, puis nettoyer à l’aide d’eau de javel
et sécher avec du papier absorbant. Le matériel utilisé pour le nettoyage
devra être jeté dans un conteneur spécial pour déchets contaminés.
• Eliminer les échantillons, les réactifs d’origine humaine ainsi que le matériel
et les produits contaminés après décontamination :
- soit par immersion dans de l’eau de javel à la concentration finale de 5 %
d’hypochlorite de sodium pendant 30 minutes.
- soit par autoclavage à 121°C pendant 2 heures minimum.
ATTENTION : ne pas introduire dans l’autoclave des solutions
contenant de l’hypochlorite de sodium
22

• Eviter tout contact des réactifs, y compris ceux considérés comme non
dangereux, avec la peau et les muqueuses.
• La manipulation et l’élimination des déchets chimiques et biologiques
doivent être faites selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire.
• Tous les réactifs de la trousse sont destinés au seul usage diagnostic in
vitro.
Attention : certains réactifs contiennent du ProClin 300 < 1,5%
R43 : Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau
S28-37 : Après contact avec la peau, se laver immédiatement et
Xi - Irritant abondamment avec de l’eau et du savon. Porter des gants appropriés
6. ECHANTILLONS
1. Les tests sont effectués sur des échantillons de sérum ou de plasma
recueilli sur anticoagulant de type EDTA, héparine ou citrate.
2. Respecter les consignes suivantes pour le prélèvement, le traitement et la
conservation de ces échantillons de sang :
• Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage.
• Pour les sérums, laisser le caillot se former complètement avant
centrifugation.
• Conserver les tubes fermés.
• Après centrifugation, extraire le sérum ou le plasma et le conserver en
tube fermé.
• Les échantillons seront conservés à +2-8°C si le test est effectué dans
les 7 jours.
• Si le test n’est pas effectué dans les 7 jours, ou pour tout envoi, les
échantillons seront congelés à -20°C (ou plus froid).
• Il est recommandé de ne pas procéder à plus de 3 cycles de congélation/
décongélation. Les échantillons devront être soigneusement
homogénéisés (Vortex) après décongélation et avant la réalisation du test.
3. Les résultats ne sont pas affectés par les échantillons contenant 90 g/l
d’albumine ou 100 mg/l de bilirubine non conjuguée, les échantillons
lipémiques contenant l’équivalent de 36 g/l de trioléïne (triglycéride) ou les
échantillons hémolysés contenant 10 g/l d’hémoglobine.
4. Ne pas chauffer les échantillons.
7. MODE OPÉRATOIRE
7.1 Matériel nécessaire non fourni
• Agitateur type Vortex.
• Appareil de lecture pour microplaques équipé de filtres 450/620 nm (*).
• Incubateur de microplaques pouvant être thermostaté à 37°C ± 1°C (*).
23

• Système de lavage automatique, semi-automatique ou manuel pour
microplaques (*).
• Eau distillée ou désionisée stérile.
• Gants à usage unique.
• Lunettes de protection.
• Papier absorbant.
• Pipettes ou multipipettes, automatiques ou semi- automatiques, réglables
ou fixes, pouvant mesurer et délivrer 10 µL à 1000 µL, 1 mL, 2 mL et 10 mL.
• Eprouvettes graduées de 25 mL, 50 mL, 100 mL et 1000 mL.
• Hypochlorite de sodium (eau de javel) et bicarbonate de sodium.
• Conteneur de déchets contaminés.
• Tubes à usage unique
(*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareils
validés par nos services techniques.
7.2 Reconstitution des réactifs
• R1 : Laisser revenir 30 minutes à température ambiante (+18-30°C) avant
ouverture du sachet. Sortir le cadre et replacer immédiatement les barrettes
non utilisées dans le sachet en vérifiant la présence du dessicant. Refermer
soigneusement le sachet et le replacer à +2-8°C.
• R2 : Diluer au 1/20 la solution R2 avec de l’eau distillée : 50 mL de R2 dans
950 mL d’eau distillée. On obtient ainsi la solution prête à l’emploi. Prévoir
350 mL de solution de lavage diluée pour une plaque entière de 12 barrettes
en lavage manuel.
• R3, R4, R5 : Diluer au 1/21 dans le Diluant R7 (exemple : 300 µL de R7
+ 15 µL de Calibrateur ou Contrôle).
• R6a : L’antigène T. gondii est présenté sous forme lyophilisée. Pour la
réalisation de 6 barrettes, reprendre le contenu d’un flacon par 14 mL de
Diluant (R7). Bien homogénéiser. Une fois diluée, la solution antigénique
(R6a+R7) doit être parfaitement limpide.
• R6 (R6a+R6b) – Solution de travail du conjugué : Ajouter 140 µL de
conjugué (R6b) dans chaque flacon d’antigène T. gondii reconstitué (R6a
dilué). Bien homogénéiser. La solution de travail du conjugué doit être
reconstituée au moins 1 heure avant emploi.
7.3 Conservation et validité des réactifs ouverts et/ou reconstitués
La trousse doit être conservée à +2-8°C. Chaque élément de la trousse
conservée avant ouverture à +2-8°C peut être utilisé jusqu’à la date de
péremption indiquée sur le coffret.
• R1: Après ouverture, les barrettes conservées dans le sachet correctement
refermé sont stables pendant 8 semaines à +2-8°C (vérifier la présence du
dessicant).
24

• R2: Après dilution, la Solution de Lavage se conserve 2 semaines à
+2-30°C. Après ouverture et en l’absence de contamination, la Solution de
Lavage concentrée peut être conservée à +2-30°C jusqu’à la date indiquée
sur l’étiquette.
• R3, R4, R5, R6b, R7 : Après ouverture et en l’absence de contamination,
les réactifs conservés à +2-8°C sont stables pendant 8 semaines.
• R6 (R6a+R6b) : Après reconstitution, la solution de travail du conjugué est
stable 8 heures à température ambiante (+18-30°C) et pendant 2 semaines
à +2-8°C.
• R9 : Après ouverture et en l’absence de contamination, le réactif conservé à
+2-8°C est stable pendant 8 semaines.
• R10 : Après ouverture et en l’absence de contamination, le réactif conservé
à +2-8°C est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.
7.4 Mode opératoire
Suivre strictement le protocole proposé et appliquer les Bonnes Pratiques de
Laboratoire.
Avant utilisation, laisser tous les réactifs revenir à température ambiante
(+18-30°C).
L’utilisation de puits sécables requiert une attention particulière lors de la
manipulation.
Utiliser le calibrateur et les contrôles à chaque mise en œuvre du dosage pour
valider la qualité du test.
1. Etablir soigneusement le plan de distribution et d’identification du
calibrateur, des contrôles et des échantillons de patients.
2. Préparer la Solution de Lavage diluée (R2) [Se référer au chapitre 7.2].
3. Sortir le cadre support et les barrettes (R1) de l’emballage protecteur
[Se référer au chapitre 7.2].
4. Préparer la solution de travail du conjugué R6 (R6a+R6b) [Se référer au
chapitre 7.2].
5. Dans des tubes identifiés individuellement, diluer le calibrateur (R4) et les
contrôles (R3, R5) ainsi que les échantillons de patient à tester (S1, S2…) au
1/21 dans le Diluant (R7), soit 300 µL de Diluant (R7) puis 15 µL
d’échantillon [Se référer au Chapitre 7.2]. Bien homogénéiser (Vortex).
6. Distribuer dans chaque cupule 200 µL du calibrateur, des contrôles et des
échantillons dilués selon le schéma suivant :
25

26
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R3 S5 S13
B R4 S6
C R4 S7
D R5 S8
E S1 S9
F S2 S10
G S3 S11
H S4 S12
7. Couvrir la microplaque d’un film adhésif en appuyant bien sur toute la
surface pour assurer l’étanchéité. Puis incuber immédiatement la
microplaque au bain-marie thermostaté ou dans un incubateur sec de
microplaques pendant 1 heure ± 5 minutes à 37°C ± 1°C.
8. A la fin de la première incubation, retirer le film adhésif, aspirer le contenu de
toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés (contenant
de l’hypochlorite de sodium) et procéder à 4 lavages avec 350 µL de la
Solution de Lavage (R2). Sécher les barrettes par retournement sur une
feuille de papier absorbant et taper légèrement afin d’éliminer la totalité de
la Solution de Lavage.
9. Distribuer immédiatement 200 µL de la solution de travail du conjugué (R6)
dans toutes les cupules. Agiter délicatement cette solution avant l’emploi.
10. Couvrir la microplaque d’un film adhésif neuf en appuyant bien sur toute la
surface pour assurer l’étanchéité. Incuber la microplaque au bain-marie
thermostaté ou dans un incubateur sec de microplaques pendant 1 heure
± 5 minutes à 37°C ± 1°C.
11. A la fin de la deuxième incubation, retirer le film adhésif, aspirer le contenu
de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés
(contenant de l’hypochlorite de sodium) et procéder à 4 lavages avec
350 µL de la Solution de Lavage (R2). Sécher les barrettes par retournement
sur une feuille de papier absorbant et taper légèrement afin d’éliminer la
totalité de la Solution de Lavage.
12. Distribuer rapidement, et à l'abri de la lumière vive, 200 µL du Chromogène
(R9) dans toutes les cupules. Laisser la réaction se développer à
l’obscurité pendant 30 ± 5 minutes à température ambiante (+18-30°C).
Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif.
13. Arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 100 µL de la Solution d’Arrêt
(R10) dans chaque cupule. Adopter la même séquence et le même rythme
de distribution que pour la solution de révélation.
14. Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Lire la densité optique à
450/620 nm à l’aide d’un lecteur de plaques dans les 30 minutes qui suivent
l’arrêt de la réaction. Les barrettes doivent toujours être conservées à l’abri
de la lumière avant la lecture.

15. S'assurer, avant la transcription des résultats, de la concordance entre la
lecture et le plan de distribution des plaques et des échantillons.
8. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
8.1 Calcul de la Valeur Seuil (VS)
La valeur Seuil VS correspond à la moyenne des densités optiques (DO) des
duplicats du Calibrateur (R4) :
VS = moyenne DO R4
8.2 Calcul du Ratio Echantillon
Les résultats pour un échantillon donné sont exprimés sous forme d’un ratio à
l’aide de la formule suivante :
Ratio Echantillon = DO échantillon/VS
8.3 Validation de l’essai
Analyser les résultats de DO obtenus avec le Calibrateur et les Contrôles sur
chaque microplaque et pour chaque série. Pour valider la manipulation, les
critères suivants doivent être respectés :
• Valeurs des densités optiques :
VS ≥ 0,300
0,80 x VS < DO R4 Repl.1 < 1,20 x VS
0,80 x VS < DO R4 Repl.2 < 1,20 x VS
(La DO individuelle de chacun des duplicats du Calibrateur R4 ne doit pas
s’écarter de plus de 20% de la Valeur Seuil)
• Rapports des densités optiques :
Ratio R3 (DO R3 / VS) ≤ 0,30
Ratio R5 (DO R5 / VS) ≥ 1,80
Si ces critères ne sont pas respectés, recommencer la manipulation.
8.4 Interprétation des résultats
Ratio échantillon Résultat Interprétation
Ratio < 0,80 Négatif L’échantillon est considéré négatif pour la présence
d’anticorps IgM anti-T. gondii.
0,80 ≤ Ratio < 1,00 Douteux L’échantillon est considéré douteux pour la
présence d’anticorps IgM anti-T. gondii. Le résultat
doit être confirmé par un nouveau test réalisé sur un
nouvel échantillon prélevé au minimum 3 semaines
après la date du 1er examen.
Ratio ≥ 1,00 Positif L’échantillon est considéré positif pour la présence
d’anticorps IgM anti-T. gondii.
27

8.5 Expertise des causes d’erreur
L’origine des réactions non validées ou non reproductibles est souvent en
relation avec les causes suivantes :
• Lavage insuffisant des microplaques.
• Contamination des échantillons négatifs par un sérum ou un plasma
contenant un titre élevé d’anticorps.
• Contamination ponctuelle de la solution de révélation par des agents
chimiques oxydants (eau de javel, ions métalliques...).
• Contamination ponctuelle de la Solution d’Arrêt.
9. PERFORMANCES
Les performances du kit Platelia Toxo IgM ont été évaluées sur 2 sites sur un
total de 863 échantillons provenant de femmes enceintes et de donneurs de
sang.
9.1 Prévalence
La prévalence des IgM anti-Toxo mesurée à l’aide du test Platelia Toxo IgM
a été estimée sur un panel de 500 échantillons provenant de femmes
enceintes. 15 échantillons se sont révélés positifs pour la présence d’anticorps
anti-Toxo IgM. La prévalence mesurée à l’aide du kit Platelia Toxo IgM
s’établit donc à 3% (15/500).
9.2 Spécificité
La spécificité a été déterminée sur un panel de 737 échantillons trouvés
négatifs à l'aide du Platelia Toxo IgM TMB (72751), provenant de 2 sites
situés en France et se répartissant comme suit :
• 154 sérums issus de donneurs de sang
• 583 sérums issus de femmes enceintes
28
Population testée
/ site
Site 1
Site 2
Femmes
enceintes
Donneurs
de sang
Femmes
enceintes
Nombre
d’échantillons
Négatif Douteux* Positif Spécificité
102 102 0 0
154 154 0 0
481 480 1 0
100,0%
(102/102)
[97,1%-100%]
100,0%
(154/154)
[98,1%-100%]
99,8%
(480/481)
[99,8%-99,9%]
99,9%
Total 737 736 1 0 (736/737)
[99,25%-100%]
* les échantillons douteux ont été considérés comme positifs pour le calcul de spécificité
[IC 95%] = intervalle de confiance à 95%.

9.3 Sensibilité
La sensibilité a été déterminée sur un panel de 69 échantillons trouvés positifs
à l'aide du Platelia Toxo IgM TMB (72751), provenant de 2 sites situés en
France et se répartissant comme suit :
• 4 sérums issus de donneurs de sang
• 65 sérums issus de femmes enceintes
Platelia
Toxo IgM
(72841)
Platelia Toxo IgM TMB (72751)
Douteux* Positif Total
Négatif 0 0 0
Douteux* 8 0 8
Positif 1 60 61
Total 9 60 69
Sensibilité relative *: 69/69 100,0% [IC 95% = 94,8% - 100,0%]
* Les échantillons douteux ont été considérés comme positifs pour le calcul de la sensibilité
[IC95%] = Intervalle de confiance à 95%
L’échantillon positif discordant avec la trousse Platelia Toxo IgM a été
confirmé positif par méthode ISAGA.
De plus, 57 échantillons provenant d'un panel de 19 séroconversions ont été
testés. Sur ces 19 séroconversions, 18 ont été détectées de manière
comparable et une séroconversion a présenté un décalage d’un prélèvement
en faveur de la méthode de référence.
9.4 Réactivité croisée
Un panel de 205 échantillons comprenant 167 échantillons positifs pour les
marqueurs CMV, Rubéole, EBV, HSV, VZV, oreillons, rougeole, HIV et
38 échantillons positifs en facteurs rhumatoïdes, auto-anticorps, anticorps
hétérophiles ainsi que des échantillons de myélome ont été testés avec le test
Platelia Toxo IgM et un test EIA commercialisé pour le dépistage des
anticorps IgM anti-T. gondii.
Parmi ces échantillons, 2 se sont révélés positifs concordants avec la trousse
EIA utilisée en référence : 1 échantillon positif en IgM anti-EBV et 1 échantillon
positif en IgG anti-HSV 2.
9.5 Précision
• Précision intra-essai (répétabilité) :
Afin d'évaluer la répétabilité intra-essai, un échantillon négatif et trois
échantillons positifs ont été testés à 32 reprises dans une même série. Le ratio
(DO Echantillon/VS) a été déterminé pour chaque échantillon. La moyenne des
ratios, la déviation standard (DS) et le coefficient de variation (%CV) pour
chaque échantillon sont donnés dans le tableau suivant.
29

Précision intra-essai (répétabilité)
N=32
• Précision inter-essai (reproductibilité) :
Afin d'évaluer la reproductibilité inter-essai, les quatre échantillons (un négatif
et trois positifs) ont chacun été testés en duplicat, dans deux séries par jour,
sur une période totale de 20 jours. Le ratio (DO Echantillon/VS) été déterminé
pour chaque échantillon. La moyenne des ratios, la déviation standard (DS) et
le coefficient de variation (%CV) pour chaque échantillon sont donnés dans le
tableau suivant.
Précision inter-essai (reproductibilité)
N=80
Echantillon
Négatif
Echantillon
négatif
Echantillon
positif faible
Echantillon
positif faible
Echantillon
positif
Echantillon
positif
Echantillon
positif fort
Ratio (DO Echantillon / Valeur Seuil)
Moyenne 0,05 1,92 3,23 4,49
DS 0 0,04 0,07 0,10
% CV 5,0% 2,1% 2,3% 2,3%
Echantillon
positif fort
Ratio (DO Echantillon / Valeur Seuil)
Moyenne 0,04 2,05 3,28 4,64
DS 0,01 0,06 0,10 0,14
% CV 21,0% 2,8% 3,1% 3,0%
10. LIMITES D’UTILISATION
Le diagnostic d’infection par T. gondii ne peut être définitivement établi que sur
un ensemble de données cliniques et biologiques. Le résultat d’un seul test de
détection des anticorps IgM anti-T. gondii ne constitue pas en soi une preuve
suffisante pour poser le diagnostic d’infection récente par T. gondii.
• Seul un ensemble de données cliniques et biologiques (augmentation
significative du titre des IgG anti-T. gondii entre 2 sérums issus d’un même
patient prélevés à 3 semaines d’intervalle et testés au cours d’un seul
dosage, présence d’IgM anti-T. gondii à un taux significatif et mise en
évidence d’une avidité faible des IgG) permet le diagnostic d’une infection
récente par le parasite.
• La seule présence d’IgM anti-T. gondii ne permet pas de conclure à une
infection récente évolutive en raison d’une possible persistance des IgM
plusieurs mois, voire plusieurs années, après l’infection. Lorsque des IgM
sont détectés, une détermination quantitative du titre en anticorps IgG anti-
T. gondii devra être réalisée, de même qu’un suivi de l’évolution de la
réponse en anticorps anti-T. gondii du patient sur au moins un deuxième
prélèvement réalisé 3 semaines plus tard.
30

• Si le prélèvement est effectué trop précocement lors d’une primo-infection
débutante, les anticorps IgM anti-T. gondii peuvent ne pas être encore
présents. En cas de doute, un second prélèvement doit être effectué
3 semaines plus tard sur lequel la recherche des IgM sera répétée.
11. CONTROLE QUALITE DU FABRICANT
Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont
placés sous un système d’assurance qualité de la réception des matières
premières jusqu’à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de
produit fini fait l’objet d’un contrôle de qualité et n’est commercialisé que s’il
est conforme aux critères d’acceptation. La documentation relative à la
production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.
12. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Voir version anglaise.
31

PLATELIA TOXO IgM 72841
96 PRUEBAS
DETECCIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS IgM
ANTI-TOXOPLASMA GONDII, EN SUERO O PLASMA
HUMANO, POR MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO

1. CAMPO DE APLICACIÓN
Platelia Toxo IgM es una prueba inmunoenzimática por inmunocaptura para
la detección cualitativa de anticuerpos IgM dirigidos contra T. gondii en suero
o plasma humano.
2. INTERÉS CLÍNICO
T. gondii es un protozoario capaz de infectar a numerosas especies de
mamíferos y pájaros. Estas infecciones, habituales en el hombre y en los
animales, se desarrollan generalmente de forma inapreciable desde el punto
de vista clínico. La prevalencia de esta infección en la población, detectada
por la presencia de anticuerpos específicos en el suero, varía en función de la
región y de la edad.
En caso de una primoinfección de la madre durante el embarazo, esta
infección puede provocar graves secuelas en el feto (en especial, una
alteración de las funciones cerebrales) o un aborto. La inmunidad antigua de la
madre, demostrada mediante la presencia de anticuerpos IgG al inicio del
embarazo, protege al feto de la infección por este parásito.
La segunda población sensible a esta infección está representada por
lospacientes inmunodeprimidos, como los enfermos afectados de SIDA. Estas
infecciones se deben, casi exclusivamente, a una infección a partir de un foco
parasitario (quiste) quiescente del paciente, cuya existencia es previa a la
infección por el virus HIV.
El diagnóstico de la infección toxoplásmica se confirma con la demostración
de la presencia del parásito, pero su búsqueda mediante el examen directo es
difícil, por no decir aleatorio. La serología representa la base del diagnóstico y
del seguimiento de la toxoplasmosis. La presencia de anticuerpos específicos
permite confirmar una contaminación por T. gondii; el estudio combinado de
los anticuerpos pertenecientes a diferentes isotipos permite, generalmente,
fechar la infección y orientar la terapéutica en caso de infección reciente, o
establecer medidas profilácticas adecuadas al riesgo de aparición de una
toxoplasmosis: medidas higiénico-dietéticas en mujeres embarazadas que no
presenten anticuerpos, quimiofilaxia en los sujetos inmunodeprimidos
seropositivos para T. gondii.
34

3. PRINCIPIO
Platelia Toxo IgM es una prueba que permite la detección cualitativa de los
anticuerpos IgM anti-T. gondii en suero o plasma humano mediante un
método inmunoenzimático por inmunocaptura de las IgM en fase sólida.
Se utilizan anticuerpos anti-cadena µ humana para sensibilizar la microplaca.
Se utiliza como conjugado una mezcla de antígeno T. gondii y anticuerpo
monoclonal anti-antígeno T. gondii marcado con peroxidasa. La aplicación de
la prueba consta de las etapas siguientes:
• Etapa 1
Las muestras a estudiar y los controles se diluyen en proporción 1/21 y se
depositan en los pocillos de la microplaca. Durante la incubación de 1 hora a
37ºC, las IgM son captadas por los anticuerpos anti-µ fijados a las cúpulas de
los pocillos de la microplaca. Las IgG y el resto de las proteínas séricas son
eliminadas mediante lavados al final de la incubación.
• Etapa 2
Se coloca el conjugado (mezcla de antígeno T. gondii y de anticuerpo anti-
T. gondii marcado con la peroxidasa) en todos los pocillos de la microplaca.
Durante esta incubación de 1 hora a 37°C, si la muestra probada contiene
anticuerpos IgM específicos de T. gondii, éstos se fijarán al conjugado. El
conjugado sobrante que no se une es eliminado mediante lavados al final de la
incubación.
• Etapa 3
La presencia de los complejos inmunes (anti-cadena µ humana / IgM anti-
T. gondii / Antígeno T. gondii / Anticuerpo monoclonal anti-T. gondii marcado
con peroxidasa) que se forman eventualmente es revelada mediante la adición
de una solución enzimática de revelado en cada pocillo.
• Etapa 4
Tras incubación a temperatura ambiente (+18-30ºC) la reacción enzimática se
detiene mediante la adición de una solución de ácido sulfúrico 1N. La
densidad óptica leída a 450/620 nm, interpretada en relación con un valor
umbral, permite confirmar o informar de la presencia de IgM anti-T. gondii en
la muestra probada.
35

4. COMPOSICIÓN DEL KIT
Los reactivos son suministrados en cantidad suficiente para realizar 96
determinaciones. Todos los reactivos están destinados para utilizarse
únicamente en el diagnóstico in vitro.
Etiquetado Naturaleza de los reactivos Presentación
R1 Microplate Microplaca : (lista para usar) :
12 tiras de 8 pocillos separables, sensibilizadas
con anticuerpos anti-cadenas µ humanas
1
R2
R3
Concentrated
Washing
Solution (20x)
Negative
Control
Solución de lavado (20x) :
Tampón TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween ® 20.
Conservante: < 1,5% ProClin 300
Control Negativo :
Suero humano negativo a IgM anti-T. gondii,
a antígeno HBs y a anticuerpos anti-VIH1,
anti-VIH2 y anti-VHC
Conservante: < 1,5% ProClin 300
R4 Calibrator Calibrador :
Suero humano reactivo a las IgM anti-T. gondii,
y negativo al antígeno HBs y a anticuerpos
anti-VIH1, anti-VIH2 y anti-VHC
Conservante:

Etiquetado Naturaleza de los reactivos Presentación
R9 Chromogen
TMB
Cromógeno (listo para usar):
3,3’,5,5’ tetrametilbencidina (< 0,1%),
H 2 O 2 (

las microplacas se rellenan perfectamente y luego se vacían por completo.
Un mal lavado puede provocar resultados incorrectos.
• No dejar secar la microplaca entre el final de los lavados y la distribución de
los reactivos.
• No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la
solución reveladora.
• La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones
metálicos. Por consiguiente, ningún elemento metálico debe entrar en
contacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o el
cromógeno.
• El cromógeno (R9) debe ser incoloro. La aparición de un color azul indica
que el reactivo no es utilizable y debe reemplazarse.
• Utilizar un cono de distribución nuevo para cada muestra.
• Comprobar la exactitud de las pipetas y el correcto funcionamiento de los
aparatos utilizados.
INSTRUCCIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD
Los componentes de origen humano que se utilizan en la preparación de los
reactivos se han sometido a tests y han resultado no reactivos para el
antígeno de superficie de la hepatitis B (Ag HBs), los anticuerpos dirigidos
contra el virus de la hepatitis C (anti-VHC) y los anticuerpos dirigidos contra
los virus de la inmunodeficiencia humana (anti-VIH1 y anti-VIH2). Dado que
ningún método es capaz de garantizar de manera absoluta la ausencia de
agentes infecciosos, ha que considerar los reactivos de origen humano y las
muestras de los pacientes como potencialmente infecciosos y manipularlos
con las precauciones habituales:
• Considerar el material que está directamente en contacto con las muestras
y los reactivos de origen humano así como las soluciones de lavado, como
productos contaminados.
• Utilizar guantes de un solo uso para manipular reactivos y muestras.
• No pipetear con la boca.
• Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan.
Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido
contaminante es un ácido, neutralizar previamente con bicarbonato sódico
las superficies manchadas y a continuación limpiar con lejía y secar con
papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá desecharse
en un contenedor especial para desechos contaminados.
• Eliminar las muestras, los reactivos de origen humano y el material y los
productos contaminados después de su descontaminación:
- ya sea mediante inmersión en lejía a una concentración final de 5% de
hipoclorito de sodio durante 30 minutos.
- o bien mediante autoclave a 121ºC durante al menos 2 horas.
38

CUIDADO: no introducir en el autoclave soluciones que contengan
hipoclorito de sodio
• Evitar todo contacto de los reactivos, incluidos los considerados como no
peligrosos, con la piel y las mucosas.
• La manipulación y la eliminación de desechos químicos y biológicos deben
hacerse siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio.
• Todos los reactivos del kit están destinados a un solo uso diagnóstico in vitro.
Cuidado: ciertos reactivos contienen ProClin 300 < 1,5%
R43: Puede provocar una sensibilización por contacto con la piel.
S28-37: Después del contacto con la piel, lavarse de inmediato y
Xi - Irritante abundantemente con agua y jabón. Utilizar guantes adecuados.
6. MUESTRAS
1. Las pruebas se realizan sobre muestras de suero o de plasma recogido
sobre anticoagulante de tipo EDTA, heparina o citrato.
2. Respetar las instrucciones siguientes para la extracción, el tratamiento y la
conservación de las muestras de sangre:
• Extraer una muestra de sangre siguiendo las prácticas en uso.
• Para los sueros, dejar que se forme el coágulo totalmente antes de
centrifugar.
• Conservar los tubos cerrados.
• Después de la centrifugación, extraer el suero o el plasma y conservarlo
en tubo cerrado.
• Si la prueba se realiza en el plazo de 7 días, las muestras se conservarán
a +2-8°C.
• Si la prueba no se realiza en el plazo de 7 días, o para cualquier envío, las
muestras se congelarán a -20°C (o más frío).
• Se recomienda no proceder a más de 3 ciclos de congelación/
descongelación. Las muestras deberán homogeneizarse minuciosamente
(vórtex) después de descongelar y antes de realizar la prueba.
3. Los resultados no se ven afectados por muestras que contengan 90 g/l de
albúmina o 100 mg/l de bilirrubina no conjugada, las muestras lipémicas
que contengan el equivalente de 36 g/l de trioleína (triglicérido) o muestras
hemolizadas que contengan 10 g/l de hemoglobina.
4. No calentar las muestras.
7. MODO DE ACTUACIÓN
7.1 Material necesario no suministrado
• Agitador tipo vórtex.
• Lector de microplacas equipado con filtros 450/620 nm (*).
• Incubador de microplacas que admite termostato a 37°C ± 1°C (*).
39

40
• Sistema de lavado automático, semiautomático o manual para microplacas (*).
• Agua destilada o desionizada estéril.
• Guantes de un solo uso.
• Gafas de protección.
• Papel absorbente.
• Pipetas o multipipetas, automáticas o semiautomáticas, ajustables o fijas,
que pueden medir de 10 µL a 1.000 µL, y 1 mL, 2 mL y 10 mL.
• Probetas graduadas de 25 mL, 50 mL, 100 mL y 1.000 mL.
• Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio.
• Contenedor de desechos contaminados.
• Tubos de un solo uso.
(*) Para obtener una información más detallada sobre los aparatos validados
por nuestros servicios técnicos, consúltennos.
7.2 Reconstitución de los reactivos
• R1: Esperar a que adquiera la temperatura ambiente (+18-30°C) antes de
abrir la bolsa. Sacar el soporte y volver a poner inmediatamente en la bolsa
las tiras no utilizadas, comprobando que esté presente el secante. Volver a
cerrar minuciosamente la bolsa y poner de nuevo a +2-8°C.
• R2: Diluir a 1/20 la solución R2 con agua destilada: 50 mL de R2 en 950 mL
de agua destilada. Se obtiene de este modo la solución lista para usar.
Tener previstos 350 mL de solución de lavado diluida para una placa entera
de 12 tiras en modo de lavado manual.
• R3, R4, R5 : : Diluir a 1/21 en el diluyente (R7) (ejemplo: 15 µL R3
+ 300 µL R7).
• R6a : : El antígeno de T. gondii está liofilizado. Para analizar 6 tiras,
reconstituir un vial de antígeno liofilizado añadiéndole 14 mL de diluyente
(R7). Mezclar bien. Una vez diluida, la solución antigénica (R6a+R7) debe
quedar completamente transparente.
• R6 (R6a+R6b) : – Solución activa de conjugado: Añadir 140 µL de
conjugado (R6b) en cada vial de antígeno de T. gondii reconstituido (R6a
diluido). Mezclar bien. La solución activa de conjugado debe reconstituirse
al menos 1 hora antes de usarla.
7.3 Conservación y validez de los reactivos abiertos y/o reconstituidos
El kit debe conservarse a +2-8°C. Cada elemento del kit conservado a +2-8°C
antes de la apertura puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en
el envase.
• R1: Después de abrir, las tiras conservadas correctamente de nuevo en la
bolsa cerrada permanecen estables durante 8 semanas a +2-8°C
(comprobar que esté presente el secante).
• R2: Después de la dilución, la solución de lavado se conserva 2 semanas a
+2-30°C. Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, la
solución de lavado concentrada puede conservarse a +2-30°C hasta la
fecha indicada en la etiqueta.

• R3, R4, R5, R6b, R7: Después de abrir y si no hay presencia de
contaminación, los reactivos conservados a +2-8°C son estables durante
8 semanas.
• R6 (R6a+R6b): Después de reconstruir, la solución de trabajo del
conjugado es estable 8 horas a temperatura ambiente (+18-30°C) y
2 semanas a +2-8°C.
• R9: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivo
conservado a +2-8°C es estable durante 8 semanas.
• R10: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivo
conservado a +2-8°C es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta.
7.4 Modo de actuación
Seguir al pie de la letra el protocolo propuesto y aplicar las Buenas Prácticas
de Laboratorio.
Antes de usar, esperar a que todos los reactivos se pongan a temperatura
ambiente (+18-30°C).
El uso de pocillos frágiles requiere especial cuidado durante la manipulación.
Utilizar el calibrador y los sueros de controles en cada dosificación para validar
la calidad de la prueba.
1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución y de identificación del
calibrador, de los sueros de control y de las muestras de pacientes.
2. Preparar la solución de lavado diluida (R2) [Consultar el Capítulo 7.2].
3. Sacar el soporte y las tiras (R1) del envase protector [Consultar el
Capítulo 7.2]
4. Preparar la solución de conjugado R6 (R6a+R6b) [Consultar el Capítulo 7.2].
5. Disolver el calibrador (R4), los sueros de control (R3, R5) y las muestras de
pacientes a someter a prueba (S1, S2, etc.) a 1/21 en el diluyente (R7), es
decir 15 µL de muestra y 300 µL de diluyente (R7) [Consultar el Capítulo 7.2].
Homogeneizar correctamente (vórtex).
6. Distribuir en cada pocillo 200 µL del calibrador, de los sueros de control y
de las muestras diluidas según el esquema siguiente:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R3 S5 S13
B R4 S6
C R4 S7
D R5 S8
E S1 S9
F S2 S10
G S3 S11
H S4 S12
41

7. Cubrir la microplaca con una película adhesiva apoyando bien sobre toda la
superficie para garantizar la estanqueidad, a continuación incubar
inmediatamente la microplaca al baño maría con termostato o en una
incubadora seca de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37°C ± 1°C.
8. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar el contenido
de todos los pocillos en un contenido para desechos contaminados (que
contienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavados con 350 µl de la
solución de lavado (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papel
absorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la solución
de lavado.
9. Distribuir 200 µL de la solución de trabajo del conjugado (R6) en todos los
pocillos. Agitar delicadamente esta solución antes de usarla.
10. Tapar la microplaca de un film adhesivo apoyando bien sobre toda la
superficie para garantizar la estanqueidad. Incubar la microplaca al baño
maría con termostato o en una incubadora seca de microplacas durante
1 hora ± 5 minutos a 37°C ± 1°C.
11. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar el contenido
de todos los pocillos en un contenido para desechos contaminados (que
contienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavados con 350 µL de la
solución de lavado (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papel
absorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la solución
de lavado.
12. Distribuir rápidamente, y al abrigo de la luz viva, 200 µL del cromógeno
(R9) en todas las cúpulas. Dejar la reacción desarrollarse en la oscuridad
durante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente (+18-30°C). Durante esta
incubación, no utilizar el film adhesivo.
13. Detener la reacción enzimática añadiendo 100 µL de la solución de parada
(R10) en cada pocillo. Adoptar la misma secuencia y el mismo ritmo de
distribución que para la solución de revelado.
14. Secar minuciosamente la parte de abajo de las placas. Leer la densidad
óptica a 450/620 nm con ayuda de un lector de placas en los 30 minutos
que siguen a la parada de la reacción. Las tiras deben conservarse siempre
al abrigo de la luz antes de la lectura.
15. Asegurarse, antes de la transcripción de los resultados, de la concordancia
entre la lectura y el plan de distribución de las placas y de las muestras.
8. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
8.1 Cálculo del valor umbral (VU)
El valor umbral VU corresponde a la media de las densidades ópticas (DO) de
los duplicados del Calibrador (R4):
VU = media DO R4
42

8.2 Cálculo de la Ratio de la Muestra
Los resultados para una muestra dada se expresan bajo forma de una ratio
con ayuda de la fórmula siguiente:
Ratio Muestra = DO muestra/VU
8.3 Control de calidad
Analizar los resultados de DO obtenidos con el calibrador, los sueros de
control en cada microplaca y para cada serie. Para validar la manipulación,
hay que respetar los criterios siguientes:
• Valores de las densidades ópticas:
VU ≥ 0,300
0,80 x VU < DO R4 Repl.1 < 1,20 x VU
0,80 x VU < DO R4 Repl.2 < 1,20 x VU
(La DO individual de cada uno de los duplicados del Calibrador R4 no debe
separarse más de 20% del valor umbral)
• Informes de las densidades ópticas:
Ratio R3 (DO R3 / VU) ≤ 0,30
Ratio R5 (DO R5 / VU) ≥ 1,80
Si estos criterios no se cumplen, volver a empezar la manipulación.
8.4 Interpretación de los resultados
Ratio muestra Resultado Interpretación
Título < 0,80 Negativo La muestra se considera negativa para la
presencia de anticuerpos IgM anti-T. gondii.
0,80 ≤ Título < 1,00 Dudoso La muestra se considera dudosa para la
presencia de anticuerpos IgM anti-T. gondii. El
resultado debe ser confirmado por una nueva
prueba realizada en una nueva muestra extraída
como mínimo 3 semanas después de la fecha del
1er examen.
Título ≥ 1,00 Positivo La muestra se considera positiva para la
presencia de anticuerpos IgM anti-T. gondii.
8.5 Posibles causas de error
El origen de las reacciones no validadas o no reproducibles guarda a menudo
en relación con las causas siguientes:
• Lavado insuficiente de las microplacas.
• Contaminación de las muestras negativas por un suero o un plasma que
contenga un título elevado de anticuerpos.
43

• Contaminación puntual de la solución de revelado por agentes químicos
oxidantes (lejía, iones metálicos, etc.).
• Contaminación puntual de la solución de parada.
9. RESULTADOS
Los resultados de Platelia Toxo IgM fueron evaluados en 2 centros sobre un
total de 863 muestras de mujeres embarazadas y donantes de sangre.
9.1 Prevalencia
La prevalencia de anticuerpos IgM anti-Toxo con Platelia Toxo IgM se
calculó sobre un panel de 500 muestras procedentes de mujeres
embarazadas. 15 muestras eran positivas en anticuerpos IgM anti-Toxo. La
prevalencia medida con el ensayo Platelia Toxo IgM está establecida en el
3 % (15/500).
9.2 Especificidad
La especificidad se calculó sobre un panel de 737 muestras negativas con
Platelia Toxo IgM TMB (72751), procedentes de 2 centros situados en
Francia y divididas como sigue:
• 154 sueros de donantes de sangre
• 583 sueros de mujeres embarazadas
Población analizada
/ centro
Centro
1
Centro
2
Mujeres
embarazadas
Donantes de
sangre
Mujeres
embarazadas
Número de
sueros
Negativo Equívoco Positivo Especificidad
102 102 0 0
154 154 0 0
481 480 1 0
Total 737 736 1 0
* Los resultados equívocos se consideraron positivos para el cálculo de la especificidad.
[IC 95%] = Intervalo de confianza del 95 %.
100,0%
(102/102)
[97,1-100%]
100,0%
(154/154)
[98,1-100%]
99.8%
(480/481)
[99.8-99.9%]
99.9%
(736/737)
[99.25-100%]
44

9.3 Sensibilidad
La sensibilidad se calculó sobre un panel de 69 muestras positivas con
Platelia Toxo IgM TMB (72751), procedentes de 2 centros situados en
Francia y divididos como sigue:
• 4 sueros de donantes de sangre
• 65 sueros de mujeres embarazadas
Platelia
Toxo IgM
(72841)
Platelia Toxo IgM TMB (72751)
Equívoco* Positivo Total
Negativo 0 0 0
Equívoco* 8 0 8
Positivo 1 60 61
Total 9 60 69
Sensibilidad relativa * 69/69 100,0% [IC 95% = 94,8% - 100,0%]
* Los resultados equívocos se consideraron positivos para el cálculo de la sensibilidad
[IC95%] = Intervalo de confianza del 95%
La muestra positiva discrepante con Platelia Toxo IgM fuera confirmada
positiva con método ISAGA.
Además, se probaron 57 muestras sobre un panel de 19 seroconversiones.
Sobre estas 19 seroconversiones, 18 se detectaron de manera comparable y
una seroconversión presentó un desfase de una muestra a favor del método
de referencia.
9.4 Reactividad cruzada
Se analizó un panel de 205 muestras, incluidas 167 muestras positivas en
CMV, rubéola, EBV, HSV, VZV, paperas, sarampión y VIH, y 38 muestras
positivas en factor reumatoide, autoanticuerpos y anticuerpos heterófilos, y
muestras de mieloma con Platelia Toxo IgM y un ensayo inmunoenzimático
comercial para la detección de anticuerpos IgM anti-Toxo.
De esas muestras, 2 resultaron positivas y acordes con el kit de ensayo
inmunoenzimático usado para la comparación : 1 muestra positiva en anti-
EBV y 1 muestra positiva en anti-HSV 2 IgG.
45

9.5 Precisión
• Precisión intra-análisis (repetibilidad):
Con el fin de evaluar la repetibilidad intra-análisis, una muestra negativa y tres
muestras positivas han sido testadas en 32 ocasiones, en una misma serie. La
ratio (DO muestra /VU) se ha determinado para cada muestra. La media de la
ratios, la desviación estándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV) para
cada muestra se ofrecen en el cuadro siguiente.
Precisión intra-análisis (repetibilidad)
N=32
Muestra
Negativa
Muestra
positiva débil
Muestra
positiva
Ratio (DO muestra / valor umbral)
Muestra
positiva fuerte
Media 0,05 1,92 3,23 4,49
DS 0 0,04 0,07 0,10
% CV 5,0% 2,1% 2,3% 2,3%
• Precisión inter-análisis (reproducibilidad):
Con el fin de evaluar la reproducibilidad inter-análisis, las cuatro muestras (una
negativa y tres positivas) se han evaluado cada una en duplicado, en dos
series al día, durante un periodo total de 20 días. La ratio (DO muestra /VU) se
ha determinado para cada muestra. La media de la ratios, la desviación
estándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV) para cada muestra se
ofrecen en el cuadro siguiente.
Precisión inter-análisis (reproducibilidad)
N=80
Muestra
Negativa
Muestra
positiva débil
Muestra
positiva
Ratio (DO muestra / valor umbral)
Muestra
positiva fuerte
Media 0,04 2,05 3,28 4,64
DS 0,01 0,06 0,10 0,14
% CV 21,0% 2,8% 3,1% 3,0%
10. LÍMITES DE USO
Sólo puede establecerse el diagnóstico de infección por T. gondii basándose
en una combinación de datos clínicos y biológicos. El resultado de una única
prueba de titulación de anticuerpos IgM anti-T. gondii no constituye prueba
suficiente para el diagnóstico de una infección reciente.
• El diagnóstico de una infección reciente sólo puede realizarse con
información completa sobre el paciente que incluya datos clínicos y
biológicos (aumento significativo de anticuerpos IgG anti-T. gondii en
2 sueros del paciente extraídos con un intervalo de 3 semanas y analizados
46

a la vez, presencia de IgM anti-T. gondii en un nivel significativo,
demostración de baja avidez de los IgG).
• La presencia de anticuerpos IgM anti-T. gondii no constituye prueba
suficiente para confirmar una infección reciente, ya que los IgM pueden
permanecer varios meses o incluso años tras la infección. Cuando se
detectan IgM, debería realizarse una determinación cuantitativa de los
anticuerpos IgG anti-T. gondii, así como un seguimiento de la evolución de
los anticuerpos anti-T. gondii en al menos un segundo suero extraído tres
semanas más tarde.
• Si se analiza una muestra demasiado temprano durante una primoinfección
reciente, es posible que los anticuerpos IgM anti-T. gondii no estén aún
presentes. Si existen sospechas, debería extraerse y analizarse una
segunda muestra unas 3 semanas más tarde.
11. CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE
Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad
están bajo un sistema de garantía de la calidad desde la recepción de las
materias primas hasta la comercialización de los productos acabados. Cada
lote de producto acabado es objeto de un control de calidad y sólo se
comercializa si cumple con los criterios de aceptación. La documentación
relativa a la producción y al control de cada lote queda en manos del
fabricante.
12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ver la versión Inglesa.
47

PLATELIA TOXO IgM 72841
96 TESTS
QUALITATIVER NACHWEIS VON IgM-ANTIKÖRPERN
GEGEN TOXOPLASMA GONDII IN HUMANSERUM
ODER PLASMA MITTELS ENZYMIMMUNOASSAY

1. VERWENDUNGSZWECK
Platelia Toxo IgM ist ein Immunoassay unter Anwendung des Immunocapture-Prinzips
für den qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen
T. gondii in Humanserum oder –plasma.
2. KLINISCHE BEDEUTUNG
T. gondii ist ein Protozoon, das zahlreiche Säugetier- und Vogelarten infizieren
kann. Diese Infektionen treten sehr häufig beim Menschen und bei Tieren auf
und verlaufen oft klinisch ganz symptomlos. Die Prävalenz dieser Infektion in
der Population wird durch das Vorhandensein spezifischer Antikörper im
Humanserum nachgewiesen und variiert je nach Gegend und Alter.
Im Falle einer Primärinfektion bei schwangeren Frauen kann diese Infektion
schwere Folgen für den Fötus (insbesondere zerebrale Funktionsstörungen)
oder sogar Fehlgeburten verursachen. Eine durch den Nachweis von
IgGAntikörpern zu Beginn der Schwangerschaft festgestellte auch lange
zurückliegende Immunität der Mutter schützt den Fötus vor der Infektion durch
diesen Parasiten.
Die zweite durch diese Infektion gefährdete Gruppe sind immunsupprimierte
Patienten, insbesondere AIDS-Patienten. Diese Infektionen sind fast
ausschließlich auf eine aus einem ruhenden parasitären Herd (Zyste)
reaktivierte Infektion, die vor der HIV-Infektion bestand, zurückzuführen. Eine
sichere Diagnose der Toxoplasmose-Infektion wird durch den Parasitennachweis
erbracht, aber seine Bestimmung durch eine direkte Untersuchung
ist schwierig, wenn nicht sogar ungewiss. Die Serologie stellt die Grundlage für
Diagnostik und Follow-up der Toxoplasmose dar.
Durch den Nachweis spezifischer Antikörper kann eine Infektion mit T. gondii
bestätigt werden. Die gleichzeitige Untersuchung einer Probe auf verschiedene
Antikörper ermöglicht es generell, den Infektionszeitpunktfestzulegen und ggf.
bei neueren Infektionen das therapeutische Vorgehen zu bestimmen bzw. auch
dem Erscheinungsrisiko einer Toxoplasmose angemessene Vorbeugungsmaßnahmen
zu empfehlen: hygienisch-diätetische Maßnahmen bei seronegativen
schwangeren Frauen, Chemoprophylaxe bei immunsupprimierten, T. gondiiseropositiven
Patienten.
50

3. PRINZIP
Platelia Toxo IgM ist ein qualitativer Test zum Nachweis von IgM-Antikörpern
gegen Toxoplasma gondii in Humanserum oder –plasma mittels
Enzymimmunoassay mit Bindung der IgM-Antikörper an die Festphase.
Humane µ-Ketten-Antikörper werden an die Festphase (die Vertiefungen der
Mikrotiterplatte) gebunden. Eine Mischung aus T. gondii-Antigen und mit
Peroxidase markiertem, monoklonalem T. gondii-Antikörper wird als Konjugat
verwendet. Der Test erfolgt in folgenden Schritten:
• Schritt 1
Patientenproben und Kontrollen werden im Verhältnis 1:21 verdünnt und
anschließend in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Während der
1-stündigen Inkubationsphase bei 37°C binden die in der Probe vorhandenen
IgM-Antikörper an die in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte vorhandenen µ-
Ketten-Antikörper. Nach der Inkubation werden ungebundene unspezifische
Antikörper und weitere Serumproteine durch Waschgänge entfernt.
• Schritt 2
Das Konjugat (eine Mischung aus T. gondii-Antigen und mit Peroxidase
markiertem T. gondii-Antikörper) wird in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte
gegeben. Während dieser 1-stündigen Inkubation bei 37°C bindet das
Konjugat an die spezifischen T. gondii-IgM-Antikörper. Das ungebundene
Konjugat wird am Ende der Inkubation durch Waschgänge entfernt.
• Schritt 3
Durch Zugabe von enzymatischer Entwicklungslösung in jede Vertiefung wird
das Vorliegen von Immunkomplexen (humane µ-Ketten-Antikörper / T. gondii-
IgM-Antikörper / T. gondii-Antigen / mit Peroxidase markierter monoklonaler
T. gondii-Antikörper) sichtbar gemacht.
• Schritt 4
Nach einer Inkubationsphase bei Raumtemperatur (+18-30°C) wird die
Enzymreaktion durch Zugabe von 1N Schwefelsäurelösung gestoppt. Die
Extinktion wird durch Ablesen mittels Spektrophotometer bei 450/620 nm
proportional zur Menge an in der Probe vorhandenen IgM-Antikörpern gegen
T. gondii ermittelt.
51

4. PRODUKTINFORMATIONEN
Die mitgelieferten Reagenzien reichen aus für 96 Tests. Alle Reagenzien sind
ausschließlich für die in-vitro-Diagnostik bestimmt.
Etikett Art der Reagenzien Darreichungs-form
R1 Microplate Mikrotiterplatte : (gebrauchsfertig) :
12 Streifen mit 8 abknickbaren Vertiefungen,
beschichtet mit humanem µ-Ketten-Antikörper
1
R2
R3
Concentrated
Washing
Solution (20x)
Negative
Control
Konzentrierte Waschlösung (20x) :
TRIS-NaCl-Puffer (pH 7,4), 2% Tween ® 20
Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300
Negative Kontrolle :
Humanserum, negativ für IgM-Antikörper
gegen T. gondii und negativ für HBs-Antigen,
HIV1-, HIV2- und HCV-Antikörper
Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300
R4 Calibrator Kalibrator :
Humanserum, reaktiv für IgM-Antikörper gegen
T. gondii und negativ für HBs-Antigen, HIV1-,
HIV2- und HCV-Antikörper
Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300
R5
Positive
Control
Positive Kontrolle :
Humanserum, reaktiv für IgM-Antikörper gegen
T. gondii und negativ für HBs-Antigen, HIV1-,
HIV2- und HCV-Antikörper
Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300
R6a Antigen Antigen T. gondii :
T. gondii-Antigen lyophilisiert
R6b
Conjugate
(101x)
Konjugat (101 x) :
An Peroxidase gekoppelter, gegen T. gondii
gerichteter monoklonaler Mausantikörper.
Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300
R7 Diluent Verdünnungsmittel für Proben und Konjugat:
(gebrauchsfertig) :
TRIS-NaCl-Puffer (pH 7,7),
Rinderserumalbumin, 0,1% Tween ® 20 und
Phenolrot.
Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300
1 x 70 mL
1 x 0,75 mL
1 x 0,75 mL
1 x 0,75 mL
2 x qsp 14 mL
1 x 0,4 mL
1 x 80 mL
52

R9
Etikett Art der Reagenzien Darreichungs-form
Chromogen Chromogen (gebrauchsfertig):
1 x 28 mL
TMB 3,3’.5,5’-Tetramethylbenzidin (< 0,1%),
H 2 O 2 (

wieder vollständig geleert werden. Nicht korrekt durchgeführte Waschgänge
können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
• Die Mikrotiterplatte zwischen dem Ende der Waschgänge und dem
Pipettieren der Reagenzien nicht austrocknen lassen.
• Zum Pipettieren des Konjugats und der Entwicklungslösung nie dasselbe
Gefäß verwenden.
• Die enzymatische Reaktion weist gegenüber Metallen oder Metallionen eine
hohe Sensitivität auf. Folglich dürfen die verschiedenen Konjugat- und
Chromogenlösungen nicht mit Metallen in Berührung kommen.
• Die Chromogenlösung (R9) sollte farblos sein. Ist eine Blaufärbung sichtbar,
darf das Reagenz nicht verwendet und muss ersetzt werden.
• Für jede neue Probe die Pipettenspitze wechseln.
• Pipetten und Geräte auf Genauigkeit und korrekte Funktion prüfen.
54
HYGIENE- UND SICHERHEITSVORSCHRIFTEN
Das Humanmaterial zur Vorbereitung der Reagenzien wurde getestet und als
nicht reaktiv für Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBs Ag), Antikörper gegen
das Hepatitis-C-Virus (Anti-HCV) und gegen die humane Immundefizienz-Virus
(anti-HIV1 und anti-HIV2) befunden. Da keine Testmethode eine potentielle
Infektionsgefahr mit absoluter Sicherheit ausschließen kann, müssen alle
Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, und Patientenproben als potentiell
infektiös behandelt werden.
• Alle Materialien einschließlich der Waschlösung, die mit Proben und
Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen, sollten
als potentiell infektiös betrachtet werden.
• Beim Umgang mit Reagenzien und Proben Einweghandschuhe tragen.
• Nicht mit dem Mund pipettieren.
• Probenspritzer bzw. Spritzer probenhaltiger Lösungen vermeiden. Spritzer
müssen mit 10%iger Natriumhypochloritlösung behandelt werden. Ist die
verunreinigende Lösung eine Säure, die Oberflächen zunächst mit
Natriumbicarbonat neutralisieren, dann mit 10%iger Natriumhypochloritlösung
reinigen und mit Papiertüchern abtrocknen. Das zum Reinigen
verwendete Material ist in einen Behälter für Sondermüll zu geben.
• Die Patientenproben und Reagenzien humanen Ursprungs sowie
kontaminierte Materialien und Produkte dürfen nur nach einer Dekontaminierung
entsorgt werden:
- entweder durch Eintauchen in Natriumhypochloritlösung mit einer
Natriumhypochlorit-Endkonzentration von 5% für die Dauer von
30 Minuten
- oder durch Autoklavieren bei 121°C über mindestens 2 Stunden.
VORSICHT: Natriumhypochlorit-haltige Lösungen nicht in den
Autoklaven stellen.

• Kontakt der Reagenzien, auch der als nicht gefährlich eingestuften
Reagenzien, mit Haut und Schleimhäuten vermeiden.
• Chemikalien und biologische Proben müssen gemäß den GLP-Richtlinien
verwendet und entsorgt werden.
• Alle Reagenzien des Kits sind ausschließlich für die in vitro-Diagnostik
bestimmt.
Vorsicht: Einige Reagenzien enthalten < 1,5% ProClin TM 300.
R43: Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich.
S28-37: Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und
Xi - Reizend Seife abwaschen. Geeignete Schutzhandschuhe tragen.
6. ENTNAHME, VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER
PROBEN
1. Als Probenmaterial wird Serum oder Plasma (Heparin, EDTA und Citrat)
empfohlen.
2. Folgende Empfehlungen für die Handhabung, Vorbereitung und Lagerung
der Blutproben beachten:
• Alle Blutproben unter Beachtung der üblichen Vorsichtsmaßnahmen für
Venenpunktion entnehmen.
• Serumproben vor dem Zentrifugieren vollständig gerinnen lassen.
• Probenröhrchen stets verschlossen halten.
• Nach dem Zentrifugieren Serum oder Plasma vom Blutkuchen bzw. den
Erythrozyten trennen und in einem fest verschlossenen Röhrchen
aufbewahren.
• Die Proben können bei +2-8°C aufbewahrt werden, sofern sie innerhalb
von 7 Tagen getestet werden.
• Wird der Test nicht innerhalb von 7 Tagen durchgeführt oder bei Versand
der Proben, die Proben bei mind. -20°C einfrieren.
• Keine Proben verwenden, die mehr als driemal eingefroren und wieder
aufgetaut wurden. Zuvor tiefgefrorene Proben sollten nach dem Auftauen
und vor der Analyse gründlich gemischt werden (Vortex).
3. Proben mit einer Albuminkonzentration bis 90 g/l oder einer Konzentration
an ungebundenem Bilirubin bis 100 mg/l, lipämische Proben mit einer
entsprechenden Triolein-(Triglyzerid-)-Konzentration bis 36 g/l und
hämolytische Proben mit einer Hämoglobinkonzentration bis 10 g/l
beeinträchtigen das Testergebnis nicht.
4. Proben nicht erhitzen.
7. TESTVERFAHREN
7.1 Zusätzlich benötigtes Material
• Rührgerät Typ Vortex.
55

• Mikrotiterplatten-Lesegerät, mit 450 nm- und 620 nm-Filtern ausgestattet (*).
• Inkubator für Mikrotiterplatten mit Temperaturregelung, auf 37°C ± 1°C
einstellbar (*).
• Automatisches, halbautomatisches oder manuelles Mikrotiterplatten-
Waschsystem (*).
• Steriles destilliertes oder entionisiertes Wasser.
• Einweghandschuhe.
• Schutzbrille.
• Saugfähige Papiertücher
• Automatische oder halbautomatische Pipetten oder Multipipetten,
einstellbar oder voreingestellt, zum Abmessen und Verteilen von 10 µL bis
1000 µL und 1, 2 und 10 mL.
• Zylinder mit Maßeinteilung für 25 mL, 50 mL, 100 mL und 1000 mL.
• Natriumhypochloritlösung (Natronbleichlauge) und Natriumbicarbonat.
• Behälter für infektiösen Abfall.
• Einwegröhrchen.
(*) Wenden Sie sich an unseren Kundendienst für detaillierte Informationen zu
den empfohlenen Materialien.
7.2 Rekonstitution der Reagenzien
• R1: Vor dem Öffnen den Beutel 30 Minuten bei Raumtemperatur (+18-30°C)
aufbewahren. Den Halterahmen und die benötigte Anzahl an Streifen
entnehmen und die unbenutzten Streifen unverzüglich wieder in den Beutel
stecken. Überprüfen Sie, ob Trockenmittel im Beutel vorhanden ist. Den
Beutel wieder sorgfältig verschließen und bei +2-8°C lagern.
• R2: Die Waschlösung R2 im Verhältnis 1:20 mit destilliertem Wasser
verdünnen: Um die gebrauchsfertige Waschlösung herzustellen, zum
Beispiel 50 mL R2 mit 950 mL destilliertem Wasser verdünnen. Wenn
manuell gewaschen wird, 350 mL verdünnte Waschlösung für eine Platte
mit 12 Streifen vorbereiten.
• R3, R4, R5: Im Verhältnis 1:21 mit Verdünnungsmittel R7 verdünnen
(Beispiel: 15 µL R3 + 300 µL R7).
• R6a: Lyophilisiertes T. gondii-Antigen. Zur Testung von 6 Streifen eine
Ampulle mit lyophilisiertem Antigen durch Zugabe von 14 mL
Verdünnungsmittel (R7) rekonstituieren. Gründlich mischen. Die verdünnte
Antigenlösung (R6a+R7) muss vollkommen klar sein.
• R6 (R6a+R6b) – Konjugatarbeitslösung : In jedes Gefäß mit rekonstituiertem
T. gondii-Antigen (verdünnte R6a) 140 µL unbehandeltes Konjugat (R6b)
geben. Gründlich mischen. Die Konjugatarbeitslösung muss mindestens
1 Stunde vor dem Gebrauch hergestellt werden.
56

7.3 Lagerung und Haltbarkeit geöffneter bzw. rekonstituierter
Reagenzien
Das Kit bei +2-8°C lagern. Bei dieser Lagertemperatur können alle
Kitkomponenten bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum
verwendet werden.
• R1: Nach dem Öffnen sind die Streifen 8 Wochen haltbar, sofern sie in dem
sorgfältig wieder verschlossenen Originalbeutel bei +2-8°C aufbewahrt
werden (überprüfen Sie, ob Trockenmittel enthalten ist).
• R2: Nach der Verdünnung kann die Waschlösung bei +2-30°C 2 Wochen
lang aufbewahrt werden. Die konzentrierte Waschlösung kann bei +2-30°C
ohne Kontamination bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum
aufbewahrt werden.
• R3, R4, R5, R6b, R7: Nach dem Öffnen sind die bei +2-8°C gelagerten
Reagenzien ohne Kontamination bis zu 8 Wochen haltbar.
• R6 (R6a+R6b): Die rekonstituierte Konjugatarbeitslösung ist bei
Raumtemperatur (+18-30°C) 8 Stunden bei +2-8°C.
• R9: Nach dem Öffnen ist das bei +2-8°C gelagerte Reagenz ohne
Kontamination bis zu 8 Wochen haltbar.
• R10: Nach dem Öffnen ist das bei +2-8°C gelagerte Reagenz ohne
Kontamination bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum
haltbar.
7.4 Testdurchführung
Die vorliegende Beschreibung und die GLP-Richtlinien sind strikt zu befolgen.
Die Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (+18-30°C) bringen.
Die Verwendung von abknickbaren Vertiefungen erfordert während der
Handhabung besondere Aufmerksamkeit.
Zur Validierung der Testergebnisse sollten die Kalibrator, die negative und die
positive-Kontrolle in jedem Testansatz mitgeführt werden.
1. Probenverteilung und Identifikationsplan für Kontrollen und Patientenproben
sorgfältig festlegen.
2. Die verdünnte Waschlösung (R2) vorbereiten (siehe Abschnitt 7.2).
3. Den Halterahmen und die Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen (siehe
Abschnitt 7.2).
4. Die Konjugatarbeitslösung vorbereiten R6 (R6a+R6b)(siehe Abschnitt 7.2).
5. Die Kalibrator (R4), die Kontrollen (R3, R5) und die Patientenproben (S1,
S2...) in Verdünnungsmittel (R7) zu einem 1:21-Verhältnis verdünnen: 15 µL
Probe und 300 µL Verdünnungsmittel (R7)(siehe Abschnitt 7.2). Die
verdünnten Proben auf dem Vortex mischen.
6. Die nachfolgend angegebene Reihenfolge unbedingt einhalten. In jede
Vertiefung 200 µL verdünnte Kalibrator, Kontrollen und Patientenproben
geben:
57

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R3 S5 S13
B R4 S6
C R4 S7
D R5 S8
E S1 S9
F S2 S10
G S3 S11
H S4 S12
7. Die Mikrotiterplatte mit Folie abdecken und fest auf die Platte drücken,
damit sie dicht versiegelt ist. Die Mikrotiterplatte in einem Wasserbad mit
Temperaturregelung oder in einem Mikrotiterplatten-Inkubator bei 37°C
± 1°C eine Stunde ± 5 Minuten inkubieren.
8. Nach Beendigung der ersten Inkubationsphase die Klebefolie entfernen.
Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit
Natriumhypochlorit) absaugen. Die Mikrotiterplatte viermal mit 350 µL
Waschlösung (R2) waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtig
mit Papiertüchern abtupfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
9. 200 µL der Konjugatarbeitslösung (R6) in alle Vertiefungen geben. Vor der
Verwendung muss die Lösung vorsichtig geschüttelt werden.
10. Die Mikrotiterplatte mit Folie abdecken und fest auf die Platte drücken,
damit sie dicht versiegelt ist. Die Mikrotiterplatte in einem Wasserbad mit
Temperaturregelung oder in einem Mikrotiterplatten-Inkubator bei 37°C
± 1°C eine Stunde ± 5 Minuten inkubieren.
11. Nach Beendigung der zweiten Inkubationsphase die Klebefolie entfernen.
Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit
Natriumhypochlorit) absaugen. Die Mikrotiterplatte viermal mit 350 µL
Waschlösung (R2) waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtig
mit Papiertüchern abtupfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
12. 200 µL Chromogenlösung (R9) schnell und unter Lichtausschluss in alle
Vertiefungen pipettieren. Für die Entwicklung der Reaktion die Platte
lichtgeschützt bei Raumtemperatur (+18-30°C) 30 ± 5 Minuten stehen
lassen. Während dieser Inkubation keine Folie verwenden.
13. Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 100 µL Stopplösung (R10) in
jede Vertiefung stoppen. In der gleichen Reihenfolge und im gleichen
Zeitrahmen wie die Entwicklungslösung verteilen.
58

14. Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Innerhalb von 30 Minuten nach
Stoppen der Reaktion die Extinktion mit einem Plattenleser bei 450/620 nm
ablesen. Die Streifen müssen vor dem Ablesen stets lichtgeschützt
aufbewahrt werden.
15. Vor dem Weiterleiten alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmung
zwischen den Werten sowie gegen die Platten- und Probenverteilung
überprüfen.
8. BERECHNUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
8.1 Berechnung des Grenzwerts (GW)
Der Grenzwert (GW) entspricht der mittleren Extinktion (ΔE) der Kalibrator (R4)
in Doppelbestimmung:
Grenzwert = ΔE R4
8.2 Berechnung des Probenverhältnisses
Das Ergebnis der Probe wird ausgedrückt als Verhältnis, unter Anwendung
folgender Formel:
Probenverhältnis = ΔE der Probe / GW
8.3 Qualitätskontrolle
Für jede Mikrotiterplatte und jede Testreihe alle Kalibrator und Kontrollen
mitführen und die ermittelten Ergebnisse analysieren. Für die Validierung des
Tests müssen folgende Kriterien erfüllt werden:
• Extinktionswerte:
Grenzwert ≥ 0,300
0,80 x Grenzwert < DE R4 Einfachbestimmung < 1,20 x Grenzwert
0,80 x Grenzwert < DE R4 Doppelbestimmung < 1,20 x Grenzwert
(Einzelne Extinktionswerte jeder Bestimmung der Kalibrator (R4) dürfen nicht
mehr als 20% vom Grenzwert abweichen).
• Extinktionsverhältnisse:
Verhältnis R3 (DE R3 / GW) ≤ 0,30
Verhältnis R5 (DE R5 / GW) ≥ 1,80
Werden diese Qualitätskontrollkriterien nicht erfüllt, muss die Messreihe
wiederholt werden.
59

8.4 Auswertung der Ergebnisse
Probenverhältnis Ergebnis Auswertung
Verhältnis < 0,80 Negativ Die Probe gilt als nicht-reaktiv für IgM-
Antikörper gegen T. gondii.
0,80 ≤ Verhältnis < 1,00 Zweifelhaft Die Probe gilt als zweifelhaft für IgM-Antikörper
gegen T. gondii. Das Ergebnis muss mit einem
anderen Test innerhalb von 3 Wochen nach der
ersten Untersuchung unter Verwendung einer
zweiten Probe bestätigt werden.
Verhältnis ≥ 1,00 Positiv Die Probe gilt als reaktiv für IgM-Antikörper
gegen T. gondii.
8.5 Fehlerursachen
Nicht validierte oder nicht reproduzierbare Reaktionen haben häufig folgende
Ursachen:
• unzureichendes Waschen der Mikrotiterplatte,
• Verunreinigung der negativen Proben durch Serum oder Plasma mit hohem
Antikörpertiter,
• Verunreinigung der Entwicklungslösung durch chemische Oxidationsmittel
(Natronbleichlauge, Metallionen...),
• Verunreinigung der Stopplösung.
9. LEISTUNGSMERKMALE
Die Leistung des Platelia Toxo IgM wurde an 2 Standorten mit insgesamt
863 Proben von Schwangeren und Blutspendern ermittelt.
9.1 Prävalenz
Die Prävalenz von anti-Toxo-IgM-Antikörper mit dem Platelia Toxo IgM
wurde mit einem Panel von 500 Proben von Schwangeren untersucht.
15 Proben waren positiv für anti-Toxo-IgM-Antikörper. Die mit dem Platelia
Toxo IgM-Assay bestimmte Prävalenz lag demnach bei 3% (15/500).
9.2 Spezifität
Die Spezifität wurde mit einem Panel von 737 Proben mit Platelia Toxo IgM
TMB (72751), an 2 Standorten in Frankreich ermittelt. Folgende Proben wurden
untersucht :
• 154 Seren von Blutspendern
• 583 Seren von Schwangeren
60

Testpopulation
/Standort
Anzahl der
Seren
Negativ
Nicht
eindeutig
Positiv
Schwangere 102 102 0 0
Standort
1
Blutspender 154 154 0 0
Standort
Schwangere 481 480 1 0
2
Gesamt 737 736 1 0
Spezifität
100,0%
(102/102)
[97,1%-100%]
100,0%
(154/154)
[98,1%-100%]
99,8%
(480/481)
[99,8%-99,9%]
99,9%
(736/737)
[99,25%-100%]
* Zur Berechnung der Spezifität wurden nicht eindeutige Ergebnisse als positiv gewertet.
[KI 95%] = 95% Konfidenzintervall.
9.3 Empfindlichkeit
Die Empfindlichkeit (Sensitivität) wurde mit einem Panel von 69 Proben mit
Platelia Toxo IgM TMB (72751), an 2 Standorten in Frankreich ermittelt.
Folgende Proben wurden untersucht :
• 4 Seren von Blutspendern
• 65 Seren von Schwangeren
Platelia
Toxo IgM
(72841)
Platelia Toxo IgM TMB (72751)
Fraglich* Positiv Gesamt
Negativ 0 0 0
Fraglich* 8 0 8
Positiv 1 60 61
Gesamt 9 60 69
Relative sensitivität *: 69/69 100,0% [IC 95% = 94,8% - 100,0%]
* Zur Berechnung der Sensitivität wurden nicht eindeutige Ergebnisse als positiv gewertet.
[KI 95%] = 95% Konfidenzintervall.
Die mit Platelia Toxo IgM fraglich positive Probe wurde mit einer ISAGA
Methode als positiv bestätigt.
Desweiteren wurden 57 Seren von 19 Serokonversionen getestet. Hiervon
wurden 18 Serokonversionen bestätigt, 1 Serokonversion zeigte eine
Abweichung zu den ergebnissen der Referenzmethode.
61

62
9.4 Kreuzreaktivität
Ein Panel von 205 Proben, darunter 167 für CMV, Röteln, EBV, HSV, VZV,
Mumps, Masern oder HIV - positive Proben sowie 38 Rheumafaktor-,
Autoantikörper- heterophile Antikörper – und Myeloma - positive Proben,
wurde mit Platelia Toxo IgM und einem handelsüblichen Toxo IgM - EIA
untersucht. Zwei Seren zeigten in beiden Testsystemen ein positives
Testergebnis : eine anti-EBV Ak. Positives Serum und ein anti-HSV 2 IgG
positives Serum.
9.5 Präzision
• Intraassay-Präzision (Reproduzierbarkeit):
Zur Bestimmung der Intraassay-Reproduzierbarkeit wurden 1 negative und
3 positive Proben 32mal in einer Messreihe getestet. Das Verhältnis (Extinktion
der Probe/Grenzwert) wurde für jede Probe bestimmt. In der nachfolgenden
Tabelle sind für alle vier Proben jeweils das mittlere Verhältnis, die
Standardabweichung (SA) sowie der prozentuale Variationskoeffizient (VK%)
angegeben:
Intraassay-Präzision (Reproduzierbarkeit)
N=32
Negative
Probe
Schwach
positive Probe
Positive
Probe
Stark positive
Probe
Verhältnis (Extinktion der Probe / Grenzwert)
Mittelwert 0,05 1,92 3,23 4,49
SA 0 0,04 0,07 0,10
VK% 5,0% 2,1% 2,3% 2,3%
• Interassay-Präzision (Reproduzierbarkeit):
Zur Bestimmung der Interassay-Reproduzierbarkeit wurde jede der 4 Proben
(1 negative und 3 positive Proben) in Doppelbestimmung in zwei Messreihen
pro Tag über einen Zeitraum von 20 Tagen getestet. Das Verhältnis (Extinktion
der Probe/Grenzwert) wurde für jede Probe bestimmt. In der nachfolgenden
Tabelle sind für alle vier Proben jeweils das mittlere Verhältnis, die
Standardabweichung (SA) sowie der prozentuale Variationskoeffizient (VK%)
angegeben:
Interassay-Präzision (Reproduzierbarkeit)
N=80
Negative
Probe
Schwach
positive Probe
Positive
Probe
Stark positive
Probe
Verhältnis (Extinktion der Probe / Grenzwert)
Mittelwert 0,04 2,05 3,28 4,64
SA 0,01 0,06 0,10 0,14
VK% 21,0% 2,8% 3,1% 3,0%

10. GRENZEN DES VERFAHRENS
Die Diagnose einer T. gondii-Infektion kann nur auf Basis einer Kombination
von klinischen und biologischen Daten gestellt werden. Das Ergebnis einer
einzelnen Titration von Anti-T. gondii-IgM-Antikörpern ist als Beweis zur
Diagnose einer kürzlichen Infektion mit T. gondii nicht ausreichend.
• Eine kürzlich erfolgte Infektion kann nur auf der Basis vollständiger
Patienteninformationen diagnostiziert werden, einschließlich klinischer und
biologischer Daten (signifikante Erhöhung von Anti-T. gondii-IgG-
Antikörpern in 2 Patientenseren, die im Abstand von 3 Wochen
abgenommen und im selben Lauf getestet werden, Vorhandensein von Anti-
T. gondii-IgM mit signifikantem Titer, Nachweis einer niedrigen IgG-Avidität).
• Das Vorhandensein von Anti-T. gondii-IgM-Antikörpern ist kein
ausreichender Beweis zur Bestätigung einer kürzlich erfolgten Infektion, da
IgM mehrere Monate oder sogar Jahre nach der Infektion persistieren.
Werden IgM nachgewiesen, empfiehlt sich eine quantitative Ermittlung der
Anti-T. gondii-IgG-Antikörper sowie eine Nachbestimmung der Entwicklung
von Anti-T. gondii-IgM-Antikörpern mit mindestens einer zweiten
Serumprobe, die drei Wochen später entnommen wird.
• Wird eine Probe zu früh während einer kürzlich erfolgten Primärinfektion
getestet, sind möglicherweise noch keine Anti-T. gondii-IgM-Antikörper
vorhanden. Liegt ein entsprechender Verdacht vor, ist 3 Wochen später eine
zweite Probe zu entnehmen, mit der die Testung auf IgM-Antikörper
wiederholt wird.
11. QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS
Alle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einem
Qualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der
Fertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle
unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien entspricht.
Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen
werden bei Bio-Rad aufbewahrt.
12. LITERATUR
Siehe Englische Version.
63

PLATELIA TOXO IgM 72841
96 TEST
DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI
IgM ANTI-TOXOPLASMA GONDII NEL SIERO O NEL
PLASMA UMANO MEDIANTE DOSAGGIO
IMMUNOENZIMATICO

1. USO PREVISTO
Platelia Toxo IgM è un dosaggio che utilizza il metodo ad immunocattura per
la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM anti-Toxoplasma gondii nel
siero o nel plasma umano.
2. INTERESSE CLINICO
T. gondii è un protozoo in grado di infettare numerose specie d mammiferi e
uccelli. Questa infezione comune nell'uomo e negli animali, spesso non dà
manifestazioni dal punto di vista clinico. La prevalenza dell'infezione nella
popolazione, rilevata dalla presenza di anticorpi specifici nel siero varia in
funzione della zona geografica e dell'età. L'infezione può, nel caso di infezione
primaria della madre durante la gravidanza, essere causa di gravi conseguenze
per il feto (in particolare un'alterazione delle funzioni cerebrali) o di aborto.
Un'immunità pregressa della madre, dimostrata dalla presenza di anticorpi IgG
fin dall'inizio della gravidanza, protegge il feto dall'infezione da parte del
parassita.
Una popolazione sensibile a questo tipo di infezione è costituita dai pazienti
immunodepressi, quali i malati affetti da AIDS. In tal caso essa è dovuta, quasi
esclusivamente, lla riattivazione di un focolaio parassitario (ciste) quiescente
nel paziente e preesistente all'infezione da virus HIV. La diagnosi certa di
infezione da toxoplasma si ottiene attraverso l'evidenziazione del parassita,
tuttavia l’isolamento risulta difficile e raro. La sierologia rappresenta la base
della diagnosi e dello screening della toxoplasmosi. La rilevazione di anticorpi
specifici è indice di esposizione a da T. gondii; lo studio combinato di anticorpi
appartenenti a diversi isotopi consente generalmente di datare l'infezione e
orientare la terapia in caso di infezione recente, oppure di proporre misure
profilattiche idonee al rischio di insorgenza di una toxoplasmosi: misure
igienicodietetiche, per le donne in gravidanza non immuni, chemioprofilassi per
i soggetti immunodepressi sieropositivi per il T. gondii.
66

3. PRINCIPIO
Platelia Toxo IgM è un test qualitativo per la determinazione degli anticorpi
IgM anti-Toxoplasma gondii nel siero o nel plasma umano mediante
immunodosaggio enzimatico con cattura degli anticorpi IgM in fase solida.
Gli anticorpi anti-catene µ umane sono adesi alla fase solida (pozzetti della
micropiastra). Come coniugato viene utilizzata una miscela dell'antigene
T. gondii e dell'anticorpo monoclonale anti-antigene T. gondii marcato con
perossidasi. Il test prevede le seguenti fasi:
• Fase 1
I campioni dei pazienti, il calibratore e i controlli vengono diluiti in rapporto
1/21, quindi distribuiti nei pozzetti della micropiastra. Durante questa
incubazione di un'ora a 37°C, gli anticorpi IgM presenti nel campione si legano
agli anticorpi anti-µ adesi ai pozzetti della micropiastra. Gli anticorpi non
specifici non legati e altre proteine seriche vengono eliminati dai lavaggi
successivi all'incubazione.
• Fase 2
Il coniugato (miscela di antigene T. gondii e anticorpo monoclonale anti-
T. gondii marcato con perossidasi) viene aggiunto nei pozzetti della
micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37°C, il coniugato si lega
agli anticorpi IgM specifici anti-T. gondii. Il coniugato non legato viene
eliminato dai lavaggi successivi all'incubazione.
• Fase 3
La presenza di immunocomplessi (Anti-catene µ umane / IgM anti-T. gondii /
Antigene T. gondii / anticorpo anti-T. gondii marcato con perossidasi) viene
dimostrata attraverso l'aggiunta di una soluzione di sviluppo enzimatica in ogni
pozzetto.
• Fase 4
Al termine del periodo di incubazione a temperatura ambiente (18-30°C), la
reazione enzimatica viene bloccata attraverso l'aggiunta di una soluzione di
acido solforico 1N. La lettura della densità ottica ottenuta con uno
spettrofotometro impostato su 450/620 nm è proporzionale alla quantità di
anticorpi IgM anti-T. gondii presenti nel campione.
67

4. INFORMAZIONI SUL PRODOTTO
Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l'esecuzione
di 96 test. Tutti i reagenti sono destinati esclusivamente all’uso diagnostico in
vitro.
Marcatura Natura dei reagenti Presentazione
R1 Microplate Micropiastra : (Pronta per l'uso) :
12 strip con 8 pozzetti divisibili, sensibilizzati
con anticorpi anti-catene µ umane
1
R2
R3
Concentrated
Washing
Solution (20x)
Negative
Control
Soluzione di lavaggio concentrata (20x) :
Tampone TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween ® 20
Conservante: < 1,5% ProClin 300
Controllo negativo :
Siero umano negativo per anticorpi IgM
anti-T. gondii e negativo per antigene HBs,
anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV
Conservante: < 1,5% ProClin 300
R4 Calibrator Calibratore :
Siero umano reattivo per anticorpi IgM
anti-T. gondii e negativo per antigene HBs,
anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV
Conservante: < 1,5% ProClin 300
R5
Positive
Control
Controllo positivo :
Siero umano reattivo per anticorpi IgM
anti-T. gondii e negativo per antigene HBs,
anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV
Conservante: < 1,5% ProClin 300
R6a Antigen Antigene T. gondii :
Antigene T. gondii liofilizzato
R6b
Conjugate
(101x)
Coniugato (101 x) :
Anticorpo monoclonale murino anti-T. gondii
marcato con perossidasi
Conservante: < 1,5% ProClin 300
R7 Diluent Diluente per campioni e coniugato :
(Pronto per l'uso) :
Tampone Tris-NaCl (pH 7,7), albumina bovina
serica, 0,1% Tween ® 20 e rosso di fenolo.
Conservante: < 1,5% ProClin 300
1 x 70 mL
1 x 0,75 mL
1 x 0,75 mL
1 x 0,75 mL
2 x qsp 14 mL
1 x 0,4 mL
1 x 80 mL
68

R9
Marcatura Natura dei reagenti Presentazione
Chromogen Cromogeno (Pronto per l'uso):
1 x 28 mL
TMB 3,3’.5,5’ tetrametilbenzidina (< 0,1%),
H 2 O 2 (

• Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra la
fine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente.
• Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la
soluzione di sviluppo.
• La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni
metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino in
contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o il cromogeno.
• La soluzione di cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu
indica che il reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà essere
sostituito.
• Utilizzare puntali diversi per ogni campione.
• Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento delle altre
strumentazioni.
70
ISTRUZIONI DI SICUREZZA E IGIENE
Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione dei reagenti è stato
analizzato e classificato non reattivo per l'antigene di superficie dell'epatite B
(HBs Ag), gli anticorpi per il virus dell'epatite C (anti-HCV) e i virus dell'immunodeficienza
umana (anti-HIV1 e anti-HIV2). Dato che nessun metodo può
garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi, manipolare i
reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente infetti.
• Qualsiasi materiale, comprese le soluzioni di lavaggio, che entri direttamente
in contatto con campioni e reagenti contenenti materiali di origine umana
deve essere considerato potenzialmente in grado di trasmettere malattie
infettive.
• Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei campioni e dei
reagenti.
• Non pipettare con la bocca.
• Evitare di rovesciare campioni o soluzioni contenenti campioni. Pulire le
superfici contaminate con candeggina diluita al 10%. Se il liquido
contaminante è un acido, neutralizzare le superfici con bicarbonato di sodio,
quindi pulire con candeggina diluita al 10% e asciugare con carta
assorbente. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato in un
contenitore speciale per rifiuti contaminati.
• Dopo la decontaminazione, eliminare i campioni dei pazienti, i reagenti
contenenti materiale di origine umana, compreso il materiale e i prodotti
contaminati mediante uno dei seguenti metodi:
- immersione nella candeggina alla concentrazione finale di 5% di
ipocloruro di sodio per 30 minuti,
- oppure lavaggio in autoclave a 121°C per almeno 2 ore.
ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti ipocloruro di sodio
nell'autoclave

• Evitare qualsiasi contatto dei reagenti, compresi quelli considerati non
pericolosi, con la pelle e le mucose.
• La manipolazione e l'eliminazione dei residui chimici e biologici devono
essere eseguite attenendosi alle buone prassi di laboratorio. Tutti i reagenti
forniti nel kit sono destinati esclusivamente all’uso diagnostico in vitro.
Attenzione: alcuni reagenti contengono ProClin 300 < 1,5%
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle
S28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e
Xi - Irritante abbondantemente con acqua e sapone. Indossare guanti adatti
6. PRELIEVO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI
CAMPIONI
1. Il siero e il plasma (EDTA, eparina o citrato) sono i tipi di campione
raccomandati.
2. Per la manipolazione, l'elaborazione e la conservazione dei campioni
ematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni:
• Prelevare tutti i campioni di sangue secondo le precauzioni in uso.
• Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima di
procedere alla centrifugazione.
• Assicurarsi che le provette siano sempre chiuse.
• Dopo la centrifugazione, separare il siero o il plasma dal coagulo o dai
globuli rossi e conservarlo in una provetta chiusa ermeticamente.
• È possibile conservare i campioni a una temperatura compresa fra 2 e
8°C a condizione che il test venga eseguito entro 7 giorni.
• Se il test non viene eseguito entro 7 giorni, o per motivi di consegna,
congelare i campioni a una temperatura di -20°C o inferiore.
• Non utilizzare campioni scongelati più di 3 volte. I campioni
precedentemente congelati devono essere miscelati bene (Vortex) dopo
lo scongelamento e prima del test.
3. I campioni contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina non
coniugata, i campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di trioleina
(trigliceride) e i campioni sottoposti ad emolisi contenenti fino a 10 g/l di
emoglobina non influenzano i risultati.
4. Non riscaldare i campioni.
7. PROCEDURA
7.1 Materiale richiesto, ma non fornito
• Agitatore tipo Vortex.
• Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 nm e 620 nm (*).
• Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su
37±1°C (*).
71

72
• Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per
micropiastre (*).
• Acqua distillata o deionizzata sterile.
• Guanti monouso.
• Occhiali di sicurezza o antispruzzo.
• Carta assorbente.
• Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o
preimpostate per misurare e dispensare da 10 µL a 1.000 µL e 1 mL, 2 mL e
10 mL.
• Cilindri graduati con capacità di 25 mL, 50 mL, 100 mL e 1.000 mL.
• Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.
• Contenitore per rifiuti biologici.
• Provette monouso.
(*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultare
il nostro reparto tecnico.
7.2 Ricostituzione dei reagenti
• R1: Prima di aprire la bustina di plastica, lasciare 30 minuti a temperatura
ambiente (+18-30°C). Estrarre il vassoio, riporre immediatamente le strip
non utilizzate nella bustina e verificare la presenza di essiccante. Richiudere
con cura la bustina e conservarla a +2-8°C.
• R2: Diluire in rapporto 1/20 la soluzione di lavaggio R2 in acqua distillata: ad
esempio 50 mL di R2 e 950 mL di acqua distillata per ottenere la soluzione
di lavaggio pronta per l'uso. Preparare 350 mL di soluzione di lavaggio
diluita per una piastra da 12 strip in caso di lavaggio manuale.
• R3, R4, R5: Diluire in rapporto 1/21 nel Diluente (R7) (esempio: 15 µL di R3
+ 300 µL di R7).
• R6a: L’antigene T. gondii è liofilizzato. Per l’elaborazione di 6 strip,
ricostituire un flacone di antigene liofilizzato aggiungendo 14 mL di Diluente
(R7). Miscelare bene. Dopo la diluizione, la soluzione antigenica (R6a+R7)
deve essere perfettamente limpida.
• R6 (R6a+R6b) - Soluzione di lavoro del coniugato: Aggiungere 140 µL di
coniugato (R6b) in ogni flacone di antigene T. gondii ricostituito (R6a diluito).
Miscelare bene. La soluzione di lavoro del coniugato deve essere ricostituita
almeno 1 ora prima dell’uso.
7.3 Conservazione e validità dei reagenti aperti e / o ricostituiti
Il kit deve essere conservato a 2-8°C. Se viene conservato a 2-8°C prima
dell'apertura, ogni componente può essere utilizzato fino alla data di scadenza
indicata sull'etichetta riportata sul kit.
• R1: Dopo l'apertura, le strip mantengono la stabilità fino a 8 settimane, se
conservate a 2-8°C nella stessa bustina sigillata (verificare la presenza di
essiccante).

• R2: Dopo la diluizione, la Soluzione di lavaggio può essere conservata per
2 settimane a 2-30°C. La Soluzione di lavaggio concentrata conservata a
2-30°C, in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di
scadenza indicata sull'etichetta.
• R3, R4, R5, R6b, R7: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i
reagenti conservati a 2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.
• R6 (R6a+R6b): Dopo la ricostituzione, la soluzione di lavoro del coniugato
mantiene la stabilità per 8 ore a temperatura ambiente (18-30°C) e
2 settimane a +2-8°C.
• R9: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a
2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.
• R10: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente conservato
a 2-8°C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata
sull'etichetta.
7.4 Procedura
Seguire attentamente la procedura descritta di seguito e le buone prassi di
laboratorio.
Prima dell'uso, consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente
(+18-30°C).
Se si utilizzano pozzetti divisibili, prestare particolare attenzione durante la
manipolazione.
Utilizzare il calibratore, i controlli negativi e positivi in ogni seduta per
convalidare i risultati del test.
1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione per il
calibratore, i controlli e i campioni dei pazienti.
2. Preparare la Soluzione di lavaggio diluita (R2) [Fare riferimento alla Sezione 7.2].
3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo [Fare riferimento alla
Sezione 7.2].
4. Preparare la soluzione di lavoro del coniugato R6 (R6a+R6b) [Fare riferimento
alla Sezione 7.2].
5. Diluire il calibratore (R4), i controlli (R3, R5) e i campioni dei pazienti (S1,
S2…) nel Diluente (R7) per ottenere una diluizione in rapporto 1/21: 15 µL di
campione e 300 µL di Diluente (R7) [Fare riferimento alla Sezione 7.2].
Vortexare i campioni diluiti.
6. Distribuire in ogni pozzetto 200 µL di calibratore, di controlli diluiti e di
campioni dei pazienti secondo lo schema riportato di seguito:
73

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R3 S5 S13
B R4 S6
C R4 S7
D R5 S8
E S1 S9
F S2 S10
G S3 S11
H S4 S12
7. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitare
pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la
micropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per
1 ora ± 5 minuti a 37°C ± 1°C.
8. Al termine del primo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante
adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti
biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con
350 µL di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e
picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in
eccesso.
9. Distribuire 200 µL della soluzione di lavoro del coniugato (R6) in tutti i
pozzetti. Agitare leggermente la soluzione prima dell'uso.
10. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitare
pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la
micropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per
1 ora ± 5 minuti a 37°C ± 1°C.
11. Al termine del secondo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante
adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti
biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con
350 µL di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e
picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in
eccesso.
12. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µL di
Cromogeno (R9). Far sviluppare la reazione al buio per 30 ± 5 minuti a
temperatura ambiente (18-30°C). Non utilizzare nastri sigillanti adesivi
durante questo periodo di incubazione.
74

13. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µL di Soluzione bloccante
(R10) in ogni pozzetto. Utilizzare la stessa sequenza e lo stesso ritmo di
distribuzione utilizzati per la soluzione di sviluppo.
14. Asciugare accuratamente il fondo della piastra. Leggere la densità ottica a
450/620 nm mediante un lettore nei 30 minuti successivi alla reazione. Non
esporre le strip alla luce prima della lettura.
15. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la lettura
e il piano di distribuzione delle piastre e dei campioni.
8. CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
8.1 Calcolo del valore soglia (cut-off) (CO)
Il valore di Cut-Off (CO) corrisponde al valore medio delle densità ottiche (DO)
dei duplicati del Calibratore (R4):
CO = media di DO R4
8.2 Calcolo del rapporto Campione
Il risultato per un campione viene espresso sotto forma di rapporto mediante la
seguente formula:
Rapporto Campione = DO campione/CO
8.3 Controllo di qualità
Includere il calibratore e tutti i controlli in ogni micropiastra e per ogni seduta di
lavoro e analizzare i risultati ottenuti. Per la validazione del test, è necessario
che siano soddisfatti i seguenti criteri:
• Valori delle densità ottiche:
CO ≥ 0,300
0,80 x CO < DO R4 Duplicato 1 < 1,20 x CO
0,80 x CO < DO R4 Duplicato 2 < 1,20 x CO
(La singola DO di ogni duplicato del calibratore (R4) non deve differire più del
20% dal valore CO).
• Rapporti delle densità ottiche:
Rapporto R3 (DO R3 / CO) ≤ 0,30
Rapporto R5 (DO R5 / CO) ≥ 1,80
Se non vengono rispettati i criteri del controllo di qualità, la seduta analitica
dovrà essere ripetuta.
75

8.4 Interpretazione dei risultati
Rapporto campione Risultato Interpretazione
Rapporto < 0,80 Negativo Il campione è considerato non reattivo per la
presenza di anticorpi IgM anti-T. gondii.
0,80 ≤ Rapporto < 1,00 Equivoco Il campione è considerato equivoco per la
presenza di anticorpi IgM anti-T. gondii. Il
risultato deve essere confermato da un altro
test eseguito su un secondo campione
prelevato ad almeno 3 settimane di distanza
dalla data della prima analisi.
Rapporto ≥ 1,00 Positivo Il campione è considerato reattivo per la
presenza di anticorpi IgM anti-T. gondii.
8.5 Guida alla risoluzione dei problemi
Le reazioni non convalidate o non ripetibili spesso sono causate da:
• Lavaggi della micropiastra inadeguati.
• Contaminazione dei campioni negativi tramite siero o plasma con alto titolo
di anticorpi.
• Contaminazione della soluzione di sviluppo tramite agenti chimici ossidanti
(candeggina, ioni metallici...).
• Contaminazione della Soluzione bloccante.
9. EFFICACIA
L’efficacia del kit Platelia Toxo IgM è stata valutata in 2 siti su un totale di
863 campioni di donne in gravidanza e donatori di sangue.
9.1 Prevalenza
La prevalenza degli anticorpi IgM anti-Toxo mediante il test Platelia Toxo IgM
è stata determinata su di un pannello di 500 campioni di donne in gravidanza.
15 campioni sono risultati positivi per gli anticorpi IgM anti-Toxo. La prevalenza
determinata mediante il test Platelia Toxo IgM si attesta intorno al 3%
(15/500).
9.2 Specificità
La specificità è stata determinata su un di un pannello di 737 campioni positivi
mediante el test Platelia Toxo IgM TMB (72751), provenienti da 2 siti in
Francia e ripartiti come segue:
• 154 sieri di donatori di sangue
• 583 sieri di donne in gravidanza
76

Popolazione
analizzata / sito
Sito 1
Sito 2
Donne in
gravidanza
Donatori di
sangue
Donne in
gravidanza
Numero di
sieri
Negativo Equivoco* Positivo Specificità
102 102 0 0
154 154 0 0
481 480 1 0
100,0%
(102/102)
[97,1%-100%]
100,0%
(154/154)
[98,1%-100%]
99,8%
(480/481)
[99,8%-99,9%]
99,9%
Totale 737 736 1 0 (736/737)
[99,25%-100%]
* I risultati equivoci sono stati considerati positivi per il calcolo della specificità.
[CI 95%] = intervallo di confidenza 95%.
9.3 Sensibilità
La sensibilità è stata determinata su di un pannello di 69 campioni negativi
mediante el test Platelia Toxo IgM TMB (72751), provenienti da 2 siti in
Francia e ripartiti come segue:
• 4 sieri di donatori di sangue
• 65 sieri di donne in gravidanza
Platelia
Toxo IgM
(72841)
Platelia Toxo IgM TMB (72751)
Equivoco* Positivo Totale
Negativo 0 0 0
Equivoco* 8 0 8
Positivo 1 60 61
Totale 9 60 69
Sensitività relativa *: 69/69 100,0% [IC 95% = 94,8% - 100,0%]
* I campioni con risultato dubbio sono stati inclusi nel calcolo per la valutazione della sensibilità.
[CI 95%] = intervallo di confidenza 95%.
Il campiono positivo discordanto con il Kit Platelia Toxo IgM sono stato
confermato positivo con uno metodo ISAGA.
Inoltre, 57 campioni che provengono da un panel di 19 séroconversions sono
stati provati. Su queste 19 séroconversions, 18 sono stati individuati in modo
comparabile ed un séroconversion ha presentato una differenza di un prelievo
per il metodo di riferimento.
77

9.4 Reattività crociata
Un pannello di 205 campioni costituito da 167 campioni positivi per i marker
CMV, Rosolia, EBV, HSV, VZV, orecchioni, morbillo e HIV e 38 campioni positivi
per il fattore reumatoide, auto-anticorpi e anticorpi eterofili e campioni di
myeloma è stato testato con il test Platelia Toxo IgM e un test EIA per lo
screening degli anticorpi IgM anti-Toxo.
Fra questi campioni, 2 sono risultati positivi e concordanti con gli esiti del kit
EIA utilizzato per il confronto: 1 campione positivo in anti-EBV e 1 campione
positivo in anti-HSV 2 IgG .
9.5 Precisione
• Precisione intra-saggio (ripetibilità):
Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, un campione negativo e tre
campioni positivi sono stati analizzati 32 volte durante la stessa seduta
analitica. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun
campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la
deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei
quattro campioni:
Precisione intra-saggio (ripetibilità)
N=32
Campione
negativo
Campione
debolmente
positivo
Campione
positivo
Campione
fortemente
positivo
Rapporto (DO campione / Valore di cut-off)
Media 0,05 1,92 3,23 4,49
DS 0 0,04 0,07 0,10
% CV 5,0% 2,1% 2,3% 2,3%
• Precisione inter-saggio (riproducibilità):
Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, tutti e quattro i campioni (uno
negativo e tre positivi) sono stati analizzati in duplicato in due cicli al giorno per
un periodo di oltre 20 giorni. Il rapporto (DO campione / CO) è stato
determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la
media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione
(%CV) per ciascuno dei quattro campioni:
Precisione inter-saggio (riproducibilità)
N=80
Campione
negativo
Campione
debolmente
positivo
Campione
positivo
Campione
fortemente
positivo
Rapporto (DO campione / Valore di cut-off)
Media 0,04 2,05 3,28 4,64
DS 0,01 0,06 0,10 0,14
% CV 21,0% 2,8% 3,1% 3,0%
78

10. LIMITI DELLA PROCEDURA
La diagnosi dell'infezione da T. gondii può essere stabilita solamente sulla
base di una combinazione di dati clinici e biologici. Il risultato di un singolo test
di titolazione degli anticorpi IgM anti-T. gondii non costituisce una prova
sufficiente per una diagnosi di infezione recente da T. gondii.
• Solo una combinazione di dati clinici e biologici (significativo aumento degli
anticorpi IgG anti-T. gondii in 2 sieri prelevati da uno stesso paziente a
distanza di 3 settimane e analizzati in una stessa seduta analitica, presenza
di un livello significativo di IgM anti-T. gondii, determinazione di IgG a bassa
avidità) può confermare la diagnosi di un’infezione recente.
• La sola presenza di anticorpi IgM anti-T. gondii non costituisce una prova
sufficiente per confermare un’infezione recente poiché gli anticorpi IgM
possono persistere per numerosi mesi o persino per anni dopo l’infezione.
In presenza di IgM, è necessario eseguire una determinazione quantitativa
degli anticorpi IgG anti-T. gondii, nonché un controllo dell’evoluzione degli
anticorpi anti-T. gondii su almeno un secondo campione prelevato tre
settimane più tardi.
• Se un campione viene analizzato troppo precocemente durante una primoinfezione,
gli anticorpi IgM anti-T. gondii potrebbero non essere ancora
presenti. In caso di dubbio, è necessario eseguire un secondo prelievo circa
3 settimane più tardi sul quale verrà ripetuta la ricerca delle IgM.
11. CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE
Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di
qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del
prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere
commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La
documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è
conservata presso Bio-Rad.
12. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Vedere la versione Inglese.
79

Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 10/2007
Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881014