SOUCHES AFRICAINES DU VIRUS DE LA ROUGEOLE : ETUDE ...
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UNIVERSITE JOSEPH FOURIER-GRENOBLE 1<br />
SCIENCES & GEOGRAPHIE<br />
THESE<br />
Pour obtenir le grade de<br />
DOCTEUR <strong>DE</strong> L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER<br />
DISCIPLINE : BIOLOGIE<br />
(arrêté ministériel du 30 mars 1992)<br />
présentée et soutenue publiquement<br />
par<br />
Diane NINKAM NGHEMNING<br />
le 09 Juillet 2002<br />
<strong>SOUCHES</strong> <strong>AFRICAINES</strong> <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong> :<br />
ETU<strong>DE</strong> <strong>DE</strong> L’INTERACTION <strong>VIRUS</strong>-CELLULE<br />
ET ANALYSES PHYLOGENETIQUES<br />
JURY<br />
Pr P. Lebon, rapporteur<br />
Pr P. Pothier, rapporteur<br />
Pr J.M. Seigneurin<br />
Dr. R. Ruigrok<br />
Dr. T.F. Wild
REMERCIEMENTS<br />
Je remercie le Dr. Fabian WILD pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et dirigé cette<br />
thèse. Il n’a pas hésité à me confier la mission d’aller isoler des souches de virus de la<br />
rougeole au Cameroun. Ses conseils pratiques enrichissants, son expérience et sa disponibilité<br />
m’ont aidée à mener à bien ce travail. Sans son aide matériel et financière, ce travail n’aurai<br />
pas aboutit aussi vite.<br />
Je remercie le Dr. Rob RUIGROK pour m’avoir initié à la virologie depuis le <strong>DE</strong>A à l’EMBL<br />
et pour m’avoir suivi au long de ce travail. Qu’il trouve ici le témoignage de ma sincère<br />
reconnaissance.<br />
Je remercie la direction du Centre Pasteur de Yaoundé, notamment le Dr. Paul MARTIN V.<br />
M. pour m’avoir aider à obtenir une aide financière, le Dr Jocelyn THONNON pour m’avoir<br />
accueillie au Centre Pasteur de Yaoundé.<br />
Je remercie Monsieur le Professeur LEBON de l’Hôpital Saint Vincent de Paul de Paris et<br />
Monsieur le Professeur POTHIER de l’Université de Bourgogne qui m’ont fait l’honneur<br />
d’accepter de juger ce travail, Monsieur le Professeur SEIGNEURIN de l’Université Joseph<br />
Fourier de Grenoble pour avoir accepté de présider le jury de cette thèse.<br />
Je remercie le Dr Eric NERRIENET pour ses conseils et toute l’équipe du laboratoire de<br />
virologie du Centre Pasteur de Yaoundé pour son accueil chaleureux, le Pr TIECHE, le Dr<br />
TENE, le Dr EWANE EKOYOL de l’Hôpital Centrale de Yaoundé pour le diagnostic<br />
clinique et les prélèvements, le Dr TICHA JOHNSON MULUH de l’OMS de Yaoundé pour<br />
avoir mis à ma disposition les données épidémiologiques de la rougeole au Cameroun.<br />
Je remercie le Dr Robin BUCK<strong>LA</strong>ND, pour avoir mis à ma disposition une paillase dans son<br />
laboratoire. Ses conseils et son humour au cours de ce travail m’ont aidé à m’intégrer dans<br />
l’équipe et à avancer dans mes travaux.
Je remercie le Dr Florence PRA<strong>DE</strong>L et le Dr Glaucia BACCA<strong>LA</strong> du laboratoire Biomérieux<br />
pour m’avoir hébergé dans leur laboratoire pendant la réfection de notre laboratoire. Leur<br />
accueil chaleureux et leurs conseils sont inoubliables.<br />
Je remercie le Dr Laurent <strong>DU</strong>RET pour m’avoir appris à utiliser les logiciels d’analyses<br />
phylogénétiques.<br />
Je remercie l’équipe d’immunobiologie des infections virales : le Dr Branka HORVAT pour<br />
ses conseils scientifiques, le Dr Nathalie DAVOUST pour sa disponibilité et ses conseils,<br />
Julien MARIE pour son humour et pour m’avoir appris tous les jours les nuances de la langue<br />
française, Bariza B<strong>LA</strong>NQUIER pour ses conseils en matière de séquençage, Anabelle<br />
LEFEUVRE sur qui je peux compter à tout moment, Yann KERDILES et Olivier<br />
TOUZELET qui sont le symbole de la jeunesse et du dynamisme de l’équipe. A vous tous,<br />
merci pour l’ambiance chaleureuse qui règne dans l’équipe.<br />
Je remercie tous les membres de l’INSERM U404 pour leur aide spontanée et leur<br />
disponibilité au cours de ce travail.<br />
Je remercie particulièrement Bernadette MARET pour sa disponibilité, pour m’avoir motivé<br />
pour les cours de gymnastique et pour la relecture de cette thèse.<br />
Merci à Jules, Lynda et Davy qui ont accepté mon humeur tout en m’encourageant tout au<br />
long de ce travail.<br />
Merci à Jean et Jeannine BOUTET, qui m’ont adopté et m’ont encouragé tout au long de ce<br />
travail. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.<br />
Merci à ma famille pour son soutien moral tout au long de ce travail.
TABLE <strong>DE</strong>S MATIERES<br />
CHAPITRE I. LE <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> LE <strong>ROUGEOLE</strong>………………………………..1<br />
I.1 Historique …………………………………………………………………2<br />
I.2. Classification……………………………………………………………...3<br />
I.3. Structure du virion et organisation du génome…………………………...5<br />
I.4. Structure et fonction des protéines du virus de la rougeole………………7<br />
I.4.1. La nucléoprotéine (N)……………………………………………………………..7<br />
I.4.2. Les protéines P, C et V……………………………………………………………7<br />
I.4.3. La protéine de matrice (M)………………………………………………..………8<br />
I.4.4. La protéine de fusion (F)………………………………….……………………….8<br />
I.4.5. L'hémagglutinine (H)…………………………………………………...…………9<br />
I.4.6. La protéine large ( L)…………………………………………………………….10<br />
I.5. Cycle viral……………………………………………………...………..10<br />
I.5.1. Attachement et pénétration du virus dans les cellules……………..……………..10<br />
I.5.2. Transcription et réplication de l'ARN viral……………………………………....12<br />
I.5.3. Encapsidation et bourgeonnement……………………...………………………..13<br />
I.6. Pathologie………………………….……………………………………18<br />
I.6.1. Réponses immunitaires………………………………………………………..…20<br />
I.6.1.a. Réponses immunes cellulaires………….……………………………………….20<br />
I.6.1.b. Réponse humorale…………………………………………………..……………21<br />
I.6.2. Immunosuppression……………………….……………………………………22<br />
I.6.3. Complications de la rougeole…………………………………………………..23<br />
CHAPITRE II. <strong>LA</strong> VACCINATION…………………………………………..25<br />
II.1 Les vaccins inactivés……………………………………………………26<br />
II.2 Les vaccins vivants atténués…………………….. .…………………….28<br />
II.3 Les nouvelles approches de vaccination ………………..………………31<br />
II.3 1. Le vaccin actuel : quelques difficultés rencontrées…………….………………31
II.3 2. Les nouveaux vaccins……………………………………………………...…..33<br />
II.3 2.a. Les vaccins utilisant les vecteurs viraux……………………………………..34<br />
II.3 2.b. Les ISCOMs…………………………………….……………….……………….35<br />
II.3 2.c. La vaccination ADN………………………………………………………….…35<br />
II.4. Position actuelle de l’OMS : stratégie de vaccination……………………………36<br />
CHAPITRE III. ETU<strong>DE</strong>S EPI<strong>DE</strong>MIOLOGIQUES <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong>……38<br />
III.1 .Propagation de l’infection au sein d’une population non vaccinée……39<br />
III.1.1. Niveau d’exposition bas………………………………………………………..39<br />
III.1.2. Niveau d’exposition élevé………………………………………...……………39<br />
III.2. Propagation de la rougeole au sein d’une population vaccinée…….….41<br />
III.3. Efficacité de la vaccination contre la rougeole………………..………43<br />
III.4. Réponse à la vaccination : Production d’anticorps……………………43<br />
III.4.1. Facteurs d’hôte…………………………………...…………………………….43<br />
III.4.1.a. Age de l’hôte………………………….…………………………………………..43<br />
III.4.1.b. Etat nutritionnel de l’hôte……………………………………………………….46<br />
III.4.1.c. Etat de santé de l’hôte……………………………………………………………46<br />
III.4.2. Facteurs génétiques……………………………………………………………..47<br />
III.4.3. Facteurs associés au vaccin……………………………………………. .……..47<br />
III.4.3.a. La souche………………………….………………………………………………48<br />
III.4.3.b. La dose…………………………………….……………………………………….49<br />
III.4.3.c. Le mode d’administration……………………………………………………….49<br />
III.4.4.. Facteurs liés au programme de vaccination……………………………..……..49<br />
III.5. Protection conférée par la vaccination…………………..…………...…..50<br />
III.5.1. Taux protecteur d’anticorps………………………………………………………..50<br />
III.5.2. Durée de la protection……………………………………………………………..51
CHAPITRE IV. EPI<strong>DE</strong>MIOLOGIE MOLECU<strong>LA</strong>IRE <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong><br />
<strong>ROUGEOLE</strong>……………………………………………………………………54<br />
IV.1. Variabilité antigénique du virus de la rougeole……….………………54<br />
IV.2. Variations génétiques du virus de la rougeole……………………..….56<br />
IV.3. Classification génétique du virus de la rougeole………………….…..57<br />
IV.4. Distribution géographique des différents génotypes…………….……59<br />
IV.5. L’épidémiologie moléculaire comme outil de contrôle de<br />
la stratégie de vaccination…………………………………… .……………59<br />
IV.6. Application des campagnes intensives de vaccination…….…………61<br />
IV.6.1. La Gambie……………………………………………………………………..62<br />
IV.6.2. Les Etats-Unis……………………………………………………………..…..62<br />
IV.6.3. L’Amérique du Sud………………………………………………….………...63<br />
CHAPITRE V. <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong> EN AFRIQUE…………………….…..……65<br />
V.1. La rougeole au Cameroun………………………………………….…..66<br />
V.1.2. Situation géographique du Cameroun…………………………………….…….66<br />
V.1.3. Historique de la vaccination au Cameroun……………………………………..66<br />
V.1.4. Epidémies saisonnières de rougeole au Cameroun………………………..……67<br />
V.1.5. Incidence et létalité de la rougeole…………………………………….………..69<br />
V.2. La rougeole dans le continent africain……………..…………………..73<br />
CHAPITRE VI. ETU<strong>DE</strong> <strong>DE</strong>S <strong>SOUCHES</strong> <strong>AFRICAINES</strong> <strong>DE</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong><br />
<strong>ROUGEOLE</strong>……………………………………………………………………75<br />
VI.1 Interaction Virus-Cellules………………………….…………………..76<br />
VI.1.1. Approche d’un virologiste à l’épidémiologie moléculaire……………………..76<br />
VI.1.2. Résumé de l’article 1……………………………………………..…………….78<br />
VI.1.3 Travaux additionnels à l’article…………………………………………….…...80<br />
VI.1.4 Article 1…………………………………………………………………………82<br />
VI.2. Etudes épidémiologiques……………………………………………...88<br />
VI.2.1. Historique de la surveillance du virus de la rougeole en Afrique…………...…88<br />
VI.2.2. Résumé de l'article 2……………………………………………………………91<br />
VI.2.3. Article 2…………………………………...……………………………………95
VI.3. La rougeole au Cameroun : Etude de 38 cas cliniques. Diagnostic<br />
sérologique, isolements viraux et caractérisation génétique………………….110<br />
VI.3.1 Introduction…………………………………………………………………..111<br />
VI.3.2. Objectif………………………………………………………………………111<br />
VI.3.3. Stratégie expérimentale……………………………………………… ……..112<br />
VI.3.4. Matériels et méthodes………………………….……………………… ……114<br />
VI.3.4.a. Patients……………………………………..…………………………………..114<br />
VI.3.4.b. Echantillons…………………………………………………………………….114<br />
VI.3.4.c. Sérologie………………………………………………….…………………….114<br />
VI.3.4.d. Isolement du virus…………………………………………………………….115<br />
VI.3.4.e. Extraction d’ARN……………………………………………………………..115<br />
VI.3.4.f. RT-PCR………………………………………………………………………….115<br />
VI.3.5. Résultats…………………………………….…….………….….116<br />
VI.3.5.a. Diagnostic clinique…………………………………….….……………….…116<br />
VI.3.5.b. Diagnostic sérologique………………………….………..…………………116<br />
VI.3.5.c. Diagnostic virologique…………………………………..…………………..116<br />
VI.3.5.d. RT-PCR…………………………………………………………………………117<br />
VI.3.6. Discussion……………….………………………………………119<br />
VI.3.7. Conclusion…………………….……………………………………..……120<br />
CHAPITRE VII. DISCUSSION…………………………….………………..122<br />
VII.1.Interaction virus-cellules…………………………… ….…………..123<br />
VII.2. Epidémiologie…………………………………………………….....127<br />
CHAPITRE VIII. CONCLUSION ET PERSPECTIVES…………………….132<br />
ANNEXES…………………………………….……………………………………….……134<br />
BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………..……145<br />
TABLE <strong>DE</strong>S ILLUSTRATIONS………………………………… ……….………….….172<br />
TABLE <strong>DE</strong>S ANNEXES……………………………… …………………………………173<br />
ABSTRACT…………………………………………………..……………………………..174
ABREVIATIONS<br />
ADN : Acide déoxoribonucléique<br />
ARN : Acide ribonucléique<br />
ARNm : Acide ribonucléique méssager<br />
ARNv : Acide ribonucléique viral<br />
CD : cellule dendritique<br />
CDC : «Center for disease control»<br />
CMH : Complex majeur d’histocompatibilité<br />
CTL : cytotoxic T-Lymphocyte<br />
ELISA : enzyme linked immunosorbent assay<br />
H<strong>LA</strong> human leucocyte antigen<br />
IFN : interféron<br />
Ig : Immunoglobuline<br />
ISCOM : immune stimulating complex<br />
OMS : Organisation mondiale de la santé<br />
PBL : peripheral blod lymphocytes<br />
PCR : polymerase chain reaction<br />
PEV programme élargi de vaccination<br />
PHA phytohémaglutinine<br />
ROR : rougeole oreillon rubeole<br />
SCR : Short concensus repeat<br />
S<strong>LA</strong>M signaling lymphocytes activation molecule<br />
VIH : virus de l’immunodéficience humaine
CHAPITRE I : LE <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong>
I.Le virus de la rougeole<br />
2. Classification<br />
I.1. HISTORIQUE<br />
La rougeole a été décrite pour la première fois par un médecin arabe appelé Rhazes de<br />
Bagdad au IXe siècle. Il définit alors la maladie comme une forme atténuée de la variole. Des<br />
épidémies répétées caractérisées par une éruption cutanée sont rapportées en Europe entre 1 et<br />
1200 ans avant Jésus-Christ. et la rougeole serait arrivée en France par les Pyrénées avec<br />
l’invasion des Sarrasins au VIIIe siècle. En 1224, la rougeole est mentionnée comme une<br />
maladie infantile. L’introduction de la rougeole au sein de population non exposée au<br />
préalable entraîna des taux élevés de mortalité et de morbidité.<br />
Les principes de base de l’épidémiologie de la rougeole ont été décrits pour la<br />
première fois en 1846 par un jeune médecin Danois nommé Peter Pannum. Ce médecin<br />
présent dans les îles Faroé au cours d’une épidémie décrit alors les signes cliniques, la période<br />
d’incubation, la nature infectieuse de la rougeole, l’immunité à vie chez les résidents les plus<br />
âgés et la transmission par voie respiratoire (Panum, 1938).<br />
En outre, les complications de la rougeole ont été décrites initialement au XVIIIe<br />
siècle. En 1790, le chirurgien anglais James Lucas mentione le premier cas<br />
d’encéphalomyélite post-infectieuse (EPI) (Lucas, 1790) et en 1933, le premier cas de<br />
panencéphalite sclérosante subaiguë (PESS) est décrit par Dawson chez un garçon de 16 ans<br />
(Dawson, 1933). Les travaux de Bouteille et al., 1965, montrent des corps d'inclusions dans<br />
les cellules de patients souffrant de cette maladie.<br />
Le virus de la rougeole fut isolé pour la première fois sur des cellules en culture en<br />
1954 par Enders et Peebles, en inoculant des cellules primaires de rein humain avec un<br />
échantillon sanguin prélevé sur un malade nommé David Edmonston, atteint de rougeole<br />
(Enders & Peebles, 1954). Par contre, le virus associé aux cas de PESS n'a été isolé que vers<br />
la fin des années 60 (Horta-Barbosa et al., 1969 ; Payne et al., 1969). Le virus de la rougeole<br />
est par la suite adapté en culture in vitro à une variété de lignées cellulaires. Ces études ont<br />
conduit à la mise au point de tests de diagnostic pour la rougeole et au développement d’un<br />
vaccin vivant atténué par passage en culture. La lignée cellulaire Véro (cellules de rein de<br />
singe) est la plus communément utilisée. Récemment, il a été rapporté que le virus de la<br />
rougeole peut également être isolé en utilisant des lymphocytes B de ouistiti, transformés avec<br />
le virus d’Epstein Barr (cellules B95a) (Kobune et al., 1990).<br />
2
I.Le virus de la rougeole<br />
2. Classification<br />
I.2. C<strong>LA</strong>SSIFICATION<br />
Le virus de la rougeole est un membre de la famille des paramyxoviridae qui est<br />
divisée en deux sous-familles : les paramyxovirinae et les pneumovirinae (Tableau 1). Les<br />
pneumovirinae, subdivisés en pneumovirus et metapneumovirus, se distinguent des<br />
paramyxovirinae par leurs nucléocapsides plus étroites et par leurs structures génomiques. La<br />
sous-famille des paramyxovirinae quant à elle contient trois genres : les respirovirus, les<br />
rubulavirus, et les morbillivirus. Ces derniers diffèrent des deux autres par l’absence de<br />
l’activité neuraminidase. Les membres du genre des morbillivirus tels que par exemple, le<br />
virus de la maladie de Carré et le virus de la rougeole ont souvent des réactions antigéniques<br />
croisées.<br />
L’hôte naturel de la rougeole est l’homme, on suppose cependant que le virus de la<br />
rougeole aurait évolué à partir d’un morbillivirus animal. Le virus de la rougeole est plus<br />
proche du virus de la peste bovine. Il aurait été engendré dans un environnement où les<br />
humains et les bovins cohabitaient. De la même façon, le virus de la maladie de Carré aurait<br />
émergé suite à la consommation de carcasses de bovins par des canins. Le virus de la maladie<br />
de Carré bien qu’ayant des parents communs avec le virus de la rougeole, possède une<br />
épidémiologie différente, en ce sens que la taille de la population n’est pas importante pour sa<br />
propagation, probablement parce qu’il peut traverser la barrière d’espèce pour maintenir<br />
l’infection. Par contre, le virus de la rougeole nécessite une communauté d’individus<br />
suffisamment grande pour se maintenir et se propager au sein d’une population. Des études<br />
dans des communautés isolées suggèrent qu’au minimum 300 à 400 000 personnes sont<br />
nécessaires pour maintenir la transmission du virus de la rougeole (McNeil, 1976). Comptetenu<br />
de ce fait, on pense que la rougeole aurait évolué il y a 4000 ans dans les civilisations du<br />
Moyen-Orient, de l’Inde et de la Chine où la densité de la population était alors suffisament<br />
forte pour maintenir la transmission du virus.<br />
Récemment, de nouveaux virus appartenant à la famille des paramyxovirus ont été<br />
découverts : les metapneumovirus humains (van den Hoogen et al., 2001), proches du virus<br />
respiratoire syncytial, les virus Nipah et Hendra (Murray et al., 1995 ; Wang et al., 1998). Ces<br />
derniers forment un nouveau genre et se distinguent des autres membres de la famille des<br />
paramyxoviridae par leur capacité à infecter aussi bien les hommes que les animaux.<br />
3
I.Le virus de la rougeole<br />
2. Classification<br />
Table 1 : Classification des paramyxovirus<br />
Sous-famille<br />
Pneumovirinae<br />
Genre<br />
Pneumovirus<br />
Quelques exemples<br />
Virus humains<br />
Virus animaux<br />
Virus respiratoire syncytial bovin<br />
Virus respiratoire syncytial<br />
Virus respiratoire syncytial caprin<br />
humain<br />
Virus respiratoire syncytial ovin<br />
Metapneumovirus<br />
Respirovirus<br />
Metapneumovirus humains<br />
Parainfluenzavirus humains<br />
1, 3<br />
Virus de la rhinotrachéite de la dinde<br />
Virus de la pneumonie de la souris<br />
Virus de Sendai<br />
Parainfluenza virus bovin 3<br />
Paramyxovirinae<br />
Rubulavirus<br />
Henipa?<br />
Virus des oreillons<br />
Parainfluenzavirus humains<br />
2, 4a,4b<br />
Virus Simien 5<br />
Virus de la maladie de Newcastle<br />
Virus Hendra<br />
Virus Nipah<br />
Morbillivirus<br />
Virus de la rougeole<br />
Morbillivirus des cétacées<br />
Virus de la peste des petits ruminants<br />
Virus de la maladie de Carré<br />
Virus de la peste bovine<br />
4
I.Le virus de la rougeole<br />
3. Structure du virion et organisation du génome<br />
I.3. STRUCTURE <strong>DU</strong> VIRION ET ORGANISATION <strong>DU</strong> GENOME<br />
Le virus de la rougeole a une forme généralement sphérique, parfois pléiomorphique,<br />
dont le diamètre est compris entre 150 et 350nm. On peut également, bien que beaucoup plus<br />
rarement, observer des formes filamenteuses. L'enveloppe virale est constituée d'une bicouche<br />
lipidique provenant de la membrane de la cellule hôte lors du bourgeonnement. Dans la<br />
bicouche lipidique sont ancrées deux glycoprotéines : l'hémagglutinine (H) et la protéine de<br />
fusion (F). La protéine matrice (M) tapisse la surface interne de la membrane virale<br />
Le génome du virus de la rougeole est constitué d'un brin d'ARN de polarité négative.<br />
L'ARN viral est encapsidé par la nucléoprotéine (N) sous forme d'une particule de<br />
ribonucléoprotéine hélicoïdale ou nucléocapside. A la nucléocapside sont associées la<br />
phosphoprotéine (P) et la protéine large (L) qui sont deux sous-unités de la polymérase virale<br />
(Figure 1).<br />
Le génome viral a été entièrement séquencé et l'organisation des gènes a pu être<br />
déterminée (Galinski & Wechsler, 1991). Ce génome, d’une longueur d’environ 15 894<br />
nucléotides, contient six gènes (Lamb & Kolakofsky, 1996), ce qui n’est pas le cas pour les<br />
autres paramyxovirus tels que les rubulavirus (7 gènes) et les pneumovirus (10 gènes). A<br />
l’extrémité 3’ du génome se trouve une séquence « leader » de 55 nucléotides qui possède un<br />
degré élevé de complémentarité avec 40 nucléotides présents à l’extrémité 5’ du génome, ce<br />
qui suggère une formation possible d’une structure « en lasso». L’organisation des gènes dans<br />
le génome est 3'NP(CV) MFHL5' avec un trinucléotide intergénique GAA entre les différents<br />
gènes (Figure 2). Notons que la longueur de la séquence intergénique est identique pour les<br />
virus parainfluenza et les morbillivirus, mais qu’elle est variable chez les rubulavirus (1 à 47<br />
nucléotides ) et les pneumovirus (1 à 56 nucléotides) (Lamb & Kolakofsky, 1996).<br />
Le génome du virus de la rougeole code pour six protéines structurales à partir de six<br />
gènes. De plus, comme les autres paramyxovirinae, le virus de la rougeole possède une<br />
capacité de transcription étendue grâce à l’ajout de nucléotides dans les transcrits et<br />
l’utilisation des cadres de lecture chevauchant dans le gène P. Ainsi, deux protéines non<br />
structurales (C et V) sont codées à l'intérieur du gène P du virus de la rougeole. De la même<br />
façon, le gène P des rubulavirus code pour une protéine supplémentaire (V). Le virus<br />
parainfluenza bovin de type 3 (respirovirus) peut engendrer jusqu'à 3 protéines<br />
supplémentaires (C,V,D) à partir de son gène P. Contrairement aux paramyxovirinae, les<br />
pneumovirinae ont un gène P qui code pour une seule protéine P.<br />
5
Hémagglutinine (H)<br />
Protéine de fusion (F)<br />
Bicouche lipidique<br />
Protéine de mactrice (M)<br />
Figure 1: Représentation schématique du virus de la rougeole.<br />
ARN<br />
Complexe Transcriptase<br />
- Protéine large (L)<br />
- Nucléoprotéine (N)<br />
- Phosphoprotéine (P)<br />
GAA<br />
S<br />
E I S<br />
E<br />
Génome<br />
N P/C/V M F H L<br />
3’ L<br />
’<br />
T’ 5’<br />
ARNm<br />
Figure 2 : Organisation et transcription du génome du virus de la rougeole.<br />
La position et l’organisation des séquences intergéniques (S : initiation, I: séqence intergénique, E : Terminaison),<br />
L’ : région leader, T’ : région trailer sont indiquées. La quantité de transcrits diminue en fonction de la distance du<br />
siite d’initiation du premier gène. Un “gradient” est ainsi observé.
I.Le virus de la rougeole<br />
4. Structure et fonction des protéines du VR<br />
I.4. STRUCTURE ET FONCTION <strong>DE</strong>S PROTEINES <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong><br />
<strong>ROUGEOLE</strong><br />
I.4.1. La nucléoprotéine (N)<br />
L’ARNm de la protéine N est transcrit en premier. Cette protéine est la plus abondante<br />
de toutes les protéines virales, avec un poids moléculaire de 60kDa. Elle est synthétisée dans<br />
le cytoplasme et s’associe à l’ARN génomique (Udem & Cook, 1984) constituant ainsi des<br />
particules ribonucléoprotéiques (RNP). Ces dernières servent de modèle pour la réplication et<br />
la transcription. Cette association avec l’ARN génomique est très stable et l’ARN ainsi<br />
encapsidé est résistant à la digestion par la nucléase. La protéine N dans les RNP s’associe par<br />
ailleurs aux protéines P et L.<br />
I.4.2. Les protéines P, C et V<br />
La protéine P est une protéine phosphorylée ; elle se lie à la protéine N et fait partie du<br />
complexe transcriptase/réplicase (Huber et al., 1991). La protéine P de masse moléculaire<br />
72kDa est abondante dans les cellules infectées. Cependant, elle est très sensible à la<br />
protéolyse et seule une petite quantité est présente dans le virion (Griffin & Bellini, 1996).<br />
Son domaine de liaison à la protéine N est situé entre les acides aminés 204 et 321.<br />
Le gène P du virus de la rougeole, comme chez la plupart des paramyxoviridae code<br />
au moins pour trois protéines. Deux d’entre elles, P et C sont codées par le même ARNm,<br />
mais sont traduites à partir de codons d'initiation différents et des cadres de lecture ouverts<br />
chevauchants. Le codon d’initiation utilisé pour la synthèse de la protéine C est situé 19<br />
nucléotides plus loin que celui utilisé pour la protéine P (Bellini et al., 1985). En revanche, la<br />
protéine V partage avec la protéine P le même codon d'initiation ainsi que 231 résidus de la<br />
partie N-terminale. L' « editing » de l'ARN pendant la transcription ajoute un nucléotide<br />
supplémentaire de guanosine en position 751, ce qui engendre un décalage dans le cadre de<br />
lecture. De ce fait, les 276 acides aminés de l'extrémité C-terminale de la protéine P sont<br />
remplacés dans la protéine V par 68 acides aminés, riches en cystéines et possédant des<br />
propriétés d'attachement au zinc (Liston & Briedis, 1994). La protéine V est phosphorylée et<br />
est distribuée de façon diffuse dans le cytoplasme des cellules infectées. Aucune fonction<br />
7
I.Le virus de la rougeole<br />
4. Structure et fonction des protéines du VR<br />
précise n'a été assignée aux protéines C et V, mais on pense qu'elles jouent un rôle dans la<br />
transcription et/ou la réplication.<br />
I.4.3. La protéine de matrice (M)<br />
La protéine M tapisse la surface interne de la membrane virale. C'est une protéine<br />
basique contenant plusieurs régions hydrophobiques conservées. Son ARNm contient une<br />
séquence non codante d’environ 400 nucléotides de fonction inconnue à son extrémité 3’. La<br />
protéine M joue un rôle central dans la morphogénèse virale. D'une part, elle a un rôle<br />
structural, car elle interagit avec les régions intracytoplasmiques des glycoprotéines<br />
membranaires et avec le feuillet interne de la bicouche lipidique, conférant ainsi sa rigidité à<br />
l'enveloppe virale (Tyrell & Ehrnst, 1979). D'autre part, elle aurait un rôle fonctionnel au sein<br />
de la cellule infectée où elle est associée aux nucléocapsides (Hirano et al., 1992). Ces<br />
différentes associations sont très importantes pour la formation de nouvelles particules virales<br />
par bourgeonnement. Lorsque la protéine M se lie au complexe ribonucléoprotéique, elle<br />
inhibe la transcription (Suryanarayana et al., 1994). Il a été montré que dans le cas des<br />
infections persistantes telle que la panencéphalite sclérosante subaiguë, où le processus de<br />
bourgeonnement est défectueux, la protéine M est soit inactivée, auquel cas elle perd sa<br />
capacité à se lier aux nucléocapsides et à inhiber la transcription (Hirano et al., 1993), soit elle<br />
n’est pas synthétisée.<br />
I.4.4. La protéine de fusion (F)<br />
La protéine de fusion (F) est une glycoprotéine transmembranaire de type I. Elle est<br />
responsable de la fusion membranaire au cours de l'infection. Son ARNm contient une région<br />
riche en G-C (580 nucléotides) non traduite en son extrémité 5' possédant des structures<br />
secondaires (Evans et al., 1990 ; Richardson et al., 1986). La protéine de fusion est<br />
synthétisée sous forme de polyprotéine inactive d'environ 60kDa (F0). Elle est clivée dans<br />
l’appareil de Golgi par une protéase cellulaire de l’hôte, engendrant ainsi deux fragments F1<br />
(41kDa) et F2 (18 kDa) actifs reliés par un pont disulfure. Le site de clivage est constitué de<br />
cinq acides aminés basiques (résidus 108 à 112). L’arginine 112 est un déterminant critique<br />
pour le clivage car sa mutation entraîne une aberration dans le processus de clivage de F0 et<br />
abolit son activité fusogénique (Alkhatib et al., 1994a).<br />
Le fragment F1 contient le domaine transmembranaire proche de son extrémité C-<br />
terminale et une région hydrophobe qui constitue le peptide-fusion, situé à son extrémité C-<br />
terminale. Entre ces deux régions se trouvent deux domaines en hélice ; l’un proche du<br />
8
I.Le virus de la rougeole<br />
4. Structure et fonction des protéines du VR<br />
peptide-fusion, et l’autre, plus proche de la région transmembranaire, contient un motif<br />
« leucine zipper ». Ce dernier est très important car la mutation des leucines dans ce motif<br />
affecte la fusion (Buckland et al., 1992). De plus, le fragment F1 comporte une région riche<br />
en cystéines (résidus 337 à 381) qui est impliquée dans l’interaction avec la protéine H (Wild<br />
et al., 1994).<br />
Le fragment F2 comporte une séquence-signal d'environ 28 résidus en son extrémité<br />
N-terminale. De plus, il possède tous les sites de N-glycosylation (résidus asparagine 29, 61 et<br />
67), la glycosylation étant importante pour le transport vers la surface cellulaire. La mutation<br />
de ces asparagines altère la conformation de F et la capacité fusogénique de la protéine<br />
(Alkhatib et al., 1994b). Présente au niveau de la membrane sous forme de trimère, la protéine<br />
de fusion agit conjointement avec l'hémagglutinine au moment de la fusion membranaire<br />
(Wild et al., 1991).<br />
I.4.5. L'hémagglutinine (H)<br />
L'hémagglutinine est une glycoprotéine transmembranaire de type II. C'est la protéine<br />
d'attachement du virus au récepteur cellulaire. Contrairement aux virus parainfluenza et aux<br />
rubulavirus, la protéine d’attachement des morbillivirus ne possède pas d’activité<br />
neuraminidase ou estérase. La protéine H comporte dans son ectodomaine 13 résidus de<br />
cystéine très conservés entre les paramyxovirus. Parmi ceux–ci, les résidus<br />
287,300,381,394,494, 579, et 583 auraient un rôle important dans l’oligomérisation, le<br />
repliement de la protéine et participeraient probablement à la formation des ponts disulfures<br />
inter et intramoléculaire (Hu & Norrby, 1995). La protéine H est présente à la surface du<br />
virion sous forme de tétramère constitué de deux dimères. Les dimères sont formés de deux<br />
protéines reliées entre elles par des ponts disulfures et sont associés en tétramères grâce à des<br />
liaisons non covalentes. La protéine H aurait cinq sites potentiels de N-glycosylation<br />
(Alkhatib & Briedis, 1986). La glycosylation au niveau du résidu 215 serait hétérogène, ce<br />
qui pourrait expliquer l’observation régulière de deux types de protéines H sur gel de<br />
polyacrylamide (Ogura et al., 1991). La glycosylation est nécessaire pour le repliement,<br />
l’antigénicité, la dimérisation et l’exportation de la protéine de l’appareil de Golgi vers la<br />
menbrane cellulaire.<br />
9
I.Le virus de la rougeole<br />
5. Cycle viral<br />
I.4.6. La protéine large ( L)<br />
La protéine L est la protéine la moins abondante de toutes les protéines structurales<br />
(environ 50 copies par virion). Sa grande taille (2183 acides aminés) et sa localisation dans le<br />
complexe actif de transcription viral suggèrent qu’elle jouerait le rôle de polymérase virale<br />
(Hamaguchi et al., 1983). Elle serait également responsable des activités guanilyl et méthyl<br />
transférase requises lors de la mise en place de la coiffe en position 5’ des ARNm.<br />
I.5. CYCLE VIRAL<br />
I.5.1. Attachement et pénétration du virus dans les cellules<br />
La glycoprotéine hémagglutinine H joue un rôle primordial dans l’attachement du<br />
virus à la cellule hôte. Elle interagit avec les récepteurs membranaires présents à la surface de<br />
la cellule. La spécificité de cette interaction définit le spectre d’hôte et le tropisme du virus.<br />
Le virus de la rougeole à l’état naturel n’infecte que l’homme. Les singes peuvent être<br />
infectés expérimentalement.<br />
La molécule CD46 a été identifiée en premier lieu comme le récepteur des souches<br />
vaccinales du virus de la rougeole (Dorig et al., 1993 ; Naniche et al., 1993a). Cette protéine<br />
connue pour sa fonction régulatrice du complément est exprimée de façon ubiquitaire dans les<br />
tissus humains. Les singes possèdent un homologue de CD46 (Liszewski & Atkinson, 1992,<br />
Naniche et al., 1992), par contre, aucune protéine homologue n’a été identifiée chez la souris.<br />
Cette protéine comporte une queue cytoplasmique située en son extrémité C-terminale suivie<br />
d’une région transmenbranaire. Le domaine STP riche en sérine, thréonine, et proline, est<br />
proche de la membrane et constitue le site de O-glycosylation (Maisner et al., 1994). La partie<br />
N-terminale, extracellulaire est constituée de 4 séquences répétées (SCR). La protéine H<br />
interagit avec les deux SCR les plus extérieurs du récepteur CD46 (Figure 3). Plusieurs<br />
isoformes de CD46 sont obtenus par épissage alternatif des ARNm qui codent pour cette<br />
protéine. Il existe 14 isoformes de la molécule CD46 qui diffèrent par la longueur et la<br />
composition de leur domaine STP et de leur queue cytoplasmique (Johnstone et al., 1993).<br />
L’épissage au niveau du domaine STP génère les formes BC ou C, alors qu’au niveau de la<br />
queue cytoplasmique, il génère soit un fragment de 16 acides aminés (cyt1), soit un fragment<br />
de 23 acides aminés (cyt2). Quatre isoformes (BC1, BC2, C1 et C2) sont présents dans les<br />
cellules humaines et servent tous de récepteur pour le virus de la rougeole (Gerlier et al.,<br />
10
I.Le virus de la rougeole<br />
5. Cycle viral<br />
1994, Manchester et al., 1994). La distribution des différents isoformes varie en fonction des<br />
tissus. Il a été montré que le rein et les glandes salivaires expriment préférentiellement<br />
l’isoforme BC2. Dans le cerveau on trouve préférentiellement l’isoforme C2, par contre dans<br />
les organes comme le foie, la rate, la prostate, le rein, le cœur, le poumon, la thyroïde, on<br />
trouve un mélange de différents isoformes (Johnstone et al., 1993).<br />
Le second récepteur du virus de la rougeole est la molécule humaine S<strong>LA</strong>M<br />
(signalling lymphocyte activation molecule) aussi connue sous le nom de CD150 (Tatsuo et<br />
al., 2000). C’est une glycoprotéine de type 1 appartenant à la superfamille des<br />
immunoglobulines et à la fammille de la protéine immunorégulatrice CD2. Elle est exprimée<br />
par les cellules T, les cellules B et les cellules dendritiques activées. La molécule S<strong>LA</strong>M,<br />
contrairement à CD46, sert de récepteur aussi bien aux souches sauvages qu’aux souches<br />
vaccinales du virus de la rougeole. Elle est constituée d’un domaine variable (V) situé à<br />
l’extrémité de la partie N-terminale et d’un domaine constant (C) proche de la membrane,<br />
suivi des régions transmembranaires et cytoplasmiques (Figure 3). Il a été montré que le<br />
domaine V est nécessaire et suffisant pour l’interaction avec la protéine H du virus de la<br />
rougeole (Ono et al., 2001b). Il faut ici noter que les récepteurs viraux appartenant à la superfamille<br />
des immunoglobulines ont le plus souvent leur site de liaison au virus dans leur<br />
extrémité N-terminale (partie la plus distale de la membrane). C’est le cas de la molécule CD4<br />
pour le virus de l’immunodéficience acquise (Moebius et al., 1992) et ICAM-1 pour la plupart<br />
des rhinovirus humains (Staunton et al., 1990). De plus, la souche Edmonston du virus de la<br />
rougeole se lie aux SCR1 et SCR2 de CD46. Dans ces molécules, la partie la plus distante de<br />
la membrane s’avère plus accessible et peu donc servir de site de liaison du virus. Cependant,<br />
le site de liaison de la protéine H à la molécule CD46 serait différent du site de liaison à la<br />
molécule S<strong>LA</strong>M. En effet, les études de Erlenhofer et al., (2002) montrent que la mutation de<br />
l’acide aminé 481de la protéine H (N481Y) détermine si CD46 peut être utilisé ou pas. Par<br />
contre, l’altération de cet acide aminé n’a aucun effet sur l’utilisation de S<strong>LA</strong>M comme<br />
récepteur cellulaire. Ceci suggère que les sites de liaison à CD46 et à S<strong>LA</strong>M sont distincts.<br />
L’interaction de la protéine H avec le récepteur cellulaire entraîne un changement de<br />
conformation dans cette protéine qui, à son tour, active la protéine F. L’activation de la<br />
protéine F entraîne une rupture de la liaison entre les deux hélices permettant au peptide<br />
fusion de s’orienter vers la membrane cellulaire et d’interagir avec celle-ci. Les deux hélices<br />
se réasssocient et le rapprochement des membranes virales et cellulaires a lieu au cours de<br />
ce processus, favorisant ainsi la fusion (Figure 4). Il a été montré que le processus de fusion<br />
11
I.Le virus de la rougeole<br />
5. Cycle viral<br />
peut être bloqué avec des peptides correspondant aux régions hélices et leucine zipper<br />
(Wild & Buckland, 1997, Young et al., 1997). Un peptide ayant des effets similaires a été<br />
découvert pour le VIH. Il s’agit d’un peptide de 36 acides aminés appelé T-20 qui se lie au<br />
niveau des hélices de la protéine gp41, (l’équivalent de la protéine de fusion) et empêche la<br />
fusion membranaire (Kilby et al., 1998). Les auteurs ont constaté une diminution de la charge<br />
virale chez des personnes infectées après injection de la molécule T-20 par voie sous-cutanée.<br />
Ce type de peptides présente de ce fait un intérêt important pour la lutte contre la rougeole. Le<br />
processus de fusion permet l’injection du génome viral dans le cytoplasme où ont lieu la<br />
transcription et la réplication.<br />
I.5.2. Transcription et réplication de l'ARN viral<br />
Contrairement à ce qui se passe dans les virus à ARN (+), où l'ARN génomique<br />
(ARNv) est utilisé comme ARN messager (ARNm), les virus à ARN (-) effectuent la synthèse<br />
de l'ARNm grâce à leurs propres polymérases (Figure 5). La synthèse de l’ARNm commence<br />
aussitôt que le génome viral rencontre les ribonucléosides triphosphates dans le cytoplasme.<br />
La polymérase /transcriptase virale LP 4 transcrit uniquement l'ARN encapsidé. L'initiation de<br />
la transcription a lieu à l'extrémité 3' de l'ARNv. Pendant la transcription, l’ARNm de la<br />
région-leader est synthétisé et la polymérase recommence au début du premier gène. Cette<br />
réinitiation est un événement critique car elle fait la différence entre la polymérase qui<br />
transcrit le génome en ARNm et celle qui réplique le génome. La réinitiation conduit à la<br />
formation de transcrits (ARNm) monocystroniques possédant une coiffe en leur extrémité 5’<br />
et polyadénylés en 3’. La fréquence avec laquelle la polymérase réinitie la synthèse de<br />
l’ARNm à chaque jonction est élevée mais imparfaite. Il en découle un gradient de la quantité<br />
d’ARNm et de protéines codées produites lié à la position du gène par rapport au point de<br />
départ de la transcription. De ce fait, L'ARN de la nucléoprotéine représente plus de 50% des<br />
transcrits et celui de la protéine L est le moins abondant. La variation de la fréquence<br />
d’initiation des différents gènes est une astuce utilisée par les virus pour réguler l’expression<br />
des gènes au niveau de la transcription. Le virus de la rougeole utiliserait cette technique dans<br />
les infections du cerveau humain et des cellules neurales (Cattaneo et al., 1987a). En effet,<br />
dans ce type d’infection, le gradient est plus fort que dans les infections de lignées cellulaires<br />
où le virus est lytique.<br />
La phase de réplication commence juste après la traduction des premiers transcrits et<br />
l’accumulation de protéines virales. C’est la même polymérase, jusqu'ici engagée dans la<br />
transcription qui copie le génome viral, mais ignore cette fois-ci les jonctions entre les gènes.<br />
12
I.Le virus de la rougeole<br />
5. Cycle viral<br />
L’encapsidation de l’ARN néo-synthétisé par la nucléoprotéine oblige probablement la<br />
polymérase à traverser les jonctions sans marquer l’arrêt. De plus, ce couplage<br />
transcription/encapsidation conduit à un système d’autorégulation des niveaux de<br />
transcription et de réplication.<br />
La réplication consiste donc en la synthèse d'ARN de taille génomique et de polarité<br />
positive (ARN complémentaire ou ARNc) qui sert à son tour de matrice à la synthèse d'ARN<br />
génomique de polarité négative. L'ARN génomique nouvellement synthétisé et encapsidé sert<br />
soit dans un nouveau cycle de transcription, soit est transporté vers la membrane plasmique<br />
pour la formation de nouvelles particules virales. L'ARNv et L'ARNc sont encapsidés par les<br />
nucléoprotéines, ce qui n'est pas le cas pour l'ARNm.<br />
I.5.3. Encapsidation et bourgeonnement<br />
La synthèse des protéines virales a lieu dans le cytoplasme. L’assemblage des<br />
constituants du virion se fait en plusieurs parties. Durant la réplication, la nucléoprotéine libre<br />
s’associe d’abord à l’ARN génomique pour former les particules ribonucléoprotéiques. A ces<br />
particules s’associe le complexe protéique P-L. Les protéines H et F sont transportées à<br />
travers le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi où elles sont oligomérisées et<br />
glycosylées, puis gagnent ensuite la membrane plasmique.<br />
La protéine M s'attacherait aux nucléocapsides ainsi qu'aux extrémités cytoplasmiques<br />
des glycoprotéines. Cette association faciliterait alors la formation de nouvelles particules<br />
virales qui sont par la suite libérées par bourgeonnement. La présence de la protéine H à la<br />
surface cellulaire entraîne ;<br />
i) la régulation négative des récepteurs CD46 (Naniche et al., 1993b) et S<strong>LA</strong>M (Tanaka<br />
et al., 2002). La molécule CD46 a pour rôle de protéger la cellule contre la protéolyse<br />
par le complément C3b et C4b. De ce fait, si CD46 disparaît de la surface de la<br />
cellule, celle-ci est susceptible d’être lysée par le complément (Liszewski &<br />
Atkinson, 1992). La molécule S<strong>LA</strong>M ayant un rôle de co-stimulateur de l’actvation<br />
des lymphocytes T (Cocks et al., 1995), sa régulation négative affecte cette fonction<br />
d’activation, ce qui favorise l’immunosuppression induite par le virus de la rougeole<br />
(Griffin, 2001).<br />
ii) L’attachement de la protéine H aux récepteurs cellulaires entraîne l’activation de la<br />
protéine F qui induit la fusion cellule-cellule, aboutissant à la formation de cellules<br />
multinucléées appelées syncytia, caractéristiques de la rougeole.<br />
13
NH2<br />
SCR 1<br />
SCR 2<br />
SCR 3<br />
CD46<br />
SCR 4<br />
Domaine STP<br />
Cyt 1<br />
Région transmenbranaire<br />
Queue cytoplasmique<br />
Cyt 2<br />
NH2<br />
Domaine V<br />
S<strong>LA</strong>M<br />
Domaine C<br />
Région transmembranaire<br />
COOH<br />
Domaine intracytoplasmique<br />
Figure 3 : Représentation schématique des récepteurs cellulaires du virus de la rougeole.<br />
Les différentes queues cytoplasmiques de la molécule CD46 sont représentées
Récepteur<br />
cellulaire<br />
Etat natif<br />
H F1+F 2<br />
Liaison de la protéine H au<br />
récepteur cellulaire<br />
Premier intermédiaire<br />
Activation de la fusion<br />
Deuxième intermédiaire<br />
Fusion<br />
Etat post-fusion<br />
Figure 4 : Processus de fusion adapté d’après Russel et al., 2001
Réplication<br />
Leader N P L Trailler<br />
ARN viral (-)<br />
3’ 5’ 5’<br />
3’<br />
ARN complémentaire (+)<br />
Transcription<br />
Leader N<br />
ARNm<br />
P L<br />
5’<br />
Leader N P L Trailler<br />
3’ 5’<br />
ARN viral (-)<br />
Protéines virales<br />
Nouvelles particules virales<br />
Figure 5 : Transcription et réplication du génome du virus de la rougeole
I.Le virus de la rougeole<br />
6. Pathologie<br />
I.6. PATHOLOGIE<br />
Le virus de la rougeole se transmet par des gouttelettes de sécrétions respiratoires.<br />
L'infection initiale se produit dans les cellules du tractus respiratoire ou des bronches et dans<br />
les cellules épithéliales de la muqueuse respiratoire. Le virus est ensuite transporté,<br />
probablement par les monocytes ou les cellules dendritiques, jusqu’aux ganglions<br />
lymphatiques locaux. La réplication du virus dans les ganglions aboutit à une virémie et à<br />
l'infection d'une grande variété d'organes. La première cellule infectée dans le sang est le<br />
monocyte, mais d'autres leucocytes peuvent être infectés par la suite et contribuer à la<br />
diffusion de l'infection. Les stades tardifs de la virémie sont accompagnés d’une leucopénie<br />
(Sergiev et al., 1960). Les sites importants de réplication virale sont le thymus, la rate, les<br />
ganglions lymphatiques, l'appendice et les amygdales.<br />
L’étape initiale de la maladie est cliniquement silencieuse. C’est la phase d’incubation<br />
qui dure de 8 à 12 jours et qui correspond à la dissémination du virus vers les organes<br />
lymphoïdes. La phase prodromique se caractérise ensuite par une période de fièvre, malaise,<br />
conjonctivite, rhume et trachéo-bronchite. Le virus diffuse vers de nombreux autres organes<br />
(peau, conjonctives, reins, tubes digestifs, foie, muqueuses respiratoires et génitales). Dans<br />
ces différents sites, le virus se réplique d'abord dans les cellules épithéliales endothéliales<br />
et/ou dans les monocytes et macrophages.<br />
Après infection des cellules endothéliales de la peau, le virus se répand dans<br />
l'épiderme. L'infection des cellules épithéliales dans la couche granuleuse conduit à un<br />
œdème. Des cellules épithéliales géantes se forment et un infiltrat périvasculaire mononucléé<br />
s'accumule, donnant naissance à l'éruption caractéristique de la rougeole.<br />
Un ou deux jours avant l'éruption, des tâches de Koplik apparaissent sur la muqueuse<br />
buccale et persistent un ou deux jours après l'éruption. Cette dernière, de type érythémateux<br />
maculo-papulaire, apparaît généralement 14 jours après l'infection initiale. Elle apparaît<br />
d'abord derrière les oreilles, sur le front, à la racine des cheveux. L'éruption descend ensuite<br />
vers le visage, le cou, les extrémités des membres supérieurs et le tronc, et continue jusqu'aux<br />
pieds. L'éruption s'efface dans l'ordre d'apparition à partir du troisième jour, laissant des zones<br />
brunes décolorées certainement dues à une capillarité purpurique. Bien que la pathologie de la<br />
rougeole soit connue depuis longtemps, il existe encore des incompréhensions quant à la<br />
18
I.Le virus de la rougeole<br />
6. Pathologie<br />
distribution cellulaire du virus dans l’organisme du malade et la distribution des récepteurs<br />
cellulaires de la rougeole.<br />
Différentes études des récepteurs utilisés par les souches vaccinales et sauvages du<br />
virus de la rougeole correspondent à la pathologie et au tropisme soulignés ci-dessus pour la<br />
plupart des observations effectuées. Le récepteur CD46 est exprimé de façon ubiquitaire,<br />
tandis que S<strong>LA</strong>M (CDw150) (Tatsuo et al., 2000) a été observé seulement sur les cellules B et<br />
T activées et sur les cellules dendritiques (Cocks et al., 1995 ; Tangye et al., 2000). Si S<strong>LA</strong>M<br />
est le seul récepteur identifié pour les souches sauvages, sa distribution tissulaire n’explique<br />
pas le tropisme observé chez les enfants infectés. Parmi les anomalies, on peut noter le fait<br />
que les sites précoces de l’infection sont les cellules épithéliales respiratoires. Plus tard, on<br />
retrouve le virus dans d’autres cellules épithéliales, ainsi que dans les cellules endothéliales.<br />
La présence de la molécule S<strong>LA</strong>M n’a jamais été rapportée dans de telles cellules. Parmi les<br />
explications possibles, il y a le fait que S<strong>LA</strong>M serait induit au cours de l’infection.<br />
Récemment, il a été montré que bien que les monocytes n’expriment pas S<strong>LA</strong>M, ils peuvent<br />
être infectés, l’infection pouvant être bloquée par un anticorps anti-S<strong>LA</strong>M (Minagawa et al.,<br />
2001). De plus, pendant l’infection des monocytes, il y a une régulation positive de<br />
l’expression de S<strong>LA</strong>M. D’autres possibilités pourraient inclure le fait que les cellules<br />
infectées peuvent adhérer aux cellules épithéliales et endothéliales en utilisant des lectines qui<br />
sont des molécules d’adhésion aidant à la transmission cellule-à-cellule de l’infection.<br />
L’infection des lignées cellulaires de monocytes et de macrophages par le virus de la rougeole<br />
induit l’expression de LFA-1, une molécule d’adhésion qui favorise l’adhésion aux cellules<br />
endothéliales et contribuerait à la dissémination du virus (Attibele et al., 1993 ; Hummel et<br />
al., 1998). Il a aussi été montré que le VIH incorpore des molécules de la cellule hôte telles<br />
que ICAM-1, CD44, dans la particule virale (Fortin et al., 1997), élargissant ainsi la variété de<br />
cellules infectables par le virus. Cependant, bien qu’il ait été rapporté que le virus de la<br />
rougeole peut incorporer des protéines cellulaires dans le virion (Fagraeus et al., 1978), il est<br />
peu probable qu’elles soient utilisées in vivo puisqu’on n'observe pas de virus libre dans la<br />
phase virémique. D’autres possibilités incluraient la présence d’autres récepteurs et l’entrée<br />
du virus par un mécanisme ne nécessitant pas de récepteur telle que la micropinocytose<br />
comme il l’a été rapporté pour le VIH (Hioe et al., 2001).<br />
19
I.Le virus de la rougeole<br />
6. Pathologie<br />
I.6.1. Réponses immunitaires<br />
Les réponses immunitaires au virus de la rougeole sont importantes pour l’élimination<br />
du virus et la guérison. Elles sont responsables des manifestations cliniques de la rougeole. La<br />
nature de la réponse immunitaire protectrice a été étudiée dans les modèles animaux mais<br />
aussi en observant les réponses immunes chez les enfants. Il est clair que l’on peut prévenir<br />
l’infection par le virus de la rougeole par une administration passive de globulines<br />
(Krugman, 1963). Cependant, des enfants souffrant d’hypogammaglobulinémie guérissent<br />
normalement, alors que ceux qui souffrent d’anomalies congénitales ou acquises de<br />
l’immunité cellulaire développent une maladie progressive. Il est probable que les anticorps<br />
représentent une première barrière contre l’infection mais qu’une immunité à médiation<br />
cellulaire est essentielle pour l’élimination du virus.<br />
I.6.1.a. Réponses immunes cellulaires<br />
Les principales actions dans la réponse immune non-spécifique précoce sont<br />
l’induction d’interférons (IFN) et l'activation du complément, l’activation des<br />
macrophages et des cellules « natural killer », et la production d’IFN et d’IL-12. Bien qu’il<br />
ait été montré que l’infection de lignées cellulaires par le virus de la rougeole induit la<br />
production d'interféron (Volckaert-Vervliet & Billiau, 1977), les résultats concernant<br />
l’infection par le virus sauvage in vivo sont contradictoires et non concluants. Le virus de la<br />
rougeole ne paraît pas gêner l’activation du complément in vitro, ni la production d’IFN in<br />
vivo (Griffin et al., 1990). Naniche et al. (2000) ont montré que, bien que l’infection des<br />
lymphocytes avec les souches vaccinales induise l’IFN ce n’est pas le cas avec les souches<br />
sauvages. De plus, une pré-infection avec une souche sauvage bloque l’induction de<br />
l’interféron par une souche vaccinale. Ainsi, la souche sauvage du virus de la rougeole est<br />
capable de supprimer la synthèse des médiateurs précoces de l’immunité antivirale.<br />
Les CTL (Cytotoxic T-Lymphocytes) CD8+, spécifiques de la rougeole, sont<br />
détectables dans le sang au moment de l’éruption et dans les lavages bronchioalvéolaires au<br />
cours de la pneumopathie et persistent pendant des mois après l’infection. Le CD8 soluble, un<br />
sous-produit de l’interaction des cellules TCD8+ activées avec les cellules cibles, et la<br />
microglobuline 2, un composant du CMH I qui présente l’antigène aux cellules CD8+, sont<br />
également augmentés dans le sang. Il a été montré qu’il y a une augmentation de l’expression<br />
du CMH I grâce à la production d’IFN au cours de l’infection des cellules in vitro par le<br />
20
I.Le virus de la rougeole<br />
6. Pathologie<br />
virus de la rougeole. Si ce processus avait lieu in vivo, il augmenterait la reconnaissance des<br />
cellules infectées par les cellules T CD8+ impliquées dans leur destruction.<br />
Les cellules T CD4+ sont aussi activées en réponse à l’infection par le virus de la<br />
rougeole. Le taux de cytokines circulantes produit par les cellules T et les macrophages<br />
augmente. Les cytokines produites par les cellules T CD4+ déterminent leurs fonctions. Ainsi,<br />
les cellules T CD4+ de type I produisent l’IFN qui active les macrophages et l’interleukine<br />
(IL-2) qui induit la prolifération des cellules T. Les cellules T CD4+ de type II produisent<br />
l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10 qui jouent un rôle important dans la prolifération et la différenciation<br />
des cellules B.<br />
En ce qui concerne la production de cytokines pendant la rougeole, on constate que<br />
pendant la phase des prodromes, les niveaux d’IFN de néoptérine (un produit d’activation<br />
des macrophages) et du récepteur de l’IL-2 augmentent dans le sang. Ceci est suivi d’une<br />
augmentation d’IL-2 et de CD4 soluble pendant l’éruption (Griffin et al., 1989). Au fur et à<br />
mesure que disparaît l’éruption, le taux d’IL-4 augmente et cette augmentation persiste chez<br />
certains malades pendant des semaines. En résumé, ce profil de production de cytokines<br />
suggère que différentes cellules du système immunitaire seraient activées dans un ordre bien<br />
précis au cours de l’infection. Il y aurait d’abord l'activation précoce de cellules CD8+ (IFN )<br />
pendant les prodromes, puis l’activation de cellules CD4+ de type 1 (IFN et IL-2) pendant<br />
l’éruption, suivie de l’activation de cellules CD4+ de type 2 (IL-4) pendant la convalescence.<br />
I.6.1.b. Réponse humorale<br />
Les anticorps sont détectables dans le sérum et les sécrétions dès l’apparition de<br />
l’éruption et persistent pendant plusieurs années après la guérison. Les IgM sont produites en<br />
premier et leur présence indique une primo-infection (par une souche sauvage ou vaccinale),<br />
suivies des IgG et des IgA. Des anticorps dirigés contre la plupart des protéines spécifiques du<br />
virus de la rougeole sont produits. La proportion de chaque anticorps est corrélée au taux de<br />
protéine virale correspondante synthétisée. Ces anticorps sont par conséquent principalement<br />
dirigés contre la protéine N. La contribution des différents anticorps à la neutralisation et à la<br />
protection a été montrée in vitro et dans les modèles animaux. Les anticorps dirigés contre la<br />
protéine H ou F neutralisent le pouvoir infectant du virus (Giraudon & Wild, 1981 ; Varsanyi<br />
et al., 1984) et lorsqu’ils sont administrés de façon passive protègent l’animal d’une épreuve<br />
mortelle (Giraudon & Wild, 1985 ; Malvoisin & Wild, 1990). En revanche, les anticorps<br />
contre les autres protéines ne possèdent aucune de ces fonctions. Il existe en général une<br />
21
I.Le virus de la rougeole<br />
6. Pathologie<br />
bonne corrélation entre la protection et les taux d’anticorps neutralisants circulants. Tous ces<br />
changements s’accompagnent d’un état d’immunodéficience, qui, bien que réversible, peut<br />
persister pendant des mois, augmentant ainsi la susceptibilité du malade à des infections<br />
opportunistes.<br />
I.6.2. Immunosuppression<br />
L’immunosuppression a été décrite pour la première fois il y a environ cent ans, au<br />
cours des infections par le virus de la rougeole (Von Pirquet, 1908). Si la rougeole est<br />
l’infection virale responsable de la majorité des cas de mortalité et de morbidité chez les<br />
enfants dans le monde, c’est le phénomène de l’immunosuppression conduisant à des<br />
infections secondaires virales et bactériennes qui fait le plus de victimes. L’état<br />
d’immunosuppression peut persister plusieurs semaines voire plusieurs mois, en particulier<br />
chez les enfants soufrant de malnutrition. Le paradoxe ici est que, malgré cette attaque sur le<br />
système immunitaire, le virus de la rougeole induit une excellente réponse immune<br />
conduisant à une immunité à vie. Par contre, les souches vaccinales induisent une<br />
immunosuppression moyenne et les réponses humorales sont moins importantes et seraient de<br />
plus courte durée (Fireman et al., 1969 ; Hussey et al., 1996). Les mécanismes impliqués dans<br />
l’immunosuppression n’ont pas été élucidés, mais les études de certains laboratoires suggèrent<br />
que plusieurs voies du système immunitaire seraient impliquées. Il est actuellement<br />
impossible d’évaluer si l’une d’elles contribue de façon majoritaire. Parmi les meilleures<br />
approches, on peut citer le fait que :<br />
i) Bien que moins de 1% des lymphocytes B et T circulants soient infectés, on<br />
observe une lymphopénie transitoire chez les enfants infectés. Le rapport<br />
CD4/CD8 est maintenu (Arneborn & Biberfeld, 1983 ; Griffin et al., 1986).<br />
ii) L’infection des monocytes par le virus inhibe la synthèse d’IL-12, une cytokine<br />
importante dans l’immunité à médiation cellulaire. Ces études montrent que cette<br />
régulation négative se fait via l’interaction avec CD46 et donc serait limitée aux<br />
souches vaccinales (Karp, 1999).<br />
iii) Les cellules B et T infectées par le virus de la rougeole sécrètent un facteur soluble<br />
qui bloque la prolifération des cellules B non infectées (Fujinami et al., 1998 ; Sun<br />
et al., 1998). De même, l’interaction des PBLs infectés par le virus de la rougeole<br />
inactivé aux UV avec les lymphocytes sains bloque le cycle cellulaire de ces<br />
22
I.Le virus de la rougeole<br />
6. Pathologie<br />
derniers en phase G1. Dans ce cas, la présence des deux glycoprotéines H et F est<br />
nécessaire (Engelking et al., 1999 ; Naniche et al., 1999).<br />
iv) La nucléoprotéine du virus de la rougeole est la plus abondante des protéines<br />
virales. Elle a la capacité d’interagir avec le récepteur Fc . In vitro, ceci conduit à<br />
l’inhibition de la synthèse d’anticorps (Ravanel et al., 1997) et in vivo, à la<br />
réduction de la réaction d’hypersensibilité retardée qui s’explique par une<br />
incapacité des cellules dendritiques à activer correctement les lymphocytes T. Ces<br />
même cellules inhibent la production d’IL-12 (Marie et al., 2001).<br />
v) Le virus de la rougeole peut infecter les cellules dendritiques immatures qui<br />
entament donc leur processus de maturation. Normalement, les cellules<br />
dendritiques matures migrent vers les ganglions lymphatiques périphériques ou les<br />
antigènes sont présentés aux cellules T. Au cours de l’infection par le virus de la<br />
rougeole, il semble que les cellules dendritiques perdent leurs fonctions de<br />
présentation (Grosjean et al., 1997).<br />
I.6.3. Complications de la rougeole<br />
Chez les personnes présentant déjà un terrain d’immunodéficience, l’absence d’une<br />
réponse immune cellulaire adéquate favorise l’établissement des infections persistantes telles<br />
que l'encéphalite aiguë retardée qui se manifeste par des troubles moteurs et sensoriels<br />
environ six mois après la rougeole , le virus associé est le plus souvent génétiquement altéré<br />
(Baczko et al., 1988 ; Cattaneo et al., 1987b) et la MIBE (measles inclusion body<br />
encephalitis), qui est caractérisé par la présence de corps d’inclusions dans les neurones La<br />
maladie évolue vers une forme aiguë ou subaiguë en envahissant le cerveau. Deux autres<br />
perturbations neurologiques sont observées suite à la rougeole :<br />
- L’encéphalomyélite post-infectieuse qui est une maladie démylinisante autoimmune. Elle<br />
se produit dans un cas de rougeole sur mille, principalement chez les individus plus âgés. On<br />
l’observe environ deux semaines après l’éruption. Cette maladie est associée à une réponse<br />
autoimmune à l’un des composants protéiques de la myéline (Johnson et al., 1984). Ces<br />
patients présentent des taux élevés et persistants d’IgE et des taux faibles de récepteurs d’IL-2<br />
soluble dans le sang (Griffin et al., 1985). L’activation immune et le dysfonctionnement du<br />
système immunitaire pourraient jouer un rôle dans l’induction de cette maladie.<br />
- La panencéphalite sclérosante subaiguë (PESS) est une complication tardive de la<br />
rougeole. Touchant environ un cas sur un million, elle est inévitablement fatale. La période<br />
23
I.Le virus de la rougeole<br />
6. Pathologie<br />
d’incubation de la maladie est de plusieurs années (>2ans) après l’infection initiale. Des crises<br />
d’épilepsie seraient l’une des manifestations cliniques révélatrices des cas de PESS (Kissani<br />
et al., 2001). Ces crises apparaîtraient dès la première année d’évolution de la maladie qui est<br />
caractérisée par la présence d’antigènes viraux dans le noyau et le cytoplasme des neurones et<br />
des cellules gliales. Le taux d’anticorps sériques contre le virus de la rougeole est élevé et des<br />
anticorps sont présents dans le liquide céphalorachidien, avec une réaction inflammatoire<br />
considérable dans le système nerveux central (Tourtellotte et al., 1981). On ne sait ni<br />
comment, ni où le virus persiste entre la période d’infection aiguë et le début de la phase<br />
clinique, ni comment il pénètre dans le cerveau. Le virus responsable de cette maladie est<br />
défectif et contient des mutations dans son génome qui bloquent la production de virus<br />
infectieux (Baczko et al., 1986 ; Cattaneo et al., 1988). Ces mutations se situent<br />
principalement au niveau des gènes H, F et M. Celles qui concernent la protéine F sont<br />
localisées dans la région cytoplasmique. Les mutations dans le gène M conduisent à la fin<br />
prématurée de la protéine ou à des formes conformationnellement non fonctionnelles.<br />
Certaines mutations dans la protéine H peuvent entraîner une interaction moins efficace avec<br />
la protéine F dans le processus de fusion.<br />
Le virus de la rougeole a été associé à d’autres manifestations cliniques comme la<br />
maladie de Crohn qui se caractérise par une réaction granulomateuse des macrophages<br />
(Wakefield et al., 1997), la maladie de Paget qui est due à un dysfonctionnement des<br />
ostéoclastes (Reddy et al., 1999) et certains cas d’inflammation intestinale chronique<br />
(Kawashima et al., 2000). Mais à ce jour, il n’y a aucune preuve formelle que le virus de la<br />
rougeole soit la cause de ces maladies.<br />
24
CHAPITRE II. <strong>LA</strong> VACCINATION<br />
25
II. La vaccination<br />
1. Les vaccins inactivés<br />
L’immunité induite par l’infection naturelle protège l’hôte à deux niveaux : i) les<br />
cellules infectées peuvent être éliminées par les CTLs ; ii) l’anticorps peut soit bloquer<br />
l’entrée de l’agent pathogène, soit réduire la charge virale une fois l’infection commencée.<br />
Les vaccins vivants atténués miment l’infection naturelle et induisent ainsi le même<br />
type de réponse immune, c'est-à-dire qu’une réponse de type Th2 suit une réponse de type<br />
Th1. Par contre, les vaccins inactivés sont non-réplicatifs et sont de ce fait vus par le système<br />
immunitaire comme exogènes. Ceci ne peut pas normalement induire une réponse Th1. Le<br />
type d’immunité requise pour la protection varie en fonction de l’agent pathogène. Le<br />
poliovirus, un pathogène de l’intestin peut passer dans le cerveau et engendrer une<br />
poliomyélite. L’induction d’anticorps antipoliovirus dans le sérum avec un vaccin inactivé est<br />
suffisante pour la protection contre les manifestations cliniques, mais ne protège pas contre<br />
l’infection dans l’intestin. Les tentatives récentes de production d’un vaccin contre le VIH ont<br />
souligné des lacunes dans la compréhension des principes immunologiques de l’induction des<br />
réponses protectrices. Basées sur le nombre d’ « erreurs » de vaccination survenues dans les<br />
années 1960, quelques règles ont été développées pour ce groupe de virus. Comme mentionné<br />
ci-dessus, au cours d’une infection naturelle, une réponse Th1 est suivie par une réponse Th2.<br />
La vaccination avec une préparation inactivée induit seulement le système Th2 qui<br />
reste «fixé » dans la mémoire immunologique de l’hôte. Cependant, avec la diminution de<br />
l’immunité, l’hôte devient susceptible et si l’infection survient, le virus induit un «cocktail»<br />
de cytokines (Th1 + Th2) qui conduit à un déséquilibre immunologique. Dans le cas des<br />
vaccins inactivés contre les paramyxovirus, ceci a entraîné une forme très sévère de la<br />
maladie. Ainsi, la vaccination contre ces virus doit respecter certaines règles immunologiques.<br />
II.1 LES VACCINS INACTIVES<br />
Ils sont produits à partir d’agents pathogènes dont l’infectivité a été détruite par un<br />
agent chimique dénaturant comme le formol, la -propiolactone ou par la chaleur. Cette<br />
méthode fut utilisée pour la première fois dans les années 50 par Jonas Salk pour la mise au<br />
point du vaccin contre la poliomyélite. L’utilisation de ce vaccin a considérablement réduit le<br />
nombre de cas de poliomyélite dans le monde. D’autres vaccins à virus inactivés comme le<br />
vaccin contre la grippe, la rage, l’encéphalite japonaise et la méningo-encéphalite à tiques<br />
d’Europe centrale (Tick born encephalitis virus) sont aussi disponibles sur le marché. Malgré<br />
26
II. La vaccination<br />
1. Les vaccins inactivés<br />
leur efficacité irréfutable, ces vaccins présentent dans certains cas quelques désavantages en<br />
terme d’immunité :<br />
- leur caractère non-réplicatif ne permet pas la persistance de l’antigène dans<br />
l’organisme et de ce fait, la protection est de courte durée,<br />
- ils ne sont pas aussi efficaces que les virus vivants car ils n’induisent pas<br />
d’immunité muqueuse (IgA),<br />
- cette méthode ne convient pas à tous les virus car la dénaturation entraîne dans<br />
certains cas la perte d’antigénicité comme c’était le cas pour le vaccin contre la rougeole.<br />
Au début des années 1960, le vaccin inactivé préparé à partir de la souche Edmonston traitée<br />
au formol, a été introduit aux Etats-Unis et en Europe. Ce vaccin induit des anticorps<br />
neutralisants et protège contre l’infection. Cependant, l’immunité est de courte durée (Carter<br />
et al., 1962 ; Guinee et al., 1966). Parmi les enfants ayant reçu ce vaccin, 15 à 50% qui par la<br />
suite ont été infectés par le virus de la rougeole, ont développé une forme sévère de maladie<br />
appelé rougeole atypique. Cette forme de rougeole était caractérisée par une fièvre soutenue et<br />
prolongée, une éruption de type vésiculaire qui commence par les extrémités des membres,<br />
contrairement à l’éruption maculopapulaire, caractéristique de la rougeole classique qui<br />
commence sur la face et le tronc, une pneumonie sévère nécessitant le plus souvent une<br />
hospitalisation. Des douleurs abdominales, un dysfonctionnement du foie, des maux de têtes,<br />
des effusions pleurales, l’éosinophilie et des oedèmes ont aussi été décrits (CDC, 1976 ;<br />
Fulginiti et al., 1967). Des observations similaires ont été faites pendant la même période chez<br />
des enfants ayant reçu le vaccin inactivé contre le virus respiratoire syncytial (RSV), le virus<br />
parainfluenza et le virus des oreillons. Ces vaccins n’étaient pas protecteurs et des maladies<br />
sévères se développaient chez les enfants exposés au virus sauvage (Kim & al., 1968).<br />
Plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer cette maladie, focalisées sur la<br />
possibilité de l’induction d’une hypersensibilité retardée spécifique de la rougeole qui serait<br />
anormale (Fulginiti & Arthur, 1969). Mais la théorie la plus acceptée fut celle selon laquelle<br />
la rougeole atypique serait due à un déséquilibre dans la réponse anticorps dirigée contre les<br />
glycoprotéines virales H et F, à cause de l’altération de la protéine F dans le vaccin inactivé<br />
(Norrby et al., 1975). Cependant, une étude plus récente, dans laquelle la rougeole atypique a<br />
été établie chez le singe Rhésus macaque, montre que la maladie atypique serait due à une<br />
réponse anticorps non protectrice à laquelle s’ajoute une production exagérée de cytokines de<br />
type 2 (Polack et al., 1999).<br />
27
II. La vaccination<br />
2. Les vaccins vivants atténués<br />
II.2 LES VACCINS VIVANTS ATTENUES<br />
Ce sont des virus à pathogénicité réduite, capables de se multiplier dans l’organisme et<br />
d’induire une réponse immunitaire comparable à l’infection naturelle sans manifestations<br />
cliniques. L’atténuation est causée par l’induction de mutations dans l’agent pathogène<br />
conduisant à la limitation de sa virulence chez le sujet vacciné. L’atténuation est obtenue par<br />
passages successifs en culture sur plusieurs types de cellules telles que les cellules<br />
amniotiques et les fibroblastes de poulet, les cellules de rein de mouton, de singe, de cochon,<br />
ou d’homme, et les cellules amniotiques humaines. Plusieurs vaccins à virus vivants atténués,<br />
tels que le vaccin contre la rubéole, les oreillons, la fièvre jaune, et la rougeole sont<br />
actuellement utilisés. Bien que ces vaccins soient de bons immunogènes, ils présentent<br />
certains désavantages liés à :<br />
- leur instabilité biochimique (virus vivant), d'où la nécessité d’utiliser des stabilisants<br />
qui peuvent être des sources de contamination et de respecter la chaîne de froid pour<br />
leur conservation<br />
- leur instabilité génétique qui expose le patient aux risques de réversion de la virulence<br />
- leur utilisation déconseillée chez certains sujet à risque telles que les femmes enceintes<br />
et les personnes immunodéprimées chez lesquels ils pourraient entraîner des maladies<br />
graves.<br />
De plus, le développement de vaccins vivants atténués efficaces contre certains virus<br />
s’avère très difficile. C’est le cas pour :<br />
- le virus de la grippe où les problèmes les plus couramment rencontrés sont l’existence<br />
de plusieurs sérotypes et de variations antigéniques. Cependant un vaccin vivant<br />
atténué efficace contre la grippe a été mis au point aux Etats-Unis (Nichol, 2001).<br />
- le VIH où le développement d’un vaccin rencontre des problèmes d’éthique<br />
- le papillomavirus qui ne pousse pas sur les cellules en culture.<br />
Ceci dit, le vaccin actuellement utilisé contre la rougeole est un vaccin vivant atténué qui<br />
jusqu’ici a été d’une efficacité indéniable. Depuis son utilisation dans les programmes élargis<br />
de vaccination, le nombre de cas de décès associés à la rougeole est passé de huit millions à<br />
moins d’un million par an dans le monde.<br />
A la fin des années 50, les travaux d’Enders et de son groupe ont abouti au<br />
développement d’un vaccin rougeoleux vivant atténué après 24 passages de la souche<br />
Edmonston sur des cultures primaires de cellules rénales humaines suivis de 28 passages<br />
28
II. La vaccination<br />
2. Les vaccins vivants atténués<br />
supplémentaires sur cellules amniotiques humaines et de six passages sur embryon de poulet,<br />
avant l’adaptation du virus sur culture de fibroblastes de poulet. Le vaccin initial Edmonston<br />
B breveté en 1963 était réactogène, donnant de la fièvre et des éruptions. Ces symptômes ont<br />
été réduits dans environ 50% des cas par l’administration concomitante de globulines. Après<br />
d’autres passages de la souche Edmonston sur des fibroblastes de poulet, une souche plus<br />
atténuée (Schwartz) fut obtenue et brevetée en 1965. Par la suite, les Etats-Unis, le Japon, la<br />
Yougoslavie, l’ex-URSS, et la Chine ont développé de nouvelles souches vaccinales hyperatténuées<br />
en utilisant les mêmes stratégies et avec des résultats similaires. Ces vaccins ont été<br />
mis au point soit à partir de souches Edmonston (AIK-C), Edmonston A (Schwartz),<br />
Edmonston B (Moraten, Edmonston-Zageb) ou à partir de nouvelles souches (Leningrad 16,<br />
CAM-70, Shanghai-191,TD-97) (Figure 6). Bien que la vaccination avec les souches hyperatténuées<br />
induise des taux d’anticorps plus bas qu’avec le vaccin Edmonston B ou l’infection<br />
naturelle, l’incidence des réactions cliniques est plus faible et ils ont donc été adoptés pour<br />
une large utilisation.<br />
L’utilisation de ces vaccins protège de façon efficace contre la rougeole. Cependant,<br />
certaines observations rendent nécessaire le développement de nouveaux vaccins :<br />
i) Les vaccins actuellement disponibles ne parviennent pas à bloquer complètement<br />
la transmission du virus dans la population.<br />
ii) On ne peut pas vacciner les enfants avant l’âge de neuf mois car la présence<br />
d’anticorps maternels réduit l’efficacité de la vaccination (Siber et al., 1993).<br />
Si de nouveaux vaccins sont mis au point, ils doivent non seulement résoudre ces deux<br />
problèmes mais aussi éviter de créer des formes aberrantes de la maladie qui s’observent dans<br />
le cas de l’administration de vaccins inactivés (Norrby et al., 1975) ou fortement dosés<br />
(Halsey, 1993).<br />
29
Figure 6 : Souches vaccinales utilisées pour la production de vaccin vivant atténué contre la rougeole, méhodes d ’atténuation et vaccin<br />
fabriqué par différents producteurs de vaccins en 1994 (adapté de Markowitz & Katz, 1994)<br />
Souche<br />
Souche<br />
RH<br />
AH<br />
AH<br />
RM<br />
FEP<br />
AIK- C<br />
Institut Kitatsato, Japon<br />
Institut nationa , Japon<br />
FEP<br />
Edmonston A<br />
FEP<br />
SCHWARZ<br />
AH FEP<br />
FEP<br />
DH<br />
CIAEP<br />
FEP<br />
CIAEP<br />
FEP<br />
Edmonston B<br />
AIK- HDC<br />
Institut Razi, Iran<br />
Pasteur-Mérieux MSD, France<br />
Evans, Royaume-Uni<br />
Sclavo, Italie<br />
Institut de sérums et vaccins,<br />
Tchécoslovaquie<br />
Institut Cantacuzino, Roumanie<br />
Takeda, Japon<br />
Connaught<br />
Laboratoires Connaught, Canada<br />
Institut National de la Santé, Pakistan<br />
Moraten<br />
Merck,Sharpe and Dowe, USA<br />
RIVM, Pays-Bas<br />
Edmonston Zagreb<br />
Institut Suisse de Sérums et de Vaccins, Suisse<br />
Institut Indien de Sérum, Inde<br />
Institut d ’immunologie, Croatie<br />
Smith Kline et Beecham, Belgique<br />
FEP<br />
SCHWARZ F88<br />
Institut Suisse de Sérums et de Vaccins,<br />
Autres souches<br />
Souche<br />
Souche SHANGAI<br />
Souche TANABE<br />
RCG<br />
CJ<br />
RH<br />
AH<br />
FEP<br />
RS<br />
RH<br />
CIAEP<br />
MCP<br />
FEP<br />
RS<br />
RH<br />
CIAEP<br />
RCG<br />
LENINGRAD 16<br />
SHANGAI 191<br />
CAM-70 TD-97<br />
D.Mazai, Russie<br />
Institut de Rech. Mal. Inf.Parasit., Bulgarie<br />
Institut Shangai, Chengdu, Lanzhou et Wuhan, Chine Biomanghuinos, Brésil<br />
Chiba Sérum, Japon<br />
Perum biofarma, Indonésie<br />
Fondation Rech. Mal. Microb.,<br />
En italique : Noms des producteurs et<br />
Type de cellules utilisées pour l ’atténuation du virus : AH(amnios humain), CIAEP(Cavité intra-amniotique de l ’embryon de poulet), CJ (caille japonaise), DH (cellules diploïdes humaine)<br />
FEP (fibroblastes d ’embryon de poulet), MCP (membrane chorioallantoïque de poulet), RCG (Rein de cochon de Guinée), RH (rein humain), RM (rein de mouton), RS (rein de singe)
II. La vaccination<br />
3. Les nouvelles aproches de vaccination<br />
II.3 LES NOUVELLES APPROCHES <strong>DE</strong> VACCINATION<br />
II.3 1. Le vaccin actuel : quelques difficultés rencontrées<br />
Le problème de mortalité croissante due à la rougeole observée chez les nourrissons dans<br />
les pays en développement, a stimulé les efforts de lutte contre l’action négative des anticorps<br />
maternels sur la vaccination. En effet, les anticorps maternels empêchent la réponse anticorps<br />
en bloquant les sites antigéniques de la souche vaccinale. Afin de résoudre ce problème,<br />
différentes approches ont été considérées :<br />
- La vaccination par aérosol. Le vaccin vivant atténué a été administré par voie<br />
muqueuse ou respiratoire sous forme d’aérosol. En fait, les anticorps maternels étant<br />
plutôt sériques, très peu sont présents sur les surfaces des muqueuses. On espérait<br />
alors que le vaccin vivant administré par aérosol aurait un certain avantage. Bien que<br />
les études de vaccination par aérosol aient rencontré des problèmes pratiques pour<br />
l’administration du vaccin (Cutts et al., 1997), des résultats intéressants ont été<br />
obtenus dans la majorité des cas. Une étude réalisée en Afrique du Sud a montré que<br />
le taux de séroconversion après vaccination avec la souche Edmonton-Zagreb<br />
administrée par aérosol (85%) était supérieur à celui obtenu avec la même souche<br />
administrée par voie sous-cutanée (79%) (Dilraj et al., 2000). Des résultats similaires<br />
ont été obtenus dans d'autres études réalisées aux Etats-Unis (Sabin, 1983 ; Sabin et<br />
al., 1985). La vaccination par aérosol a été utilisée avec succès dans de grandes<br />
campagnes de vaccination au Mexique (Fernandez-de-Castro et al., 1997). Mais tous<br />
ces résultats seraient dépendants du type d’appareil employé. Dans les études décrites<br />
ci-dessus, le vaccin reconstitué a été utilisé, ce qui pose le problème de maintien de la<br />
chaîne de froid. La recherche actuelle est orientée vers le développement d’un appareil<br />
permettant d’utiliser directement le vaccin lyophilisé et facile à manipuler sur le<br />
terrain (LiCalsi et al., 1999).<br />
- Les vaccins à hauts titres. Le vaccin standard contient environ 10 3 à 10 4 unités<br />
infectieuses par dose. Il a été proposé et approuvé par l’OMS (WHO, 1990) que des<br />
doses de vaccins à hauts titres (10 4.0 à 10 5.0 ) soient administrées aux enfants dès l’âge<br />
de 6 mois. On espérait ainsi pouvoir lutter contre l’effet inhibiteur des anticorps<br />
maternels dans la réponse immunitaire. Les vaccins à hauts titres ont été utilisés pour<br />
immuniser des enfants âgés de 4 à 6 mois dans plusieurs pays dont le Sénégal, la<br />
31
II. La vaccination<br />
3. Les nouvelles aproches de vaccination<br />
Guinée-Bissau, Haïti, la Gambie, le Mexique et le Pérou. La majorité des études<br />
montrent que, par rapport au vaccin standard, les vaccins à hauts titres augmentent les<br />
taux de séroconversion. En Gambie, où des doses de vaccins contenant 4.10 4 unités<br />
infectieuses ont été utilisées chez les enfants de 4 à 6 mois, on a obtenu un taux de<br />
séroconversion de 100% (Whittle et al., 1984). Cependant, en Guinée-Bissau, on<br />
n’observe pas de différence significative entre les vaccins Schwarz standard et hauts<br />
titres (Aaby et al., 1996). Cependant, un suivi à long terme montre un taux élevé de<br />
mortalité chez les enfants ayant reçu le vaccin à hauts titres. En effet, une étude menée<br />
au Sénégal montre que par comparaison aux enfants ayant reçu le vaccin standard, le<br />
risque de décès est de 1,51 et 1,80 chez les enfants ayant reçu respectivement le vaccin<br />
Schwarz et Edmonston-Zagreb à hauts titres (Garenne et al., 1991). Des résultats<br />
similaires ont été obtenus en Haïti (Halsey, 1993). En revanche, ce phénomène n’a pas<br />
été observé en Gambie, ni au Mexique ou au Pérou (Halsey, 1993). A ce jour, aucun<br />
lien de cause à effet n’a été démontré entre ce vaccin et les décès observés.<br />
Un autre problème majeur du vaccin contre la rougeole est celui de la stabilité du vaccin.<br />
Avant 1980, les vaccins rougeoleux étaient thermolabiles ce qui rendait leur emploi difficile<br />
dans les régions tropicales (Hendrickse & Montefiore, 1975). La mise au point de stabilisants<br />
et la formulation des exigences de l’OMS à propos de la stabilité thermique des vaccins<br />
rougeoleux lyophilisés (WHO, 1981), ont considérablement amélioré la qualité des vaccins<br />
depuis 1980. Cependant, les vaccins reconstitués perdent rapidement leur activité à<br />
température ambiante entre 22°C et 25°C (environ 50% de leur activité en une heure).<br />
Normalement, le vaccin lyophilisé, une fois reconstitué, doit être utilisé rapidement. Ceci<br />
entraîne non seulement un problème de gaspillage sur le terrain, pendant les grandes<br />
campagnes où les vaccins sont conditionnés par ampoules de plusieurs doses, mais aussi un<br />
problème de stockage, surtout dans les pays en développement où la chaîne de froid n’est pas<br />
toujours maintenue. A cause de ces problèmes, l’OMS s’intéresse désormais aux techniques<br />
d’administration directe du vaccin lyophilisé non reconstitué, soit par aérosol directement<br />
dans les cavités nasales ou orales, soit avec un appareil à pression pour administrer le vaccin<br />
dans la peau. Ces nouvelles approches pourraient résoudre non seulement le problème de la<br />
stabilité du vaccin, mais, seraient aussi un moyen d’éviter l’utilisation des seringues, qui sont<br />
une source de contamination et posent un problème de traitement des déchets dans les pays en<br />
développement.<br />
32
II. La vaccination<br />
3. Les nouvelles aproches de vaccination<br />
II.3 2. Les nouveaux vaccins<br />
Les différentes approches utilisées jusqu’ici n’ayant pas été suffisamment crédibles, il est<br />
question aujourd'hui de développer un vaccin qui puisse être utilisé pour éradiquer la<br />
rougeole. Dans le cadre du programme d’éradication du virus de la poliomyélite, qui avance<br />
avec beaucoup de succès, deux types de vaccins sont disponibles. Un vaccin atténué qui est<br />
utilisé pour l’éradication des souches sauvages et un vaccin inactivé qui sera utilisé après<br />
l’éradication des souches sauvages. Par contre, dans le programme de vaccination contre la<br />
rougeole, il n’y a qu’un seul type de vaccin. De plus, il y a un nombre croissant d’enfants<br />
immunodéprimés qui développeraient des complications liées à l’utilisation de vaccin vivant.<br />
En suivant l’exemple de la lutte contre la poliomyélite, une nouvelle génération de vaccins<br />
contre la rougeole pourrait être utilisée une fois l’éradication achevée, pour stimuler la<br />
mémoire immunologique pendant la phase finale. Conjointement à la mise au point de<br />
nouveaux vaccins, on doit accéder à une meilleure compréhension des mécanismes<br />
immunitaires fondamentaux nécessaires à la protection ou responsables de l’induction d’une<br />
réponse immune aberrante.<br />
Les nouveaux vaccins ont pour caractéristique principale l’utilisation de quelques<br />
protéines de l’agent pathogène pour la fabrication du vaccin. Afin de fabriquer des vaccins qui<br />
contiennent seulement une partie du spectre des protéines virales, il est nécessaire de<br />
connaître celles qui sont importantes pour la protection. Plusieurs études ont montré que :<br />
- l’administration passive des anticorps protège les enfants contre la rougeole<br />
(Krugman, 1963). Il a été montré dans un modèle animal murin que les anticorps<br />
monoclonaux dirigés contre l’une des glycoprotéines, l’hémagglutinine ou la protéine<br />
de fusion protègeraient in vivo (Giraudon & Wild, 1985 ; Malvoisin & Wild, 1990)<br />
- l’immunité cellulaire aurait un rôle important dans la protection puisque les enfants<br />
déficients en cellules T présentent des complications au cours de l’infection par le<br />
virus de la rougeole (Lipsey et al., 1967)<br />
- les cellules T cytotoxiques (CTL) sont présentes chez les enfants après l’infection par<br />
le virus de la rougeole (van-Binnendijk et al., 1990). De plus, il a été montré dans le<br />
modele animal que l’immunisation avec un épitope de CTL protège contre la rougeole<br />
(Beauverger et al., 1996)<br />
Un vaccin efficace contre la rougeole qui remplirait les critères ci-dessus devrait contenir<br />
au moins les deux glycoprotéines virales afin d’induire les anticorps neutralisants. Il devrait<br />
33
II. La vaccination<br />
3. Les nouvelles aproches de vaccination<br />
probablement contenir aussi la nucléoprotéine puisqu’elle est responsable, dans la plupart des<br />
cas, de la forte réponse CTL.<br />
Plusieurs catégories de vaccins ont été ou sont actuellement développées : les vaccins utilisant<br />
les vecteurs viraux, les ISCOM (Immunes-Stimulating Complex), et les vaccins ADN.<br />
II.3 2.a. Les vaccins utilisant les vecteurs viraux<br />
L’idée est d’insérer les gènes viraux dans un autre virus atténué pour présenter<br />
l’antigène au système immunitaire. Parmi ces vecteurs, on peut citer les poxvirus tels que le<br />
virus de la vaccine qui présente l’avantage d’être infectieux pour tous les mammifères, ou<br />
encore les poliovirus (hôtes naturels de l’intestin) et les adénovirus (hôtes de l’appareil<br />
respiratoire suppérieur) qui sont intéressants pour la vaccination par voie muqueuse. Les<br />
rétrovirus sont également utilisés en thérapie génique.<br />
Les vaccins recombinants de la vaccine contre la rougeole induisent des réponses<br />
immunes chez les animaux. Des souris immunisées avec des recombinants exprimant soit<br />
l’une des protéines (H, F ou N) du virus de la rougeole, soit les trois protéines contenues dans<br />
le même recombinant, induisent à la fois des anticorps neutralisants (H et F) et des CTL (H et<br />
N) (Wild et al., 1992 ; Beauverger et al., 1993). Des résultats similaires ont été obtenus chez<br />
le singe (van Binnendijk et al., 1997). Dans les deux modèles, la présence d’anticorps<br />
administrés passivement supprime la réponse humorale mais pas la réponse CTL (Galletti et<br />
al., 1995).<br />
L’un des problèmes de l’utilisation de la vaccine comme vecteur est le risque qu’il soit<br />
pathogène chez les personnes immunodéprimées. Pour résoudre ce problème, un pox virus<br />
aviaire (ALVAC) a été utilisé comme vecteur (Taylor et al., 1992). Ce dernier possède une<br />
infection défectueuse dans les cellules de mammifères. Les virus recombinants ALVACrougeole<br />
induisent une réponse immunitaire dans les modèles animaux, mais cette réponse est<br />
fonction de la dose de vaccin utilisée à cause de la nature de l’infection (Taylor et al., 1992).<br />
Avec un second vecteur NYVAC, obtenu à partir de la souche New-York du virus de la<br />
vaccine, dans laquelle les gènes de virulence ont été supprimés et dont la réplication est<br />
défectueuse dans les cellules humaines, on a obtenu des résultats similaires à ceux observés<br />
avec ALVAC.<br />
34
II. La vaccination<br />
3. Les nouvelles aproches de vaccination<br />
II.3 2.b. Les ISCOMs<br />
Les ISCOMs (Immune-Stimulating Complex) sont constitués d’une matrice lipidique<br />
dans laquelle sont introduites des protéines membranaires. La matrice est composée d’un<br />
mélange de lipides tels que le QuilA qui est une saponine possédant des propriétés adjuvantes,<br />
de cholestérol et d’autres lipides. Les protéines membranaires, après solubilisation par un<br />
détergent sont incorporées dans la matrice grâce à des interactions hydrophobes. L’utilisation<br />
des ISCOMS comme technique de présentation antigénique des protéines membranaires dans<br />
la vaccination a été développée dans les années 1980 (Morein et al., 1984) et est actuellement<br />
utilisée pour certains vaccins vétérinaires.<br />
Il a été montré que les ISCOMs contenant les deux glycoprotéines du virus de la<br />
rougeole induisent des taux élevés d’anticorps chez le singe. Contrairement à ce qui se passe<br />
avec le pox virus comme vecteur, la réponse humorale n’est pas affectée par la présence<br />
d’anticorps administrés passivement (van Binnendijk et al., 1997). Bien que le taux initial<br />
d’anticorps ne soit pas maintenu, les singes sont encore protégés un an après l’immunisation.<br />
Ce type de vaccins, bien que plus efficaces que les précédents, est recommandé pour des cas<br />
exceptionnels seulement, car leur coût de production reste élevé.<br />
II.3 2.c. La vaccination ADN<br />
Le vaccin ADN est constitué d’un vecteur d’expression plasmidique qui contient le<br />
gène codant pour la protéine d’intérêt. Après inoculation in vivo, cette protéine est exprimée<br />
et permet l’induction d’une réponse immunitaire spécifique. La vaccination ADN est l’une<br />
des approches récentes dans la lutte contre la rougeole.<br />
Il a été montré que les plasmides contenant les ADN complémentaires de H,F et N,<br />
exprimés à partir d’un promoteur du CMV (cytomégalovirus), induisent une bonne réponse<br />
humorale et CTL chez la souris (Cardoso et al., 1998). Les mécanismes immunologiques de<br />
base impliqués dans la vaccination ADN ne sont pas bien connus. Ainsi, l’administration de<br />
l’ADN et son expression dans les tissus appropriés seront fondamentales pour l’induction<br />
d’une bonne réponse immune. Il a été montré que :<br />
- l’inoculation intramusculaire de l’ADN induit une réponse Th1 mais requiert jusqu'à<br />
100g d’ADN par souris (Cardoso et al., 1996)<br />
35
II. La vaccination<br />
4. Position actuelle de l'OMS<br />
- l’inoculation intradermique de l’ADN précipité sur des billes d’or à l’aide d’un<br />
pistolet à particules ou « gene-gun » augmente l’efficacité de cent fois mais<br />
malheureusement, la réponse immune cellulaire induite est plutôt de type Th2.<br />
Il serai intéressant dans le futur de cibler les tissus appropriés, où la protéine sera<br />
efficacement exprimée et présentée aux cellules du système immunitaire afin d’obtenir une<br />
réponse immune cellulaire correcte (Th1).<br />
Bien que le vaccin ADN soit l’un des meilleurs espoirs du domaine de la vaccination, il<br />
est tout de même important de signaler que le problème de sécurité du vecteur lui-même n’est<br />
pas encore résolu et que jusqu’ici, aucun vaccin ADN n’est prêt à être approuvé par les<br />
autorités (Cichutek, 2000).<br />
II.4. POSITION ACTUELLE <strong>DE</strong> L’OMS : STRATEGIE <strong>DE</strong> VACCINATION<br />
La rougeole est considérée comme une maladie éradicable pour plusieurs raisons :<br />
- il existe un seul sérotype du virus de la rougeole, ce qui est un atout par rapport au<br />
virus de la poliomyélite qui compte trois sérotypes mais qui est pourtant en voie de<br />
disparition<br />
- il existe un seul réservoir naturel qui est l’homme<br />
- la rougeole a une expression clinique très marquée<br />
- il existe un vaccin efficace contre la rougeole<br />
Cependant, la rougeole s’avère difficile à contrôler à cause de sa nature très contagieuse,<br />
de sa ressemblance avec des maladies causées par d’autres agents tels que le virus de la<br />
Dengue, le virus d’Epstein Barr, les parvovirus et bien d’autres virus (Nur et al., 1999). Ces<br />
problèmes peuvent être surmontés et plusieurs efforts sont actuellement dirigés vers<br />
l’élimination de la rougeole. L’élimination est définie comme une interruption soutenue de la<br />
transmission du virus dans une zone géographique donnée, tout en se protégeant de la<br />
réintroduction du virus grâce au maintien de la vaccination.<br />
Le vaccin actuel est efficace à 95 % quand il est administré dans les conditions optimales.<br />
Ceci suggère qu’en utilisant une seule dose de vaccin, il y aura accumulation d’enfants<br />
susceptibles dans la population, même lorsque tous les enfants auront été vaccinés. L’OMS<br />
recommande de vacciner les enfants entre 9 et 15 mois. Dans les pays industrialisés, les<br />
enfants sont vaccinés entre 12 et 15 mois, l’efficacité de la vaccination dans cette tranche<br />
d’âge est de 90 à 95 % . Par contre, dans les pays en voie de développement où les enfants<br />
sont exposés très tôt à la maladie, il est conseillé d’administrer le vaccin à l’âge de 9 mois<br />
36
II. La vaccination<br />
4. Position actuelle de l'OMS<br />
(WHO, 1986). Or l’efficacité de la vaccination à cet âge n’est que de 85% (Huang et al.,<br />
1990), ce qui augmente le nombre d’enfants susceptibles dans ces populations. Pour résoudre<br />
ce problème, plusieurs pays ont opté pour l’administration de deux doses de vaccins, la<br />
première entre 9 et 15 mois, et la deuxième à l’âge scolaire. Ceci a permis à plusieurs pays<br />
donc la Finlande et les Etats-Unis d’éradiquer le virus sauvage.<br />
La stratégie adoptée par l’OMS pour lutter contre la rougeole comprend trois phases : une<br />
phase de contrôle, une phase de prévention des épidémies et une phase d’élimination.<br />
La phase de contrôle consiste en une réduction significative de cas de rougeole et de<br />
mortalité associée, grâce à l’augmentation de la couverture vaccinale.<br />
La phase de prévention des épidémies est basée sur l’accentuation de la surveillance,<br />
afin de détecter des changements épidémiologiques de la maladie, comme par exemple<br />
le changement de la tranche d’âge où les enfants sont atteints de rougeole<br />
(augmentation des cas de rougeole chez les enfants plus âgés), les changements dans<br />
la fréquence des épidémies (durée entre deux épidémies rallongée par rapport à la<br />
période pré-vaccinale) et l’identification des populations à haut risque afin de les<br />
immuniser. Pour réaliser ce travail, le programme d’immunisation doit être complété<br />
par les journées de vaccination nationales où les enfants sont vaccinés quel que soit<br />
leur statut vaccinal initial.<br />
La phase d’élimination consiste à maintenir le nombre d’individus susceptibles en<br />
dessous du seuil critique requis pour soutenir la transmission du virus. La maintenance<br />
d’un taux d’incidence bas à l’intérieur d’un pays pourra conduire à une éventuelle<br />
suppression des infections naturelles.<br />
L’expérience américaine constitue une preuve que l’éradication de la rougeole est<br />
faisable. En effet, au début des années 90, la rougeole était encore endémique en Amérique du<br />
Sud. Les campagnes soutenues de vaccination ont permis une baisse historique du nombre de<br />
cas de rougeole si bien qu’en 1996, il n’y avait plus de rougeole en Amérique du Sud.<br />
Cependant, en 1997 on constatait une recrudescence des cas de rougeole due à des souches<br />
importées. Ces observations suggèrent que pour qu’un programme régional soit complètement<br />
efficace, il est important qu’un effort global et concerté soit mis en place. La campagne<br />
actuelle de lutte contre la rougeole devrait tirer des leçons de cette expérience américaine.<br />
37
CHAPITRE III. ETU<strong>DE</strong>S EPI<strong>DE</strong>MIOLOGIQUES<br />
<strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong><br />
38
III. Etudes épidémiologiques<br />
1. Infection au sein d'une population non vaccinée<br />
III.1. PROPAGATION <strong>DE</strong> L’INFECTION AU SEIN D’UNE POPU<strong>LA</strong>TION NON<br />
VACCINEE<br />
Dans une population non vaccinée, le virus de la rougeole se propage avec des<br />
conséquences plus ou moins importantes en fonction de la durée et de la fréquence de contact<br />
entre le contaminant et le contaminé.<br />
III.1.1. Niveau d’exposition bas<br />
Dans les pays industrialisés, où de bonnes conditions socio-économiques permettent<br />
d’éviter la promiscuité, les cas de rougeole sont rares. La distribution des cas par groupe d'âge<br />
montre que la maladie survient d'abord chez les enfants en âge pré-scolaire et s'étend au reste<br />
de la population. En effet, au cours de l'épidémie de rougeole survenue aux Etats-Unis en<br />
1986, on a constaté que la fréquence d'attaque était élevée chez les enfants de moins d'un an et<br />
décroissait avec l'âge : 40% des cas étaient observés chez les enfants de moins de 16 mois<br />
parmi lesquels 65% des cas chez les enfants de moins de 12 mois (Markowitz et al., 1989). De<br />
plus, la fréquence d'attaque de la maladie était 16 fois plus élevée chez les enfants vivant dans<br />
les cités ou les conditions socio-économiques sont médiocres, par rapport aux enfants de<br />
familles aisées. Ces observations montrent que la maladie sévit chez les jeunes enfants<br />
n'ayant pas atteint l'âge de la vaccination et dans les populations n'ayant pas accès aux<br />
services de santé. Les malades développent une rougeole d’évolution favorable comme nous<br />
l’avons décrit dans le paragraphe I.6. (pathologie). En général, le système immunitaire<br />
élimine l'infection de l'organisme, ce qui n’est pas le cas dans les pays en développement où<br />
la promiscuité augmente le taux de mortalité due à la rougeole.<br />
III.1.2. Niveau d’exposition élevé<br />
A la fin du siècle dernier, le taux de mortalité associé à la rougeole était élevé en<br />
Europe et aux Etats unis. En 1897, D. Williams remarque que les causes majeures de cette<br />
mortalité sont la promiscuité et une ventilation insuffisante (Williams, 1897). Dans les pays<br />
en développement où la mortalité due à la rougeole reste encore un problème de santé, des<br />
études de communauté montrent que la promiscuité et l’intensité d’exposition au virus de la<br />
rougeole sont des déterminants majeurs de cette mortalité (Aaby et al., 1984).<br />
39
III. Etudes épidémiologiques<br />
1. Infection au sein d'une population non vaccinée<br />
En effet, une étude menée en Guinée-Bissau montre que la disposition des habitations<br />
de familles Africaines favorise la promiscuité, surtout dans les familles polygamiques où la<br />
concentration de plusieurs cas de rougeole dans la même case entraîne des taux élevés de<br />
mortalité. De telles observations ont été faites dans les institutions surpeuplées (Godfred,<br />
1928), dans les camps de concentration et les camps de réfugiés (Ryan, 1976) et dans les<br />
campements militaires (Picken, 1921).<br />
Dans ces différentes études, on a constaté que la rougeole est plus sévère dans les cas<br />
secondaires que dans les cas index (cas index = premier cas de rougeole survenu dans une<br />
population donnée ; cas secondaire = cas de rougeole survenu dans les 6 jours après<br />
identification du cas index et ayant eu un contact avec l’index). En fait, le cas secondaire<br />
reçoit une forte dose de virus à cause du contact étroit avec le cas index. La maladie dans ce<br />
cas évolue alors différemment. On observe notamment :<br />
i) Une diminution de la période d’incubation. L’expérimentation animale avec le virus<br />
de la rougeole montre qu’une forte dose de virus entraîne une diminution de la<br />
période d’incubation et un taux de mortalité élevé chez la souris (Wear et al., 1968).<br />
De même, les expériences de dosage de virus dans la vaccination contre la rougeole<br />
ont montré que la durée de la période d’incubation est inversement proportionnelle à<br />
la dose de virus utilisée (McCrumb et al., 1961).<br />
ii) Une augmentation du taux de complications. En fait, il est possible que le cas index<br />
transmette d’autres agents pathogènes en plus du virus de la rougeole, ce qui entraîne<br />
des complications. De plus, les cas secondaires reçoivent de fortes doses de virus. En<br />
effet il a été suggéré que de fortes doses de virus dans le vaccin contre la rougeole<br />
induiraient l’immunosuppression (Holt et al., 1993), ce qui expliquerait le taux de<br />
décès élevé observé chez les enfants ayant reçu des vaccins à hauts titres. Dans le<br />
même ordre d’idées, il a été montré que la rougeole atypique était due à une<br />
production exagérée de cytokines de type 2 entraînant un déséquilibre de cytokynes<br />
au cours d'une infection subséquente (Polack et al., 1999). Ces observations<br />
pourraient expliquer le fait que la maladie soit plus sévère chez les cas secondaires.<br />
Ces observations montrent une ressemblance entre les conditions actuelles dans<br />
certains pays en développement et les pays industrialisés au début du siècle où régnait la<br />
promiscuité et où le taux de mortalité dû à la rougeole était élevé. Cependant, les différences<br />
liées au fait que la polygamie et de larges habitations familiales n’ont jamais existé en Europe<br />
et aux Etats-Unis pourraient expliquer pourquoi la rougeole est plus sévère chez les enfants<br />
40
III. Etudes épidémiologiques<br />
2. Propagation au sein d'une population vaccinée<br />
africains. Il ressort de ces observations que pour mener une lutte efficace contre la rougeole<br />
dans les pays en développement, en plus de la vaccination, il est primordial d’entraver la<br />
forte exposition au virus et la transmission de la maladie à l’intérieur des maisons.<br />
III.2. PROPAGATION <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong> AU SEIN D’UNE POPU<strong>LA</strong>TION VACCINEE<br />
La stratégie utilisée au Etats-Unis dans les années 1980 pour éliminer le virus<br />
endogène était basée sur le principe qu’il ne peut y avoir d’épidémie quand 99% d’enfants de<br />
moins de 18 ans ont reçu une dose de vaccin (Frank et al., 1985). Cependant, plusieurs études<br />
ont rapporté des cas d’épidémies de rougeole dans des populations vaccinées.<br />
Une épidémie de rougeole s’est déclarée au Etats Unies dans une population où 99%<br />
des enfants avaient été vaccinés (Gustafson et al., 1987). Des observations similaires ont été<br />
faites au Sénégal dans une population ayant une couverture vaccinale de 81% (Whittle et al.,<br />
1999b), ainsi qu’au Texas où 95% des enfants étaient vaccinés (Edmonson et al., 1990). Ces<br />
observations montrent que le petit nombre d’individus non vaccinés présents dans ces<br />
populations est capable de soutenir la transmission du virus chez plusieurs personnes. Le fait<br />
que le virus se propage dans une population ayant une couverture vaccinale aussi élevée<br />
pourrait s’expliquer par un échec primaire de vaccination (Cherry et al., 1973),<br />
particulièrement quand le vaccin a été ;<br />
- administré en présence des anticorps contre la rougeole (Barrata et al., 1970).<br />
- stocké et administré dans de mauvaises conditions (Wyll & Witte, 1971)<br />
- administré aux enfants de moins de 12 mois (Shaby et al., 1977)<br />
Du point de vue clinique, la rougeole qui sévit dans les populations vaccinées est<br />
différente de la rougeole classique. Bien que le plus souvent asymptomatique, elle présente<br />
parfois des signes cliniques atténués. Dans les cas de rougeole cliniquement atténués, la phase<br />
des prodromes est plus courte, la toux, le coryza et la fièvre sont minimisés. On n’observe pas<br />
de taches de Köplick et l’éruption ne s’étend pas sur tout le corps (Cherry et al., 1973). Dans<br />
ce cas, le diagnostic clinique s’avère très difficile, ce qui augmente considérablement le<br />
nombre de personnes malades qui échappent au diagnostic clinique. Par conséquent, le virus<br />
de la rougeole peut circuler sans être détecté dans une population vaccinée, ce qui augmente<br />
faussement l’estimation de l’efficacité de la vaccination (Orenstein et al., 1988).<br />
Heureusement, les tests sérologiques en laboratoire, qui permettent de mettre en évidence la<br />
41
III. Etudes épidémiologiques<br />
2. Propagation au sein d'une population vaccinée<br />
présence d’anticorps dans le sérum, et le développement des techniques de biologie<br />
moléculaire (PCR, séquençage) permettant de mettre en évidence la présence d’ARN viral<br />
dans les lymphocytes de patients asymptomatiques aident à remédier aux problèmes cliniques<br />
(Chen et al., 1990 ; Sonoda & Nakayama, 2001). Bien que les tests sérologiques soient<br />
utilisés régulièrement dans la confirmation des cas de rougeole, les techniques de biologie<br />
moléculaire qui nécessitent un équipement coûteux ne sont pas encore utilisées dans la routine<br />
et restent inaccessibles dans les pays en développement.<br />
Du point de vue épidémiologique, la rougeole est connue comme une maladie infantile<br />
dont la cible est le plus souvent le nourrisson. Cependant, dans une population vaccinée, on<br />
constate que les premiers cas de rougeole se déclarent chez les adolescents, puis la maladie<br />
s’étend aux plus jeunes. Le fait que la rougeole se propage chez des adolescents pourrait<br />
s’expliquer par le fait que :<br />
les adolescents transmettent plus efficacement l’infection que les nourrissons. En<br />
effet, étant donné que le virus se transmet par les gouttelettes de sécrétion<br />
respiratoire, il a été suggéré que la mobilité élevée des adolescents, les activités<br />
sportives et extrascolaires (soirées dansantes) auraient un rôle important dans la<br />
transmission de la maladie dans cette tranche d’âge (Gustafson et al., 1987).<br />
l’immunité aurait disparu avec le temps (échec secondaire de la vaccination). En<br />
effet, plusieurs études mettent en évidence une diminution significative du taux<br />
d’anticorps avec le temps (Weiner et al., 1977 ; Christenson & Bottiger, 1994).<br />
Cependant, l'incidence due à la rougeole est plus faible dans les populations vaccinées<br />
que dans les populations non vaccinées (Gustafson et al., 1987), ce qui suggère qu’une<br />
immunité cellulaire résiduelle induite par la vaccination persiste après la disparition des<br />
anticorps.<br />
On se trouve ici face à un paradoxe entre la grande efficacité du vaccin contre la<br />
rougeole et l’apparition des épidémies soutenues au sein des populations vaccinées. Ce<br />
problème peut être résolu soit en augmentant l’efficacité du vaccin et de la couverture<br />
vaccinale par rapport à ce qui a été précédemment estimé (Markowitz et al., 1989), soit en<br />
appliquant une stratégie de vaccination à deux doses.<br />
Ces observations ont amené les Etats-Unis et plusieurs pays Européens à opter pour<br />
une stratégie de vaccination à deux doses, la première à 15 mois et la deuxième à l’âge<br />
scolaire. Depuis, les cas de rougeole dans la population vaccinée sont rares dans ces pays<br />
(Chen et al., 1990). Par contre, en Afrique, où les enfants reçoivent une seule dose de vaccin<br />
42
III. Etudes épidémiologiques<br />
3. Efficacité de la vaccination contre la rougeole<br />
en bas âge, les cas de rougeole restent fréquents dans les populations vaccinées (Samb et al.,<br />
1995 ; Whittle et al., 1999b).<br />
L’occurrence simultanée des cas de rougeole atténués et d’échecs secondaires de la<br />
vaccination suggère que l’efficacité de la vaccination serait suffisamment faible pour qu’il y<br />
ait des épidémies dans les populations vaccinées, ce qui remet en cause les facteurs permettant<br />
d’apprécier l’efficacité de la vaccination.<br />
III.3. EFFICACITE <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> VACCINATION CONTRE <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong><br />
L’infection naturelle par le virus de la rougeole confère une immunité à vie, comme il<br />
a été montré dans les îles Féroe, quand seuls les habitants ayant contractré la rougeole au<br />
cours d’une épidémie 65 ans auparavant ont échappé à l’infection (Panum, 1940). Cependant,<br />
l’hypothèse selon laquelle le vaccin vivant atténué induirait une protection à vie (Krugman,<br />
1983) a été remise en question après les épidémies de rougeole survenues chez des enfants<br />
ayant été vaccinés 15 ans auparavant (Gustafson et al., 1987 ; Samb et al., 1995).<br />
La vaccination contre la rougeole induit à la fois l’immunité cellulaire et l’immunité<br />
humorale. Bien que l’immunité à médiation cellulaire ait un rôle important dans l’élimination<br />
des cellules infectées, l’évaluation de l’efficacité de la vaccination est plutôt basée sur le<br />
dosage des anticorps, ceci à cause de la difficulté technique à examiner l’immunité cellulaire.<br />
III.4. REPONSE A <strong>LA</strong> VACCINATION : PRO<strong>DU</strong>CTION D’ANTICORPS<br />
La réponse à la vaccination dépend de plusieurs facteurs. Certains sont liés à l’hôte,<br />
tels que l’âge de l’hôte, son état nutritionnel et son état de santé. D'autres sont plutôt associés<br />
au vaccin tels que la souche de virus utilisée, la dose de vaccin, le mode d’administration et le<br />
programme de vaccination.<br />
III.4.1. Facteurs d’hôte<br />
III.4.1.a. Age de l’hôte<br />
L’un des problèmes rencontrés actuellement avec le vaccin contre la rougeole est qu’il<br />
n’est pas efficace quand il est administré aux enfants en dessous d’un certain âge. Cette<br />
réponse en fonction de l’âge dépend essentiellement des anticorps maternels pré-vaccinaux.<br />
En effet, il a été montré que les enfants possédant des anticorps maternels ont de plus faibles<br />
43
III. Etudes épidémiologiques<br />
4. Réponse à la vaccination<br />
taux d’anticorps post-vaccinaux que les enfants ne possédant pas d’anticorps maternels<br />
(Markowitz et al., 1990).<br />
Les premières études sur la décroissance des anticorps maternels ont suggéré que<br />
ceux-ci disparaissaient vers l’âge d'un an aux Etats-Unis (Krugman et al., 1965) et vers l’âge<br />
de six mois dans les pays en développement (MOH, 1977). Par la suite, l’emploi de tests plus<br />
sensibles ont permis de montrer que ces anticorps persistaient plusieurs mois de plus chez<br />
certains enfants et diminuaient l’efficacité de la vaccination (Albrecht et al., 1977). Les profils<br />
d’anticorps maternels des nourrissons varient selon :<br />
La durée de la gestation. Il a été montré que la grande partie du transfert<br />
d’anticorps maternels via le placenta se fait au cours des dernières semaines de<br />
grossesse (Toivanen et al., 1968). De ce fait, le taux d’anticorps maternels chez les<br />
nouveau-nés est directement proportionnel à la durée de la gestation. Une étude<br />
réalisée récemment en Inde a montré que le taux d’anticorps maternels dirigés<br />
contre le virus de la rougeole, à la naissance, est faible chez les enfants prématurés.<br />
De plus, ces enfants perdent plus vite leurs anticorps maternels que les enfants nés<br />
à terme (Rau et al., 2002). Dans cette étude, tous les enfants nés avant terme<br />
étaient séro-négatifs à l’âge de 5 mois. Une autre étude réalisée en Gambie a<br />
montré que la prématurité est directement liée à la réduction du transfert<br />
d’anticorps maternels contre le virus de la rougeole et d’autres agents pathogènes,<br />
tels que le virus de la varicelle, le virus respiratoire syncytial et l’herpes simplex<br />
virus de type 1 (Okoko et al., 2001). A cause de cette réduction du transfert<br />
d’anticorps maternels, les enfants prématurés sont vulnérables et prédisposés aux<br />
infections virales très tôt dans leur vie, c'est-à-dire avant l’âge de 6 mois dans le<br />
cas de la rougeole.<br />
Les régions géographiques. On a observé que le taux de décroissance des anticorps<br />
maternels dans différentes populations est inversement corrélé au niveau socioéconomique<br />
(Black et al., 1986). Ce déclin précoce des anticorps maternels dans<br />
les pays en développement s’explique par un catabolisme accru des anticorps<br />
passifs dû aux fréquentes infections touchant les nourrissons, une perte des<br />
anticorps dans la lumière intestinale lors des diarrhées, de faibles taux d’anticorps<br />
chez les mères et une moindre efficacité du passage transplacentaire des IgG<br />
antirougeoleuses maternelles (Black, 1989). En effet, une étude comparative des<br />
nouveau-nés allemands et des nouveau-nés nigérians a montré que le transfert des<br />
IgG maternelles totales et spécialement le transfert d’IgG antirougeoleuses à<br />
44
III. Etudes épidémiologiques<br />
4. Réponse à la vaccination<br />
<br />
l’enfant est plus efficace chez les Allemands que chez les Nigérians. Le taux<br />
d’anticorps dirigés contre le virus de la rougeole est deux fois plus élevé chez les<br />
enfants allemands que chez les enfants nigérians (Hartter et al., 2000). De plus, les<br />
anticorps maternels disparaissent plus vite chez les nigérians si bien qu’à l’âge de<br />
quatre mois, seulement 17% d’enfants nigérians sont encore protégés contre la<br />
rougeole.<br />
L’âge et le statut sérologique de la mère. A cause de l’utilisation de la vaccination<br />
à grande échelle, on observe dans la population des mères qui ont une immunité<br />
induite soit par la vaccination, soit par une infection naturelle (Kacica et al., 1995).<br />
Il a été montré que la vaccination induit un taux d’anticorps plus faible par rapport<br />
à l’infection naturelle (Krugman et al., 1965). Les mères immunisées par<br />
l’infection naturelle sont en général nées avant l’introduction de la vaccination,<br />
elles sont donc plus âgées et possèdent un taux d’anticorps élevé. Par contre, les<br />
mères immunisées par la vaccination sont plus jeunes, ont peu d’anticorps et sont<br />
donc prédisposées à transmettre un faible taux d’anticorps à leurs enfants<br />
(Markowitz et al., 1996 ; Zanetta et al., 2002). En effet, des études réalisées en<br />
Turquie ont montré que la durée de protection de l’enfant par les anticorps<br />
maternels est proportionnellement liée au taux d’anticorps de la mère (Mentitas et<br />
al., 2002). D’autres études réalisées sur les taux d’anticorps dans le cordon<br />
ombilical et chez les enfants ont permis de montrer que les anticorps maternels<br />
diminuent rapidement avec la jeunesse et le faible taux d’anticorps de la mère<br />
(Pabst et al., 1992 ; Maldonado et al., 1995),ce qui suggère que les enfants nés de<br />
mères vaccinées perdent plus tôt leurs anticorps maternels et sont donc<br />
susceptibles à un très jeune âge.<br />
Ces observations nous permettent de réaliser que le programme de lutte contre la<br />
rougeole dans les pays en développement se trouve confronté à un réel dilemme : maintenir la<br />
vaccination à un âge précoce, avec pour conséquence la perte de l’immunité, ou augmenter<br />
l’efficacité du vaccin en augmentant l’âge de la vaccination, avec pour risque d’augmenter la<br />
mortalité liée à la rougeole chez les nourrissons. Ce dilemme est de plus aggravé par la<br />
diminution du taux d’anticorps chez les enfants nés de mères immunisées par la vaccination et<br />
chez les enfants prématurés.<br />
45
III. Etudes épidémiologiques<br />
4. Réponse à la vaccination<br />
III.4.1.b. Etat nutritionnel de l’hôte<br />
Bien que Wesley et al., (1978) aient montré un retard de la réponse à la vaccination<br />
contre la rougeole chez les enfants sous-alimentés, plusieurs études ont mis en évidence des<br />
taux de séroconversion au moins aussi élevés chez les enfants souffrant de malnutrition que<br />
chez les enfants ayant une bonne alimentation (PAHO, 1982 ; Halsey et al., 1985), ce qui veut<br />
dire que l’état nutritionnel n’affecte pas le taux de séroconversion. Il est d’ailleurs conseillé de<br />
vacciner en priorité les enfants sous-alimentés (WHO, 1986) car la rougeole entraîne le risque<br />
de complications et aggrave l’état nutritionnel. En effet, il a été montré qu’il y a une perte<br />
appréciable de protéines au niveau de l’intestin chez des enfants souffrant de malnutrition,<br />
atteints de rougeole (Axton, 1975).<br />
III.4.1.c. Etat de santé de l’hôte<br />
Selon une étude réalisée aux Etats-Unis, la vaccination rougeole-oreillons-rubéole<br />
(ROR) induit des taux de séroconversion plus faible chez des enfants âgés de 15 à 18 mois,<br />
enrhumés, par rapport à des enfants non enrhumés (Krober et al., 1991). Ces résultats<br />
s’opposent à ceux d’études réalisées dans les pays en développement qui montrent que la<br />
vaccination antirougeoleuse des enfants souffrant de maladies à caractère aigu est efficace et<br />
sans danger. En Haïti, on a constaté un taux de séroconversion chez 81% de nourrissons<br />
enrhumés et 78% de nourrissons non enrhumés (Halsey et al., 1985) et au Rwanda, on a<br />
observé une séroconversion chez 81% des jeunes enfants malades et 80% des nourrissons en<br />
bonne santé (Ndikuyeze et al., 1988). On a constaté au cours d'enquêtes effectuées en Afrique<br />
du Sud (Harris, 1979) et au Costa Rica (De-Coto, 1983) que la vaccination des enfants<br />
malades hospitalisés a considérablement réduit l’incidence de la rougeole nosocomiale. Il est<br />
donc conseillé de vacciner les enfants souffrant de maladies aiguës, ce qui n’est pas le cas<br />
pour les personnes souffrant d’immunodéficience.<br />
En effet, la vaccination antirougeoleuse est généralement contre indiquée chez les<br />
personnes immunodéprimées à cause du risque de graves complications (ACIP, 1989),<br />
exception faite pour les enfants infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH).<br />
Les études de vaccination antirougeoleuse chez des sujets infectés par le VIH dans les pays en<br />
développement à l’âge de neuf mois (Oxtoby et al., 1989), à un âge plus avancé aux Etats-<br />
Unis (Onorato et al., 1988), et chez des adultes (Wallace et al., 1994) montrent que la réponse<br />
anticorps est plus faible par rapport à celle des sujets sains. Cependant, aucun effet indésirable<br />
n’ayant été constaté chez ces sujets après la vaccination, il est recommandé de vacciner les<br />
46
III. Etudes épidémiologiques<br />
4. Réponse à la vaccination<br />
enfants infectés par le VIH en deux fois. La première dose à l’âge de 6 mois et la seconde à 9<br />
mois, afin de les protéger le plus tôt possible (WHO/UNICEF, 1989).<br />
III.4.2. Facteurs génétiques<br />
Plusieurs études ont montré que des facteurs génétiques spécifiques affecteraient la<br />
réponse immunitaire suite à la vaccination. Une étude comparative réalisée au Canada entre<br />
les communautés Innu, Inuit (natifs du Canada) et les Caucasiens montre qu’après vaccination<br />
avec une dose de ROR (Rougeole, Oreillons, Rubéole), les enfants natifs du Canada ont un<br />
taux de séropositivité (83%) nettement supérieur à celui des Caucasiens (76%) (Poland et al.,<br />
1999). L’hypothèse émise pour expliquer cette différence est qu’il est probable que les natifs<br />
du Canada aient une origine immunogénétique différente et porteraient des gènes spécifiques<br />
du complexe majeur d’histocompatibilité associés à des taux élevé d’anticorps dirigés contre<br />
la rougeole (Poland, 1999).<br />
Il a été montré que la capacité de chaque individu à établir une réponse immunitaire à<br />
un antigène dépend de l’interaction entre les molécules H<strong>LA</strong> (Human Leucocyte Antigen) et<br />
l’antigène en question (Huston, 1997). Compte-tenu du fait que des allèles différentes de la<br />
molécule H<strong>LA</strong> se lient à différents antigènes, le polymorphisme génétique des molécules<br />
H<strong>LA</strong> va par conséquent influencer de façon spécifique la réponse immunitaire. En effet, des<br />
allèles spécifiques de H<strong>LA</strong> classe I et II (H<strong>LA</strong>-DRB, -DQA, -DPA et TAT) associés aux taux<br />
d’anticorps dirigés contre la rougeole ont été définis (Hayney et al., 1996,1997). Les gènes<br />
H<strong>LA</strong>-DPA1*0201 et H<strong>LA</strong>-DRB*03 sont fortement associés à la séronégativité (Poland et al.,<br />
1999) tandis que les allèles H<strong>LA</strong>-B7 et –B51 sont associés à une très forte réponse au vaccin<br />
antirougeoleux (Poland et al., 2002).<br />
Des études similaires ont montré que les allèles H<strong>LA</strong> spécifiques ont une influence<br />
significative sur la réponse immunitaire au vaccin contre l’hépatite B (Kruskall et al., 1992<br />
;Davenport et al., 1995). En particulier, les allèles H<strong>LA</strong>-DR3 et H<strong>LA</strong>-B8 sont très représentés<br />
chez les non-répondeurs au vaccin contre le virus de l’hépatite B (Vingershoets et al., 1995).<br />
III.4.3. Facteurs associés au vaccin<br />
La capacité du vaccin contre la rougeole à induire une réponse immunitaire varie selon<br />
plusieurs critères dont les principaux sont la souche vaccinale et la dose de vaccin.<br />
47
III. Etudes épidémiologiques<br />
4. Réponse à la vaccination<br />
III.4.3.a. La souche<br />
Les souches vaccinales utilisées dans différentes études dérivent toutes de la souche<br />
Edmonston (Figure 6).<br />
- La souche Edmonston-Zagreb (EZ) a été obtenue après plusieurs passages de la<br />
souche Edmonston B sur des cellules diploïdes humaines.<br />
- La souche Schwarz quant à elle dérive de la souche Edmonston A après passages<br />
supplémentaires sur des fibroblastes de poulet.<br />
- La souche AIK-C a été obtenue après plusieurs passages de la souche Edmonston sur<br />
les cellules d’amnios humains, les cellules de rein de mouton et sur les fibroblastes de<br />
poulet.<br />
Plusieurs études ont permis de comparer l’effet d’une même dose de vaccins<br />
Edmonston-Zagreb (EZ) et Schwarz administrée par voie sous-cutanée au même âge. Elles<br />
ont montré que le vaccin EZ induit des taux de séroconversion plus élevés que le vaccin<br />
Schwarz (Markowitz et al., 1990, Whittle et al., 1988b). La comparaison du vaccin AIK-C<br />
avec les vaccins EZ et Schwarz a montré que les vaccins AIK-C et EZ sont plus efficaces<br />
chez les jeunes enfants que la souche Schwarz. En effet, les réponses sérologiques induites<br />
par les vaccins AIK-C et EZ chez les enfants âgés de 5 mois sont identiques à celles induite<br />
par Schwarz à l’âge de 9 mois (Tidjani et al., 1989). D’autres études réalisées en Guinée-<br />
Bissau montrent que la souche EZ induit une bonne réponse anticorps en présence comme en<br />
l’absence d’anticorps maternels. Tandis qu’avec la souche Schwarz, bien qu’on obtienne les<br />
taux les plus élevés d’anticorps chez les enfants de plus de 9 mois, la réponse anticorps<br />
induite est moins bonne en présence d’anticorps maternels (Garly et al., 2001). De plus, après<br />
une revaccination avec la souche EZ, la réponse anticorps est augmentée, alors qu’avec la<br />
souche Schwarz, la réponse reste inchangée. Si les souches EZ et AIK-C donnent de meilleurs<br />
résultats, c’est peut-être parce-qu’elles ont subi des passages supplémentaires sur des cellules<br />
humaines, ce qui n’est pas le cas pour la souche Schwarz qui a été maintenue sur des cellules<br />
de poulet (Figure 6). D’autres études suggèrent l’existence possible d’une différence entre des<br />
vaccins produits à partir d’une même souche par différents producteurs. Il a été montré que le<br />
vaccin EZ produit au Mexique induisait des taux d’anticorps plus faibles que le vaccin produit<br />
à Zagreb (Markowitz et al., 1990).<br />
48
III. Etudes épidémiologiques<br />
4. Réponse à la vaccination<br />
III.4.3.b. La dose<br />
Des études réalisées chez des nourrissons possédant encore des anticorps maternels<br />
ont montré que les taux de séroconversion augmentent avec la dose de vaccin. Dans une<br />
étude réalisée en Gambie, l’utilisation de vaccins contenant 4.10 4 pfu par dose a entraîné un<br />
taux de séroconversion de 100%. Par contre, avec un vaccin contenant seulement 10 4 pfu par<br />
dose, on a un taux d’échec de 25% (Whittle et al., 1988a). Cependant, l’effet d’augmentation<br />
de la séroconversion est moins marqué avec le vaccin Schwarz qu’avec le vaccin EZ (Whittle<br />
et al., 1988b ; Markowitz et al., 1990).<br />
III.4.3.c. Le mode d’administration<br />
Bien que la mémoire systémique soit de longue durée, la mémoire immunologique<br />
muqueuse est par contre de plus courte durée. De ce fait, l'infection des voies muqueuses est<br />
possible malgré l'existence d'une immunité systémique chez un sujet vacciné. Le vaccin actuel<br />
est administré par voie sous-cutanée et se trouve confronté aux anticorps maternels.<br />
L’administration du vaccin par voie nasale ou en aérosol pourrait en principe stimuler de<br />
façon plus efficace la production d’IgA sécrétoires assurant une immunité locale en cas<br />
d’infection (Ogra et al., 1980). Dans la plupart des études, l’administration du vaccin en<br />
aérosol a entraîné des taux de séroconversion identiques à ceux qui sont obtenus avec une<br />
vaccination par voie sous-cutanée (Whittle et al., 1984).<br />
L’administration du vaccin par voie nasale a donné de bons résultats en Yougoslavie<br />
(Beck et al., 1986), en revanche, lors d’une étude réalisée au Kenya, elle a entraîné de faibles<br />
taux de séroconversion (Kok et al., 1983). La vaccination par voie sous-cutanée reste à ce jour<br />
le seul mode de vaccination conseillé.<br />
III.4.4. Facteurs liés au programme de vaccination<br />
La faible efficacité du vaccin pourrait dans certains cas être due à un mauvais maintien<br />
de la chaîne de froid (Cutts et al., 1990b). De même, les variations de volumes de vaccin<br />
administré avec les injecteurs à air comprimé peuvent aussi réduire l’efficacité du vaccin<br />
(Wassilak et al., 1985).<br />
Ces différents facteurs diminuent ou inhibent la production d’anticorps. Cependant,<br />
dans le cas où il y aurait production d’anticorps, on peut se poser la question de savoir si la<br />
production d’anticorps chez un individu signifie qu'il est protégé. Si oui quelle est la durée de<br />
la protection?<br />
49
III. Etudes épidémiologiques<br />
5. Protection conférrée par la vaccination<br />
III.5. PROTECTION CONFEREE PAR <strong>LA</strong> VACCINATION<br />
Pour évaluer l’efficacité de la vaccination contre la rougeole, on regarde la proportion<br />
de personnes vaccinées protégées contre la maladie et la durée de cette protection. Pour<br />
définir la protection contre la maladie, on tient compte de deux aspects :<br />
- l’aspect sérologique, où l'on considère la séroconversion qui suit la vaccination<br />
comme équivalente à la protection contre la maladie.<br />
- l’aspect épidémiologique, où l'on estime l’efficacité du vaccin comme le pourcentage<br />
de réduction de l’incidence de la maladie pouvant être imputé à la vaccination.<br />
Des études sérologiques ont mis en évidence des taux de séroconversion allant de 95 à<br />
98% (Yeager et al., 1977). Certaines études sur le terrain concernant l’efficacité du vaccin<br />
estiment que la protection est de 85% environ (Hull et al., 1983). Elle est encore plus faible<br />
lorsque l’on constate de mauvaises pratiques de vaccination (Cutts et al., 1990a). Ces résultats<br />
sont inférieurs aux taux de séroconversion cités ci-dessus et aux estimations de l’efficacité du<br />
vaccin (Davis et al., 1987). Au vu de ces résultats, nous pouvons dire que séroconversion<br />
n’est pas synonyme de protection. Il existerait un taux protecteur d’anticorps en dessous<br />
duquel l'individu n’est pas protégé.<br />
III.5.1. Taux protecteur d’anticorps<br />
Les anticorps produits après immunisation sont dirigés contre différents antigènes. Les<br />
anticorps dirigés contre les protéines F et H sont neutralisants et sont donc directement liés au<br />
niveau de protection. Cependant, comme la protéine N est la plus abondante et est très<br />
antigénique, le taux d’anticorps dirigé contre cette protéine est en général plus élevé, mais ces<br />
anticorps ne sont pas protecteurs contre l’infection.<br />
Différents tests sérologiques ont été développés pour déterminer le taux d’anticorps<br />
protecteur. Le test d’inhibition de l’hémagglutination, le plus communément utilisé, s’est<br />
avéré peu sensible et pas adapté à un grand nombre d’échantillon (Enders-Ruckle, 1965). Le<br />
test de neutralisation des plaques et le test ELISA sont plus sensibles que le premier (Albrecht<br />
et al., 1981 ; Kirsten et al., 1984) et sont de plus en plus utilisés. Bien que le test ELISA soit<br />
plus facile, rapide (résultats dans les 3 heures qui suivent la réception du sérum) et moins<br />
cher, il est cependant moins spécifique et risque d’avoir moins de corrélation avec la<br />
protection.. En effet, le test ELISA mesure l’ensemble des anticorps dirigés contre toutes les<br />
protéines virales et reflète donc l’abondance des anticorps dirigés contre la protéine N. Ce test<br />
50
III. Etudes épidémiologiques<br />
5. Protection conférrée par la vaccination<br />
indique la présence d’une réponse humorale, mais ne reflète pas directement le niveau de<br />
protection. Par contre, le test de neutralisation mesure spécifiquement le taux d’anticorps<br />
neutralisants, mais ce test présente des inconvénients car il requiert un laboratoire adapté pour<br />
les cultures cellulaires et de ce fait n’est pas pratique pour les pays en développement. De plus<br />
il faut au minimum 10 jours pour obtenir des résultats.<br />
Le taux d’anticorps protecteur varie en fonction de la technique utilisée, ce qui cause<br />
un problème de standardisation. Des études utilisant le test de neutralisation des plaques<br />
suggèrent qu’un titre en anticorps inférieur à 120 ne serait peut-être pas protecteur (Chen et<br />
al., 1990). Afin de faciliter la normalisation des tests sérologiques, le PEV recommande<br />
d’analyser en parallèle les sérums à tester et les sérums de référence étalonnés avec le sérum<br />
antirougeoleux de référence international. On pourra ainsi convertir les résultats du test en<br />
unités internationales. Le développement de tests de plus en plus sensibles a soulevé le<br />
problème de la signification clinique des faibles taux d’anticorps. Des études ont mis en<br />
évidence, avec le test de neutralisation des plaques, des taux d’anticorps avant exposition au<br />
virus significativement plus faibles chez des personnes présentant quelques symptômes<br />
(fièvre, toux) que chez celles qui en avaient aucun. Ces résultats suggèrent qu’un certain taux<br />
d’anticorps avant exposition protégerait contre la rougeole classique, mais pas contre la<br />
rougeole atténuée ou cliniquement silencieuse (Chen et al., 1990).<br />
III.5.2. Durée de la protection<br />
Plusieurs enquêtes prospectives ont analysé la persistance des anticorps après la<br />
vaccination rougeoleuse et ont permis de montrer que plus de 85% des personnes vaccinées<br />
possédaient des anticorps 8 à 16 ans après la vaccination (Krugman, 1983 ; Dai et al., 1991).<br />
Cependant, le taux d’anticorps diminuerait avec le temps (Christenson & Bottiger, 1994). En<br />
effet, lors d’une étude effectuée en Chine, on a observé une diminution des anticorps pendant<br />
les quatre années suivant l’administration du vaccin. Huit ans après la vaccination, 12,9% des<br />
sujets n’avaient pas d’anticorps détectables (Xiang & Chen, 1983). La durée de protection<br />
dépend de plusieurs facteurs tels que le taux d’anticorps post-vaccinal, la région<br />
géographique, le niveau de restimulation du système immunitaire.<br />
La diminution du taux d’anticorps serait plus ou moins accentuée en fonction de la<br />
région géographique. Des études ont montré un déclin précoce du taux d’anticorps chez les<br />
Africains, notamment dans les zones où la malaria est endémique. Les avis sont mitigés sur le<br />
rôle de la malaria dans le déclin des anticorps. Il a été montré que la malaria diminue la<br />
51
III. Etudes épidémiologiques<br />
5. Protection conférrée par la vaccination<br />
réponse à la vaccination (Greenwood & Whittle, 1981) et que la durée de vie des globulines<br />
est plus courte chez les Gambiens que chez les enfants en Europe (Cohen et al., 1961). Par<br />
contre, Whittle et al., (1999a) ont montré que le taux d’anticorps contre la rougeole 5 à 7 ans<br />
après la vaccination varie en fonction de la saison pendant laquelle les prélèvements sanguins<br />
sont effectués. Il augmente en saison de pluies et diminue en saison sèche, ce qui laisse penser<br />
que la malaria et les autres infections fréquentes auraient un rôle dans cette fluctuation de la<br />
réponse anticorps. En effet, il a été montré que la réponse anticorps au vaccin contre la<br />
rougeole augmente chez les enfants infectés par le plasmodium falciparum (Smedman et al.,<br />
1986).<br />
Il est possible que la diminution des anticorps évolue jusqu'à la disparition de ceux-ci,<br />
laissant le sujet à nouveau susceptible à l’infection. Il a été rapporté des cas cliniques de<br />
rougeole chez des individus présentant une séroconversion après la vaccination. On parle dans<br />
ce cas d’échecs secondaires de la vaccination (Reyes et al., 1987 ;Mathias et al., 1989). Si des<br />
cas d’échec secondaires de la vaccination sont rapportés un peu partout dans le monde, leur<br />
proportion en revanche paraît faible : 2% lors d’une étude en Chine (Zhuji, 1987) et 5% lors<br />
d’une étude au Canada (Mathias et al., 1989). Les échecs secondaires de la vaccination<br />
seraient plus fréquents chez ceux qui ne développent que de faibles taux d’anticorps après la<br />
vaccination. En effet des études menés aux Etats-Unis ont permis de montrer que l’échec<br />
secondaire de la vaccination était plus fréquent parmi les enfants vaccinés avant l’âge d’un an<br />
que chez les enfants vaccinés plus tard (Smith et al., 1982).<br />
La durée de l’immunité varie en fonction de la stimulation du système immunitaire.<br />
Lorsque les titres d’anticorps contre la rougeole deviennent faibles, une nouvelle exposition<br />
aux virus (sauvage ou vaccinal) stimule les cellules B mémoires. Celles-ci sont la base de la<br />
mémoire humorale de longue durée (Jerne, 1984). Il a été suggéré qu’une stimulation<br />
antigénique régulière est nécessaire pour la mémoire à long-terme des cellules B (Gray &<br />
Skarvall, 1988). Suite à la stimulation, les cellules B se différencient en plasmocytes qui<br />
synthétisent et sécrètent les anticorps. Il se produit alors une réponse immunitaire spécifique<br />
de la rougeole, lors de laquelle les concentrations en IgG s’élèvent rapidement et atteignent un<br />
maximum environ 12 jours après la réinfection (Schluederberg et al., 1973). Il existe plusieurs<br />
types de stimulations ;<br />
- La stimulation naturelle qui se produit lorsque des personnes ayant un faible taux<br />
d’anticorps sont exposées au virus sauvage. Dans la majorité des cas, la réinfection par<br />
le virus sauvage se traduit seulement par une stimulation de la production d’anticorps<br />
sans manifestations cliniques (Krugman, 1983 : Whittle et al., 1999b). Ce type de<br />
52
III. Etudes épidémiologiques<br />
5. Protection conférrée par la vaccination<br />
stimulation est le plus fréquent dans les pays en développement où la population est en<br />
contact permanent avec le virus sauvage. L’immunité persiste probablement au moins<br />
durant la période où le risque de mortalité est le plus important.<br />
- La revaccination introduite suite à l’apparition des épidémies fréquentes de rougeole<br />
dans la population vaccinée. Elle est pratiquée dans les pays industrialisés où le virus<br />
sauvage se fait de plus en plus . La durée de cette seconde réponse immunitaire n’est<br />
pas connue. Cependant, des études montrent que chez des personnes ayant déjà été<br />
victimes d’une chute du taux d’anticorps, le taux d’anticorps retrouve son niveau<br />
initial un an après la revaccination (Deseda-Tous et al., 1978).<br />
- La stimulation du système immunitaire par d'autres virus. La réponse cellulaire des<br />
lymphocytes T est limitée à un certain nombre de cellules. Les cellules T mémoires<br />
pour un virus donné seront réduites suite à l'infection par un virus différent (Selin et<br />
al., 1999). Par contre, l'infection par un virus apparenté augmente la mémoire T. Il<br />
apparaît ainsi qu'un système immunitaire efficace est capable de maintenir un<br />
équilibre en partageant l'espace entre deux mécanismes : soit la délétion d'une portion<br />
de cellules T CD8 mémoires, soit la préservation des cellules T CD8 mémoires crossréactives.<br />
La stimulation naturelle serait plus efficace que la revaccination qui n’induit qu’une<br />
réponse de courte durée spécialement chez les enfants qui ont été vaccinés très tôt dans<br />
l’enfance (Stetler et al., 1986). Dans l’un et l’autre cas, la réponse à la stimulation est<br />
inversement proportionnelle au taux d’anticorps préexistants (Christenson & Bottiger, 1994).<br />
Au regard de toutes ces études,nous pouvons dire que l’immunité acquise par le vaccin<br />
contre la rougeole semble être un continuum, allant d’une protection totale et durable à une<br />
protection minimale ou nulle, en passant par une protection partielle ou temporaire. Cette<br />
flexibilité de la réponse immunitaire est responsable de la circulation occulte du virus de la<br />
rougeole dans la population vaccinée. Ce virus qui se propage sans donner de signes cliniques<br />
a probablement subi une immunosélection et contribue à la diversité antigénique et génétique<br />
du virus de la rougeole.<br />
53
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
1. Variabilité antigénique du VR<br />
CHAPITRE IV. EPI<strong>DE</strong>MIOLOGIE<br />
MOLECU<strong>LA</strong>IRE <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong><br />
IV.1. VARIABILITE ANTIGENIQUE <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong><br />
Le virus de la rougeole est considéré comme antigéniquement stable. Du point de vue<br />
sérologique, le virus est monotypique puisqu'une seule infection induit une immunité à vie.<br />
Les sérums des personnes infectées des décennies plus tôt conservent leur capacité à<br />
54
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
1. Variabilité antigénique du VR<br />
neutraliser les différentes souches de virus sauvages. De même, le sérum de personnes<br />
infectées récemment neutralise les souches vaccinales et les souches sauvages. Cependant, le<br />
virus de la rougeole est un virus à ARN simple brin. La réplication du génome qui se fait via<br />
une ARN polymérase est un processus qui comporte un taux d’erreurs élevé et ne possède<br />
aucune capacité de correction (Holland et al., 1982). De ce fait, il est possible qu’il y ait un<br />
certain degré de mutations. En effet, des variations ont été décrites dans les gènes N, H et F<br />
grâce à l’utilisation des anticorps monoclonaux (Sheshberadaran & Norrby, 1986 ; Giraudon<br />
et al., 1988 ;Fayolle et al., 1999).<br />
La protéine N du virus de la rougeole possède des hétérogénéités antigéniques. Il a été<br />
rapporté des variations antigéniques au niveau de la protéine N entre la souche vaccinale<br />
Rouvax et des souches sauvages isolées en Afrique (Giraudon et al., 1988). Ces variations<br />
seraient situées dans la partie C-terminale de la protéine.<br />
Les glycoprotéines de surface du virus de la rougeole ont des propriétés biologiques et<br />
immunologiques importantes : la protéine H est responsable de l’attachement du virus à la<br />
cellule-hôte et la protéine F joue un rôle dans la fusion des membranes cellulaires et virales,<br />
permettant l’entrée du virus dans la cellule-hôte (Wild et al., 1994 ; Wild & Buckland, 1995).<br />
Les anticorps dirigés contre ces protéines sont indispensables pour la protection contre<br />
l’infection (Varsanyi et al., 1987). Il a été montré que les anticorps murins dirigés contre ces<br />
deux protéines neutralisent l’infectivité du virus in vitro et protègent passivement in vivo<br />
(Malvoisin & Wild, 1990 ; Giraudon & Wild, 1985). De même, les sérums de patients<br />
convalescents ont des activités neutralisantes dirigées contre ces deux antigènes (Sato et al.,<br />
1989). Ainsi, pour échapper au système immunitaire, le virus doit être muté au niveau de ces<br />
deux antigènes.<br />
- La protéine F est connue comme étant la protéine la plus stable. Des mutations ont été<br />
rapportées au niveau de trois acides aminés seulement pendant 40 ans (Rota et al.,<br />
1992). Cependant, des mutations antigéniques ont récemment été décrites dans la<br />
protéine F d’une souche sauvage isolée chez un patient après un séjour en Afrique de<br />
l’Ouest (Fayolle et al., 1999). Cette variation se situe au niveau d’un épitope majeur<br />
localisé sur le fragment F2 de la protéine. Les résultats de cette étude suggèrent qu’il y<br />
aurait une pression immuno-sélective qui favoriserait l’émergence des virus mutés dans la<br />
protéine F, ce qui permettrait l'infection par le virus en présence d’anticorps induits par la<br />
vaccination. Cette observation étant un cas unique, des études supplémentaires sont<br />
requises pour voir si de telles souches sont spécifiques à l’Afrique où si elles sont plus<br />
globalement réparties.<br />
55
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
2. Variations génétiques du VR<br />
- La protéine H est, contrairement à la protéine F, l’une des protéines du virus de la<br />
rougeole pour laquelle des mutations antigéniques sont régulièrement décrites<br />
(Sheshberadaran & Norrby, 1986 ; Tamin et al., 1994). Compte-tenu de son rôle dans<br />
le cycle viral, c’est probablement la première protéine sujette à une modulation<br />
immunologique. Des études de vaccination expérimentales avec les recombinants de<br />
la vaccine ont permis de montrer que des mutations d’acides aminés sont responsables<br />
des changements de propriétés antigéniques du virus (Drillien et al., 1988).<br />
La contribution des variations antigéniques dans l’épidémiologie de la rougeole n’est<br />
pas bien connue. Il a été suggéré que les souches de virus antigéniquement différentes<br />
émanent d’une sélection immune au cours de la réplication du virus chez des enfants<br />
partiellement protégés (Fayolle et al., 1999). D’après Webster & Laver, (1980), la sélection<br />
immunologique de variants résistant à la neutralisation est responsable des mutations<br />
antigéniques du virus influenza A dans la population humaine.<br />
Il est possible que les changements antigéniques associés aux échecs de la vaccination<br />
favorisent l’augmentation de l’infection et la transmission de la rougeole au sein de la<br />
population vaccinée. Il est impératif d’approfondir les études sur les réponses<br />
immunologiques et les changements au cours de l’infection induits par les variations<br />
antigéniques. Ces données seront indispensables dans l’orientation future de la stratégie de<br />
vaccination.<br />
IV.2. VARIATIONS GENETIQUES <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong><br />
Si l’on estime qu’il n’existe qu’un seul sérotype de virus de la rougeole, le séquençage<br />
a toutefois montré que des lignées distinctes de virus sauvages existent et co-circulent (WHO,<br />
1998). Parmi les 6 gènes que compte le génome viral, les gènes H et N sont les plus variables.<br />
La variabilité nucléotidique atteint 7% pour les gènes H et N. Cependant, la région la plus<br />
variable du génome du virus de la rougeole est la séquence de 456 nucléotides codant pour<br />
l’extrémité C-terminale de la protéine N, dans laquelle la variabilité nucléotidique est parfois<br />
voisine de 13,6% d’un virus sauvage à l’autre (Mulders et al., 2001). Le séquençage de<br />
plusieurs virus sauvage a été réalisé, ce qui a permis de les classer dans divers groupes<br />
génétiques.<br />
56
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
3. Classification génétique du VR<br />
IV.3. C<strong>LA</strong>SSIFICATION GENETIQUE <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong><br />
La classification génétique du virus de la rougeole était jusqu’ici basée soit sur les 456<br />
nucléotides de la partie C-terminale du gène de la nucléoprotéine, soit sur le gène entier de<br />
l’hémagglutinine. Actuellement, l’OMS exige que la classification soit obligatoirement basée<br />
sur les deux gènes (WHO, 2001a). Le choix de ces deux gènes pour la classification est non<br />
seulement basé sur le fait que ce sont les gènes les plus variables, mais aussi sur le fait que la<br />
topologie de l’arbre phylogénétique obtenu est analogue pour les gènes H et N. Les<br />
différentes souches de virus ont été classifiées en huit clades. Les clades sont désignés par les<br />
lettres A à H. Ces clades sont subdivisés en génotypes, il existe actuellement 21 génotypes<br />
(tableau génotypes). Certains clades ne comportent qu’un seul génotype et la désignation du<br />
clade et du génotype est alors identique (clade A= génotype A). D’autres, comme le clade D,<br />
sont représentés par plusieurs génotypes désignés par la lettre du clade suivie d’un numéro<br />
pour le génotype (D1, D2,…). Une souche de référence a été assignée à chaque génotype et<br />
représente le premier isolat de chaque génotype.<br />
La définition des génotypes et la démarcation entre différents clades sont basées sur la<br />
divergence génétique entre les différents groupes. La divergence génétique dans la partie C-<br />
terminale de la protéine N est comprise entre 1,7% pour les virus du clade A et 9,6% pour les<br />
virus des clades C et D. La variation à l’intérieur d’un génotype varie entre 1,7% pour le<br />
génotype A et 6% pour le génotype C1 (Mulders et al., 2001). L’OMS a récemment établi des<br />
critères que devront remplir les nouveaux génotypes. Il en ressort qu’une différence<br />
nucléotidique minimale de 2,5% pour la partie C-terminale de la protéine N et de 2% pour le<br />
gène H entier, par rapport à la souche la plus étroitement apparentée, est requise pour la<br />
désignation de nouveaux génotypes (WHO, 2001a).<br />
57
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
3. Classification génétique du VR<br />
Tableau 2 : Souches de référence utilisées pour l'analyse phylogénétique des souches sauvages du<br />
virus de la rougeole.<br />
Génotype Etat Souches de référence (MVI) a Numéro d'accès à Genbank<br />
Gène H Gène N<br />
A Actif Edmonston-wt.USA/54 U03669 U01987<br />
B1 Actif Yaounde.CAE/12.83 "Y14" AF079552 U01998<br />
B2 Actif Libreville.GAB/84 "R96" AF079551 U01994<br />
B3 Actif New York.USA/94 L46752 L46753<br />
Ibandan.NIE/97/1 AJ239133 AJ232203<br />
C1 Actif Tokyo.JPN/84/K AY047365 AY043459<br />
C2 Actif Maryland.USA/77 "JM" M81898 M89921<br />
Erlangen.<strong>DE</strong>U/90 "WTF" Z80808 X84872<br />
D1 Inactif Bristol.UNK/74 (MVP) Z80805 D01005<br />
D2 Actif Johannesburg.SOA/88/1 AF085198 U64582<br />
D3 Actif Illinois.USA/89/1 "Chicago-1) M81895 U01977<br />
D4 Actif Montreal.CAN/89 AF079554 U01976<br />
D5 Actif Palau.B<strong>LA</strong>/93 L46757 L46758<br />
Bangkok.THA/93/1 AF009575 AF079555<br />
D6 Actif New Jersey.USA/94/1 L46749 L46750<br />
D7 Actif Victoria.AUS/16.85 AF247202 AF243450<br />
Illinois.USA/50.99 AY043461 AY037020<br />
D8 Actif Manchester.UNK/30.94 U29285 AF280803<br />
E Inactif Goettingen.<strong>DE</strong>U/71 "Braxator" Z80797 X84879<br />
F Inactif MVs/Madrid.SPA/94 PESS Z80830 X84865<br />
G1 Inactif Berkeley.USA/83 AF079553 U01974<br />
G2 Actif Amsterdam.NET/49.97 AF171231 AF171232<br />
g3 b Actif MVs/Victoria.AUS/24.99 AF353621 AF353622<br />
H1 Actif Hunan.CHN/93/7 AF045201 AF045212<br />
H2 Actif Beijing.CHN/94/1 AF045203 AF045217<br />
a Désignation OMS. Les autres désignations utilisées dans les publications sont indiquées entre guillemets.<br />
b Nouveau génotype proposé dans l'attente de l'isolement de la souche de référence.<br />
58
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
4. Distribution géographique des génotypes<br />
IV.4. DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE <strong>DE</strong>S DIFFERENTS GENOTYPES<br />
Bien que certains génotypes soient localisés dans une région géographique déterminée,<br />
d’autres en revanche circulent partout dans le monde. Le clade A est constitué des souches<br />
vaccinales et des souches sauvages dont elles dérivent (Rota et al., 1994). Ce fut<br />
probablement le génotype majeur connu avant l’introduction de la vaccination dans les années<br />
60. Des virus appartenant au clade A ont récemment été isolés aux Etats-Unis (Rota et al.,<br />
1994), en Angleterre (Outlaw & Pringle, 1995), en Afrique du Sud (Kreis et al., 1997) et en<br />
Russie (Santibanez et al., 1999), suggérant que ce génotype a circulé de façon continue<br />
pendant plusieurs décennies. Le clade B comprend les génotypes B1, B2 et B3 et les isolats<br />
appartenant à ce clade sont retrouvés uniquement en Afrique Centrale et en Afrique de<br />
l’Ouest (Taylor et al., 1991 ; Hanses et al., 1999). Le Clade C constitué des génotypes C1 et<br />
C2 est présent en Europe et au Japon (Hanses et al., 2000, Rima et al., 1997). Les virus du<br />
clade D sont retrouvés dans plusieurs continents. Ce clade est subdivisé en génotypes D1 à<br />
D8. Le génotype D1 est inactif (il n'a plus été retrouvé depuis 1974). Bien que les génotypes<br />
D2 et D4 soient les génotypes les plus fréquemment détectés dans les parties australe et<br />
orientale du continent africain (Kreis et al., 1997), des virus appartenant au génotype D2 ont<br />
été détectés récemment en Irlande et le génotype D4 a été associé à des cas de rougeole<br />
importés d’Inde (Truong et al., 2001). Les clades E et F sont inactifs. Le Clade G a aussi été<br />
considéré comme inactif jusqu'à ce que récemment, des virus appartenant aux génotypes G2<br />
et G3 soient isolés en Indonésie et en Malaisie (Rota et al., 2000 ; Truong et al., 2001). Les<br />
virus appartenant au clade H sont le plus souvent retrouvés en Chine. La diversité des<br />
génotypes est plus élevée dans les régions où la transmission du virus s’est interrompue<br />
comme aux Etats-Unis.<br />
IV.5. L’EPI<strong>DE</strong>MIOLOGIE MOLECU<strong>LA</strong>IRE COMME OUTIL <strong>DE</strong> CONTROLE <strong>DE</strong> <strong>LA</strong><br />
STRATEGIE <strong>DE</strong> VACCINATION<br />
L’épidémiologie moléculaire se définit comme l’analyse comparative de séquences<br />
appliquée à l’étude de la propagation d’une maladie au sein de la population. L’étude de<br />
l’épidémiologie moléculaire du virus de la rougeole a apporté une contribution importante aux<br />
efforts de lutte contre la rougeole en offrant un moyen :<br />
59
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
5. Epidémiologie moléculaire : outil de contrôl<br />
- d’identifier la source et les voies de transmission du virus<br />
- d’observer les modifications des génotypes viraux au cours du temps dans une région<br />
donnée<br />
- de documenter l’interruption de la transmission du virus de la rougeole<br />
- d’évaluer l’efficacité des programmes de vaccination<br />
Dans le cadre de la lutte contre la rougeole, la surveillance virologique a permis de<br />
constater, qu’avec le temps, les génotypes régionaux ou endémiques changent à cause d’une<br />
réintroduction continue du virus de la rougeole dans les régions où le virus endogène a été<br />
éliminé. Il en résulte une diversité de génotypes comme c’est les cas aux Etats-Unis et en<br />
Europe (Rima et al., 1995).<br />
Dans les pays où les campagnes de vaccination soutenues ont permis d’éliminer ou de<br />
réduire considérablement les cas de rougeole, l’épidémiologie moléculaire permet de faire la<br />
différence entre les cas de rougeole causés par un virus endémique et ceux qui sont causés par<br />
un virus importé. L’étude des souches de virus responsables de l’épidémie de rougeole<br />
survenue au Luxembourg en 1996 a montré qu’ils appartenaient au génotype C2. La<br />
comparaison des séquences de la partie C-terminale de la protéine N a montré une variabilité<br />
nucléotidique de 0,2% (Hanses et al., 2000) parmi ces virus. Cependant, en 1997 il y a eu<br />
plusieurs cas sporadiques de rougeole dans ce pays, laissant croire que le virus continue de<br />
circuler de façon persistante dans la population. Bien que les virus responsables des cas<br />
sporadiques appartiennent au même génotype que ceux de l’année précédente, la variabilité<br />
nucléotidique entre les échantillons de 1996 et 1997 était 4 fois supérieure à celle qui a été<br />
observée parmi les virus de 1996. Ce qui veut dire que les virus responsables des épidémies<br />
de 1996 n’étaient pas impliqués dans l’apparition des cas sporadiques de 1997. Il apparaît que<br />
la circulation des virus responsables de l’épidémie de 1996 s’est arrêtée et que les cas de<br />
rougeole sporadiques étaient dus à une réintroduction du virus.<br />
Aux Etats-Unis où le virus de la rougeole est devenu rare à cause des efforts de<br />
vaccination intenses, la surveillance des cas de rougeole entre 1994 et 2000 n’a pas permis de<br />
détecter de transmission d’un génotypesauvage. Par contre, la diversité des génotypes détectés<br />
au cours de ces 7 dernières années (11 génotypes) indique l’existence de multiples sources<br />
d’importation du virus (WHO, 2001b). Parmi les 100 cas de rougeoles rapportés aux Etats-<br />
Unis en 1999, 66 ont été identifiés comme des cas importés (CDC, 2000). Grâce à<br />
l’épidémiologie moléculaire, l’origine des virus impliqués dans les épidémies de rougeole<br />
survenus aux Etats-Unis en 1994 a pu être identifiée. Il a été montré que ces virus provenaient<br />
60
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
6. Application des campagnes de vaccination<br />
de différentes origines parmi lesquelles l’Angleterre, le Japon, le Kenya. Ce qui explique la<br />
diversité génétique observée (5 génotypes) (Rota et al., 1996). De même, la diversité des<br />
génotypes détectés en Australie, au Canada, et au Royaume-Uni est analogue à celle qui est<br />
observée au Etats-Unis ce qui laisse supposer des importations fréquentes et l’absence de<br />
souches endémiques (WHO, 2001b).<br />
Dans les pays où la rougeole est endémique, l’épidémiologie moléculaire s’avère être<br />
un outil majeur de suivi de l’impact des campagnes de vaccination. En effet, l’interruption de<br />
la circulation du virus grâce aux campagnes de vaccination peut être démontrée en comparant<br />
les séquences des virus isolés avant les campagnes de vaccination avec celles des isolats<br />
obtenus après la vaccination. L’OMS recommande donc de procéder à une surveillance<br />
virologique en toutes régions, avant de mettre en œuvre des programmes de vaccination<br />
accélérés. L’épidémiologie moléculaire donne la possibilité de savoir s'il y a un lien<br />
épidémiologique entre les cas de rougeole et si le virus continue à être transmis dans les<br />
régions couvertes par la campagne de vaccination ou alors si les cas de rougeole sont<br />
indépendants et dus à une réintroduction du virus. Contrairement aux Etats-Unis où l'on<br />
observe une diversité génétique élevée, la surveillance virologique dans les pays où la<br />
transmission de la rougeole est endémique indique la présence d’un nombre limité de<br />
génotypes endémiques (WHO, 2001b). En Afrique Centrale et Afrique de l’Ouest, seuls les<br />
virus appartenant au clade B ont été détectés depuis 20 ans.<br />
IV.6. APPLICATION <strong>DE</strong>S CAMPAGNES INTENSIVES <strong>DE</strong> VACCINATION<br />
Il y a 15 ans, la rougeole était l’agent pathogène le plus meurtrier dans le monde avec<br />
3 millions de morts par an. De nos jours, elle reste l’une des causes majeures de mortalité et<br />
de morbidité chez les enfants. On estime qu’environ 880000 enfants sont décédés de suites de<br />
rougeole en l’an 2000 (GAVI, 2000). Le but principal du programme de lutte contre la<br />
rougeole est d’éliminer la circulation du virus dans la population. Cependant, un objectif<br />
intermédiaire est de réduire la transmission du virus de manière à empêcher les épidémies.<br />
Les stratégies mises en place pour atteindre ces objectifs varient, allant de l’augmentation des<br />
services de vaccination de routine aux campagnes spéciales de vaccination de masse. Ces<br />
différentes stratégies ont été appliquées par plusieurs pays. Les expériences de la Gambie, des<br />
Etats-Unis et de Cuba font partie des premiers succès de lutte contre la rougeole.<br />
61
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
6. Application des campagnes de vaccination<br />
IV.6.1. La Gambie<br />
La Gambie, pays d’Afrique de l’Ouest, fut le premier pays au monde à interrompre la<br />
transmission de la rougeole. La campagne de vaccination fut introduite pour la première fois<br />
en 1967 en tant que partie intégrante du programme ouest-africain d’éradication de la variole<br />
(Foster & Pifer, 1971). La stratégie de la campagne incluait des programmes de vaccination<br />
village après village menés par des équipes mobiles. Tous les enfants âgés de 6 mois à 4 ans<br />
furent vaccinés. Des campagnes supplémentaires permirent de vacciner les enfants ayant<br />
échappé à la vaccination. La couverture vaccinale atteignait 96% et la transmission de la<br />
rougeole fut interrompue dans l’année suivant le début du programme. Aucun cas de rougeole<br />
n’a été signalé de 1968 à 1970 (Foege, 1971).<br />
Malheureusement, le programme de contrôle de la rougeole n’a pas été maintenu,<br />
favorisant la réintroduction de la rougeole à partir des pays voisins et elle s’installa comme<br />
maladie endémique en 1972 (Williams & Hull, 1983 ; Thacker & Millar, 1991). Trois causes<br />
majeures sont attribuées à cet échec : i) le manque d’infrastructure hospitalière pour identifier<br />
et immuniser de nouveaux individus susceptibles ; ii) le manque de personnel pour maintenir<br />
les opérations sur le terrain ; iii) l’approvisionnement inadéquat du vaccin.<br />
Dans les années qui ont suivi, la Gambie a développé un service intensif de santé<br />
mère-enfant. Dix-huit centres fixes et environ cent cliniques ont été créés, avec pour but de<br />
diminuer la morbidité et la mortalité infantile. Grâce à ces efforts, les cas de rougeole ont<br />
considérablement diminué. Entre 1977 et 1979, 6.110 cas de rougeole ont été rapportés. En<br />
1981, il y a eu seulement 274 cas, soit une réduction de 86,5%. La Gambie a été le premier<br />
pays à montrer que l’élimination de la rougeole est techniquement faisable.<br />
IV.6.2. Les Etats-Unis<br />
L’utilisation du vaccin contre la rougeole aux Etats-Unis débute en 1963. La<br />
population adopte facilement le vaccin et il est utilisé à large échelle. Bien que les cas de<br />
rougeole aient diminué dans la population, on compte de 1970 à 1975, 36000 hospitalisations<br />
de cas de rougeole (Hinman et al., 1983).<br />
En 1978, les Etats-Unis déclarent comme objectif l’élimination de la transmission du<br />
virus endogène pour 1982 (Hinman et al., 1979). La stratégie de base consiste à augmenter la<br />
couverture vaccinale avec une seule dose de vaccin, ainsi que la surveillance de la rougeole, et<br />
à contrôler les épidémies. De plus, la vaccination est obligatoire pour l’entrée à l’école.<br />
Cependant, plusieurs enfants en âge préscolaire, surtout ceux qui vivent dans les quartiers<br />
62
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
6. Application des campagnes de vaccination<br />
pauvres, n’ont pas été vaccinés. Bien que le nombre de cas de rougeole ait diminué, la<br />
maladie continue à sévir aussi bien chez les enfants non vaccinés que chez les enfants ayant<br />
eu un échec de vaccination.<br />
Entre 1989 et 1991, une grande épidémie de rougeole survient aux Etats-Unis, 55000<br />
cas et 123 décès sont rapportés (Atkinson et al., 1992). En réponse à cette reprise de la<br />
maladie, plusieurs changements ont lieu dans la stratégie de lutte contre la rougeole ;<br />
- 1989 : introduction d’une seconde dose de vaccin afin d’éviter des cas de rougeole<br />
dans la population scolaire vaccinée (CDC, 1989)<br />
- 1990 : augmentation des services de vaccination pour les enfants en âge pré-scolaire<br />
vivant dans les cités pauvres, afin d’éviter les cas de rougeole dans ces populations<br />
(NVAC, 1991)<br />
La mise en œuvre du plan de vaccination à deux doses et l’augmentation de la<br />
couverture vaccinale pour les enfants en âge pré-scolaire a conduit à l’augmentation de<br />
l’immunité dans la population. Il en résultent une diminution du nombre de cas de rougeole, si<br />
bien qu’en 1993, seulement 312 cas de rougeole furent rapportés. C’est le nombre de cas de<br />
rougeole le plus bas jamais rapporté depuis le début de la surveillance de la rougeole aux<br />
Etats-Unis en 1912. Vers la fin de l’année 1993, aucun cas de rougeole n’a été rapporté<br />
pendant 6 semaines consécutives (CDC, 1993). Cependant, en 1994 on observa une<br />
augmentation des cas de rougeole (958 cas). L’épidémiologie moléculaire a révélé que les<br />
virus qui circulaient en 1994 étaient importés et étaient différents de ceux qui circulaient entre<br />
1989 et 1990 (Rota et al., 1996). Ces résultats suggèrent que la transmission de la rougeole a<br />
été interrompue aux Etats-Unis en 1993.<br />
IV.6.3. L’Amérique du Sud<br />
Plusieurs pays d’Amérique du Sud ont appliqué des campagnes de vaccination<br />
similaires pour lutter contre la rougeole.<br />
A Cuba, la stratégie de contrôle de la rougeole a été appliquée pour la première fois<br />
entre 1971 et 1979. Elle consistait à vacciner les enfants âgés de 6 mois à 5 ans, mais la<br />
couverture vaccinale était faible et plusieurs épidémies se sont déclarées pendant cette<br />
période. De 1980 à 1985, la stratégie fut modifiée et la nouvelle stratégie consistait en la<br />
vaccination des enfants âgés de 9 mois à 14 ans (Molinert et al., 1993). Une couverture<br />
vaccinale de 77 % fut atteinte, mais les épidémies continuèrent avec plus de 23000 cas de<br />
rougeole en 1983.<br />
63
IV. Epidémiologie moléculaire du VR<br />
6. Application des campagnes de vaccination<br />
En 1986, une nouvelle stratégie basée sur l’expérience de la Gambie fut lancée à Cuba.<br />
Une campagne de vaccination de masse fut conduite, ciblant tous les enfants de 1 à 14 ans<br />
sans tenir compte de leur statut vaccinal, ni de l’existence d’une rougeole préalable. Une<br />
couverture vaccinale de 98% fut atteinte et le nombre de cas de rougeole diminua rapidement.<br />
Entre 1989 et 1992, seulement 20 cas de rougeole furent rapportés par an (PAHO, 1995).<br />
D’autres pays d’Amérique du Sud ont suivi Cuba. Au Chili, une campagne de<br />
vaccination de masse fut conduite en 1992, ciblant les enfants âgés de 9 mois à 15 ans<br />
(Jimérez-de-la-Jara et al., 1995). La couverture vaccinale fut de 99%. Un système de<br />
surveillance fut établi avec un rapport hebdomadaire des cas de rougeole. En 1993, un seul<br />
cas de rougeole importé du Venezuela a été rapporté. Entre 1993 et 1996, aucun cas de<br />
rougeole n’a été rapporté au Chili. Une stratégie similaire a été appliquée au Brésil en 1992,<br />
où les enfants âgés de 1 à 14 ans furent ciblés. La couverture vaccinale atteignit 95%, ce qui<br />
conduisit à une diminution drastique de l’incidence de la rougeole. En 1996, seulement 36 cas<br />
de rougeole furent rapportés au Brésil.<br />
64
CHAPITRE V. <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong> EN AFRIQUE<br />
V.1. <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong> AU CAMEROUN<br />
65
V. La rougeole en Afrique 1. La rougeole au Cameroun<br />
V.1.2. Situation géographique du Cameroun<br />
Le Cameroun est un pays d’Afrique centrale dont la capitale est Yaoundé. Il compte<br />
environ 14 millions d’habitants. Les pays limitrophes du Cameroun sont le Nigeria à l’ouest,<br />
le Tchad au nord , La République Centrafricaine à l’est, la Guinée Equatoriale, le Gabon et le<br />
Congo au sud.<br />
V.1.3. Historique de la vaccination au Cameroun<br />
Les activités de surveillance de la rougeole ont commencé à Yaoundé en 1966<br />
(Heymann et al., 1983). Les campagnes de vaccination de masse avaient alors lieu tous les<br />
deux ans, juste avant la période de forte propagation de la rougeole. Pendant ces campagnes,<br />
les enfants âgés de 6 à 36 mois recevaient une dose de vaccin antirougeoleux. Cependant, la<br />
vaccination des enfants âgés de 6 à 12 mois avait lieu une fois par mois à la PMI, en<br />
association avec la vaccination contre la variole.<br />
En 1970, en plus de ces campagnes périodiques de vaccination, des sessions de<br />
vaccination avaient lieu deux fois par mois dans les centres de santé mère-enfant. Cependant,<br />
en 1973, en dépit du nombre élevé de vaccins administrés (78% d’enfants âgés de 6 à 36 mois<br />
à Yaoundé furent vaccinés), le nombre de cas de rougeole restait élevé, 40% des cas étant<br />
observés chez les enfants de moins de 12 mois, 80% chez les enfants de moins de 24 mois et<br />
90% chez les enfants de moins de 36 mois (Guyer & McBean, 1981). Ces observations ont pu<br />
être expliquées par le fait que la majorité des vaccins administrés était inefficace. Cette<br />
inefficacité était due soit à la présence d’anticorps maternels, soit à l’utilisation d’un vaccin<br />
devenu inactif à cause des conditions de stockage inappropriées.<br />
Grâce à ces observations, plusieurs changements sont survenus en 1974 dans le<br />
programme de vaccination à Yaoundé ;<br />
- Les conditions de stockage et d’administration du vaccin ont été améliorées.<br />
- Les campagnes de vaccination de masse ont été remplacées par des vaccinations<br />
quotidiennes dans les centres de santé.<br />
- L’âge minimum de vaccination passa de 6 à 9 mois.<br />
Des études effectuées par Heymann et al., (1983) montrent qu’il y a eu une diminution<br />
de plus de 44% du nombre de cas de rougeole entre 1976 et 1979. La plus forte baisse de<br />
66
V. La rougeole en Afrique 1. La rougeole au Cameroun<br />
l’incidence de la rougeole a été observée chez les enfants âgés de 0 à 8 mois (51,3%) en<br />
1976, c’est-à-dire un an après le changement de l’âge de la vaccination. Cette baisse du<br />
nombre de cas de rougeole et de décès associés a été attribuée à la protection des enfants de<br />
plus de 8 mois par la vaccination. D’autre part, la diminution de la fréquence d’attaque parmi<br />
les enfants de moins de 9 mois (enfants non vaccinés) a été attribuée au fait que le risque<br />
d’exposition au virus de la rougeole a diminué à cause de la réduction de la circulation du<br />
virus chez les autres contacts à la maison ou dans les lieux publics comme les hôpitaux et le<br />
marché.<br />
V.1.4. Epidémies saisonnières de rougeole au Cameroun<br />
Au Cameroun, il y a 4 saisons, la grande saison sèche qui s’étend du mois de<br />
novembre au mois de mars, la petite saison des pluies qui va d’avril à mai, la petite saison<br />
sèche qui couvre les mois de juin et juillet, la grande saison des pluies qui s’étend d’août à<br />
octobre.<br />
La rougeole est une maladie endémique au Cameroun et des cas de rougeole sont<br />
rapportés pendant toute l’année. Cependant, dans les zones urbaines, on observe une épidémie<br />
annuelle de rougeole qui commence pendant la saison sèche vers la fin du mois de novembre,<br />
puis, s’étend et atteint un pic au mois mars (Figure 7). Par la suite, l’épidémie disparaît<br />
rapidement avec l’arrivée de la saison des pluies au mois d’avril. La corrélation entre les<br />
saisons et l’épidémie a été attribuée à un mouvement saisonnier de la population entre les<br />
zones rurales et urbaines, ce qui suggère que des raisons sociales et agricoles génèrent le<br />
déplacement des populations et favorisent le contact entre un nombre suffisant d’enfants<br />
susceptibles pour maintenir la transmission d’une épidémie de rougeole.<br />
Les études menées dans la région de Yaoundé montrent que la grande saison des<br />
pluies commence au mois d’août et se termine en octobre. Les plants semés pendant cette<br />
période sont récoltés au mois de novembre. Pendant cette période, malgré une augmentation<br />
de la population susceptible, le nombre suffisant pour soutenir une épidémie de rougeole n’est<br />
pas atteint. La grande saison sèche s’installe vers la fin du mois de novembre. Avec les fêtes<br />
musulmanes et chrétiennes du mois de décembre, on observe un déplacement de la population<br />
de la ville vers les villages pour passer les fêtes en famille. L’activité agricole est réduite<br />
pendant cette période.<br />
67
V. La rougeole en Afrique 1. La rougeole au Cameroun<br />
Au mois de janvier, avec la rentée scolaire, la population retourne dans les villes. Cette<br />
immigration inclut un grand nombre d’enfants susceptibles parmi lesquels les enfants<br />
résidants régulièrement en ville et qui ont été temporairement dans les villages, de même que<br />
les enfants résidant régulièrement dans les villages. En effet, les mères de ces derniers sont<br />
des agricultrices qui profitent de cette période d’inactivité dans le cycle d’agriculture pour<br />
aller passer un moment dans les villes. Cette immigration augmente le nombre d’enfants<br />
susceptibles dans la population urbaine, qui atteint une concentration suffisante pour<br />
maintenir une épidémie de rougeole. L’épidémie s’étend jusqu'au mois d’avril et disparaît<br />
rapidement avec l’arrivée des pluies. En effet, ce déclin de l’épidémie correspond à la saison<br />
des semis quand les mères agricultrices quittent les villes pour aller cultiver leurs champs<br />
dans les villages. La disparition de l’épidémie est accélérée par cette grande vague de départ<br />
d’enfants susceptibles avec leurs mères vers les villages.<br />
Figure 7 : Courbe épidémiologique de la<br />
rougeole au Cameroun (2001)<br />
7000<br />
6000<br />
5000<br />
4000<br />
3000<br />
2000<br />
1000<br />
0<br />
Oct Nov Dec Jan Fév Mar Avr Mai Juin Juil Aôut Sep<br />
Mois<br />
68
V. La rougeole en Afrique 1. La rougeole au Cameroun<br />
V.1.5. Incidence et létalité de la rougeole<br />
Au Cameroun, la vaccination contre la rougeole fait partie du programme élargi de<br />
vaccination depuis 1976. D’après les données obtenues ces huit dernières années, la<br />
couverture vaccinale est passée de 32% en 1993 à 49% en 2000. Malgré cet effort de<br />
vaccination, la maladie sévit dans tout le pays. Le nombre annuel de cas rapportés au PEV<br />
entre 1993 et 2001 varie entre 5535 et 23934 (Tableau 2). On remarque une baisse drastique<br />
du nombre de cas de rougeole entre 1993 et 1995. Ceci s’explique par l’augmentation de la<br />
couverture vaccinale qui est passée de 32% en 1993 à 46% en 1995. En revanche, malgré<br />
l’augmentation de la couverture entre 1999 (46%) et 2000 (49%), il y a une forte<br />
augmentation du nombre de cas de rougeole dans l’année 2000 (14.629 cas) par rapport à<br />
1999 (10.894 cas). Ceci s’explique par le fait qu’un système de surveillance accentué de la<br />
rougeole a été mis en place par l’OMS au Cameroun au début de l’année 2000 dans le cadre<br />
du projet d’éradication de la rougeole prévue pour l’année 2013 en Afrique. Les données de<br />
l’année 2001 font état d’un nombre de cas de rougeole 1,5 fois supérieur à celui de l’année<br />
précédente. Ce qui suggère que le système de surveillance fonctionne de mieux en mieux.<br />
Cependant, on déplore la baise de la couverture vaccinale qui est passée de 49% en 2000 à<br />
47% en 2001 (Tableau 4), ce qui suggère une absence de corrélation entre le système de<br />
surveillance et le système de vaccination.<br />
Au Cameroun, l’incidence de la rougeole varie d’une province à l’autre. La maladie<br />
sévit le plus dans la partie septentrionale du pays où la province de l’extrême nord est la plus<br />
touchée (Figure 8, Tableau 3). Elle compte à elle seule presque la moitié des cas (6 328 cas) et<br />
des décès (170 décès) déclarés dans tout le pays dans l’année 2000 (14629 cas et 350 décès).<br />
Ces donnés reflètent celles de 1999 où la province de l’Extrême nord comptait 8343 cas et<br />
178 décès parmi les 10894 cas et 248 décès déclarés dans tout le pays. En 2001, on note une<br />
forte augmentation du nombre de cas de rougeole par rapport à l’an 2000 dans toutes les<br />
provinces, excepté la province de l’extrême nord, ce qui montre que la surveillance s’est<br />
accentuée en même temps dans presque toutes les régions du pays. Il est probable que la<br />
campagne de surveillance soit moins efficace dans la province de l’Extrême nord. Le nombre<br />
de cas rapporté dans cette province pourait également reflèter le nombre de cas survenus<br />
effectivement dans cette région.<br />
Le taux de létalité au niveau national est de 2,3 % pour l’année 2000. Bien que la<br />
province de l’Extrême nord soit celle qui compte le plus de cas, le taux de létalité y est<br />
69
V. La rougeole en Afrique 1. La rougeole au Cameroun<br />
semblable à la moyenne nationale. C’est la province de l’Adamaoua qui a le taux de létalité le<br />
plus élevé (4,2%).<br />
Ces données sont basées sur la déclaration du personnel sanitaire et comme seule une<br />
partie de la population consulte, ces donnés sous-estiment l’incidence de la maladie. Les cas<br />
rapportés sont probablement les cas les plus sévères. Cependant, ces données révèlent le fait<br />
que la région du grand nord, comprenant les provinces de l’Adamaoua, du Nord, et de<br />
l’Extrême nord, est la plus touchée. Ceci peut s’expliquer par :<br />
Une insuffisance de centres de santé. Le nord Cameroun est la région qui souffre<br />
le plus d’une insuffisance d’institutions sanitaires au Cameroun. De plus, les<br />
centres de santé existants sont sous-utilisés par la population comme on l’a<br />
constaté dans d’autres pays africains (Edmunds et al., 2001).<br />
Le manque d’information de la population. Une étude réalisée dans la région du<br />
nord ouest du Nigeria (voisin direct du nord Cameroun) montre que seulement 1%<br />
des mères de cette région savaient que la rougeole peut être prévenue par la<br />
vaccination (Ambe et al., 2001). En Afrique en général, la mère est responsable<br />
du suivi de la santé des enfants. Un minimum d’alphabétisation est nécessaire pour<br />
comprendre l’importance de la vaccination et faire vacciner ses enfants. Or la<br />
région du nord Cameroun a le taux d’analphabétisme chez les filles le plus élevé<br />
du pays. De plus, la population de cette région étant musulmane, l’ignorance des<br />
femmes y est accentuée par le fait que, de par leur religion, elles sont astreintes à<br />
vivre retirées du monde.<br />
Certaines croyances des populations peuvent expliquer la réticence des mères à<br />
emmener leurs enfants dans les centres de santé. En effet, l’étude réalisée au<br />
Nigeria montre que 46% des mères pensent que la rougeole a une cause<br />
surnaturelle. Selon ces mères, la rougeole serait l’œuvre de sorcières et de mauvais<br />
esprits (Ambe et al., 2001).<br />
70
V. La rougeole en Afrique 1. La rougeole au Cameroun<br />
Tableau 3 : Cas et Décès de la rougeole par province en 1999,<br />
2000 et 2001 au Cameroun<br />
Provinces<br />
Années<br />
1999 2000<br />
2001<br />
Cas Décès Cas Décès Cas Décès<br />
Adamaoua 358 12 701 30 1597 59<br />
Centre 76 1 970 18 4432 47<br />
Est 198 3 82 2 1811 17<br />
Ext. Nord 8343 178 6328 170 6380 118<br />
Littoral 226 2 1210 12 1493 9<br />
Nord 460 22 2104 61 3087 47<br />
Nord Ouest 488 10 463 24 758 7<br />
Ouest 340 3 1631 19 2262 21<br />
Sud 104 0 945 4 1589 21<br />
Sud ouest 301 17 195 10 525 6<br />
Total 10894 248 14629 350 23934 352<br />
Tableau 4 : Evolution de la couverture vaccinale et de l'incidence de la rougeole au Cameroun de<br />
1993 à 2001<br />
Année 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001<br />
Couverture<br />
Vaccinale<br />
Cas de<br />
rougeole<br />
32% 38% 46% 39% 43% 47% 46% 49% 47%<br />
14171 6712 5535 11770 7210 10731 10894 14629 23934<br />
71
Figure 8: Répartition des cas de rougeole au Cameroun (année 2000)<br />
1 point = 1 cas<br />
Extrême Nord<br />
Nord<br />
Nord Ouest<br />
Adamaoua<br />
Sud Ouest<br />
Ouest<br />
Centre<br />
Littoral<br />
Est<br />
Sud
V. La rougeole en Afrique 2. La rougeole dans le continent africain<br />
V.2. <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong> DANS LE CONTINENT AFRICAIN<br />
Malgré les efforts croissants de lutte contre la rougeole, cette maladie reste encore<br />
responsable de plus de 800 000 décès chez les enfants dans le monde, dont plus de la moitié<br />
en Afrique subsaharienne. Au Niger, 44513 cas et 237 décès ont été rapportés au cours du<br />
premier semestre de l’année 2001. Plusieurs raisons peuvent expliquer ces observations :<br />
i) Une faible couverture vaccinale. Bien que certains pays comme la Gambie aient<br />
des taux de couverture vaccinale élevés pour les maladies infantiles, d’autres, en<br />
particulier les pays d’Afrique de l’ouest et d’Afrique centrale, ont des taux de<br />
couverture vaccinale faible. En effet, en 1999, 14 pays au monde ont signalés une<br />
couverture vaccinale contre la rougeole inférieure à 50%. A part l’Afghanistan,<br />
tous sont africains. Outre le Niger, on trouve le Burkina Faso, le Burundi, le<br />
Cameroun, le Congo, Djibouti, le Libéria, Madagascar, la République<br />
démocratique du Congo, le Sénégal, la Somalie et le Togo (WHO/UNICEF, 2001).<br />
ii) Une sous-utilisation des services de santé. A cause des problèmes de mauvaise<br />
gestion et de logistique, on constate qu’il y a plusieurs occasions manquées de<br />
vaccination. Des études menées en République Centrafricaine et en Guinée<br />
montrent que la couverture vaccinale peut être augmentée de 20% tout<br />
simplement en s ‘assurant que les enfants éligibles sont vaccinés quand ils sont en<br />
contact avec les services de santé (Cutts et al., 1991, Kahn et al., 1995).<br />
iii) Un accès difficile aux services de santé. La longue distance entre le centre de santé<br />
et les habitations est un facteur qui aggrave la sous-utilisation des centres de santé<br />
et la mortalité infantile en Afrique. En effet, une étude menée au Niger montre que<br />
seulement 40% de la population a accès facilement aux centres de santé censés<br />
couvrir les besoins médicaux de la population vivant dans un rayon de 5 km<br />
(Chatain, 2001).<br />
iv) Une instabilité politique dans plusieurs pays. Les conflits en Afrique ont contribué<br />
à la baisse de la couverture vaccinale en entraînant de grands déplacements de<br />
population.<br />
v) Taux d’abandon élevé du vaccin contre la rougeole. Compte-tenu du fait que la<br />
vaccination contre la rougeole occupe la dernière place dans le calendrier de<br />
vaccination (tableau 5), on constate que le taux d’abandon est élevé par rapport au<br />
autres vaccins. En effet, une étude réalisée en Afrique à partir des données de 1998<br />
73
V. La rougeole en Afrique 2. La rougeole dans le continent africain<br />
montre que la couverture vaccinale pour la rougeole est d’au moins 10% inférieure<br />
à celle du BCG (Edmunds et al., 2001). Cette différence atteint 40 à 50% dans<br />
certains pays comme la Mauritanie. D’après ce taux d’abandon, on estime que<br />
dans l’année 2002, environ 3 millions d’enfants africains ayant accès aux services<br />
de vaccination ne seront pas vaccinés contre la rougeole (Edmunds et al., 2001).<br />
Au vu de ces donnés, il ressort que le problème de la rougeole en Afrique est le résultat<br />
d’un manque d’information et de formation sanitaire dans la communauté africaine. Bien que<br />
la plupart des mères ignorent les effets bénéfiques de la vaccination, le petit nombre qui<br />
connaît les bienfaits de la prévention d’une maladie se voit le plus souvent interdire par leurs<br />
époux d’emmener leurs enfants à l’hôpital (Ambe et al., 2001). L’éducation sanitaire doit<br />
donc se faire au niveau de toutes les couches de la société. Les chefs traditionnels et religieux<br />
et surtout les pères de famille devraient être impliqués dans les campagnes de vaccination. En<br />
plus de cette grande mobilisation sociale, des journées de vaccination nationale devraient être<br />
régulièrement organisées afin de rattraper les enfants qui n’ont pas été vaccinés et de corriger<br />
les problèmes d’échecs de la vaccination régulièrement observés chez certains enfants en<br />
Afrique.<br />
Tableau 5 : Calendrier de vaccination infantile recommandé par le PEV<br />
dans les pays en développement<br />
Schéma A<br />
Naissance BCG, VPO 0 HB 1<br />
Schéma B<br />
6 semaines DTC-1, VPO 1 HB 2 HB 1<br />
10 semaines DTC-2, VPO 2 HB 2<br />
14 semaines DTC-3, VPO 3 HB 3 HB 3<br />
9 mois<br />
Age<br />
vaccins<br />
Rougeole ,<br />
fièvre jaune*<br />
Vaccin anti-hépatite B**<br />
* Dans les pays où il existe un risque de fièvre jaune<br />
** Le schéma A est recommandé dans les pays où la transmission périnatale du virus<br />
de l'hépatite B est fréquente ( Asie du Sud -Est par exemple). Le schéma B est utilié<br />
dans les pays où elle est moins courante (Afrique subsaharienne par exemple)<br />
74
CHAPITRE VI. ETU<strong>DE</strong> <strong>DE</strong>S <strong>SOUCHES</strong><br />
<strong>AFRICAINES</strong> <strong>DU</strong> <strong>VIRUS</strong> <strong>DE</strong> <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong><br />
75
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
1. Interaction virus-cellules<br />
VI.1 INTERACTION <strong>VIRUS</strong>-CELLULES<br />
VI.1.1. Approche d’un virologiste à l’épidémiologie moléculaire<br />
La vaccination contre la rougeole a été intensifiée dans les pays en développement<br />
pendant ces dix dernières années. Si l'infection naturelle procure une protection à vie,<br />
plusieurs études montrent que le virus de la rougeole peut infecter des enfants vaccinés, sans<br />
entraîner de manifestations cliniques (Gustafson et al., 1987 ; Whittle et al., 1999b). La<br />
mémoire immunologique au niveau de la surface des muqueuses étant de courte durée,<br />
l'infection s'établit au niveau des cellules épithéliales du pharynx et stimule ainsi le système<br />
immunitaire qui élimine l'infection. Le passage du virus de la rougeole dans les populations<br />
vaccinées exposerait le virus à une immunosélection et à la production de variants qui seraient<br />
éventuellement moins efficacement neutralisés par l'immunité induite par le vaccin.<br />
L’objectif général de notre travail est d’étudier la diversité génétique du virus de la<br />
rougeole au cours du temps, en Afrique Centrale et en Afrique de l’Ouest. Ayant établi la<br />
première banque d’isolats de virus de la rougeole avec des échantillons obtenus dans ces pays<br />
en 1983/1984 et, grâce à plusieurs collaborations, nous avons analysé des isolats de plusieurs<br />
pays s’étendant de la Gambie jusqu’au Soudan, en passant par le Nigeria et le Cameroun.<br />
Afin de compléter nos études, nous sommes retournés au Cameroun en 2001 pour comparer<br />
les souches de virus ayant circulé pendant une période de 18 années.<br />
Jusqu’en 1996, l’OMS recommandait que le virus de la rougeole soit isolé sur les<br />
cellules Véro (cellules épithéliales de reins de singe). Avec ces cellules, il fallait effectuer<br />
plusieurs passages et attendre environ 4-5 semaines pour observer les effets cytopathiques.<br />
Depuis qu’il a été montré que des isolats cliniques se développent rapidement (4 jours) dans<br />
la lignée cellulaire B95a (lignée cellulaire B de singe), 10 000 fois plus sensibles que les<br />
cellules Véro (Kobune et al., 1990), l’OMS recommande maintenant les cellules B95a pour<br />
l’isolement viral. Cependant, les virus isolés sur les cellules B95a ont des propriétés<br />
biologiques différentes de ceux isolés sur les cellules Véro :<br />
- Au niveau de leur virulence. Les virus isolés sur les cellules B95a retiennent leur<br />
virulence. En effet, il a été montré que les singes infectés avec les virus isolés sur<br />
B95a développent des signes cliniques tels que l’éruption cutanée, la perte de poids,<br />
les tâches de Köplick, la leucopénie, semblables à ceux qu’on observe pendant la<br />
76
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
1. Interaction virus-cellules<br />
rougeole chez l’homme. Par contre, les virus isolés sur les cellules Véro ont un<br />
phénotype atténué chez le singe (Kobune et al., 1996).<br />
- Au niveau de leur antigénicité. Des différences antigéniques entre les virus isolés sur<br />
les cellules B95a et ceux isolés sur les cellules Véro ont été trouvées au niveau des<br />
protéines N et F (Kobune et al., 1990).<br />
En vue de l’étude comparative que nous voulions réaliser, il était nécessaire de vérifier<br />
que l’isolement sur ces différentes lignées cellulaires n’introduisait pas de modifications dans<br />
les gènes H et N utilisés pour l’étude phylogénétique.<br />
77
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
1. Interaction virus-cellules<br />
VI.1.2. Résumé de l’article 1<br />
Le virus de la rougeole isolé pour la première fois en 1953 , a subi plusieurs passages<br />
sur les cellules de rein humain et sur des fibroblastes de poulet jusqu'à ce qu'il ait un<br />
phénotype atténué, avant d'être utilisé comme vaccin. Pendant cette adaptation, plusieurs<br />
mutations ont été introduites dans le génome du virus (Parks et al., 2001). L'une des propriétés<br />
associées à la souche vaccinale est sa capacité à se répliquer dans les lignées cellulaires<br />
épithéliales et fibroblastiques humaines et simiennes, due en partie à sa capacité à utiliser la<br />
molécule CD46 comme récepteur cellulaire (Dorig et al., 1993 ; Naniche et al., 1993a).<br />
Récemment, il a été montré que la molécule S<strong>LA</strong>M est un récepteur cellulaire pour les<br />
souches sauvages et vaccinales du virus de la rougeole (Tatsuo et al., 2000 ; Hsu et al., 2001 ;<br />
Ono et al., 2001a).<br />
Après adaptation aux cellules Véro, les souches sauvages de virus de la rougeole<br />
devraient induire la formation de syncytia similaires à ceux observés dans les cellules<br />
infectées par les souches vaccinales. Ceci est en général corrélé à l'introduction de certaines<br />
mutations dans le gène H et spécialement au niveau de l'acide aminé 481 où l'asparagine de<br />
départ est remplacée par une tyrosine pour que le virus induise la fusion cellulaire<br />
(Lecouturier et al., 1996 ; Hsu et al., 1998).<br />
Le but de ce travail était d'examiner les propriétés d’une souche de virus de la<br />
rougeole au cours de son adaptation aux cellules B95a ou aux cellules Véro. Pour ce faire,<br />
nous avons utilisé la souche G954 isolée en Gambie en 1993 au cours d'une épidémie de<br />
rougeole.<br />
Le virus G954 sauvage (G954-PBL) a été maintenu dans les PBLs par infection de<br />
ceux–ci après stimulation avec la PHA. Par contre, le virus adapté (G954 Vp10) a été obtenu<br />
après 10 passages successifs dans les cellules Véro.<br />
Les effets cytopathiques et notamment la formation des syncytia ont été examiné.<br />
Les cellules Véro et B95a ont été infectées avec ;<br />
i) le virus G954-PBL. Dans les cellules B95a, on a pu observer au bout de 24h la<br />
formation des syncytia qui s'étendent rapidement aux autres cellules. Dans les cellules<br />
Véro par contre, après deux passages à 5 jours d'intervalles, les cellules gonflent mais ne<br />
fusionnent pas.<br />
ii) le virus G954-Vp10. On constate que même après adaptation, ce virus n’induit toujours<br />
pas de fusion dans les cellules Véro ; de plus, au cours de l'adaptation, il perd sa capacité<br />
à induire la fusion dans les cellules B95a.<br />
78
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
1. Interaction virus-cellules<br />
Compte-tenu du rôle de l'hémagglutinine et de la protéine de fusion dans le processus<br />
de fusion cellulaire, l'expression des glycoprotéines à la surface cellulaire a été examinée.<br />
Les résultats montrent une bonne expression des deux glycoprotéines à la surface cellulaire.<br />
Afin de déterminer si l'absence de fusion dans les cellules Véro infectées par la souche G954-<br />
Vp10 était due à des modifications de structure des glycoprotéines, l'ARNm a été extrait a<br />
partir de PBL infectés avec la souche G954, de B95a infectées avec la souche G954-PBL, et<br />
de cellules Véro infectées avec G954-Vp10. L’ADN obtenu après RT-PCR et PCR a été<br />
séquencé (Annexe 1). Les résultats montrent qu’un seul nucléotide change dans le gène H,<br />
mais cette mutation est silencieuse. La même mutation est observée pour le virus adapté aux<br />
cellules B95a et aux cellules Véro.<br />
La protéine F est synthétisée sous forme de polyprotéine inactive qui est ensuite clivée<br />
en deux formes biologiquement actives. Afin de s’assurer que la protéine F est<br />
fonctionnelle, les extraits de cellules Véro infectées par G954-Vp10 ou la souche Hallé<br />
(souche de type vaccinale : il est important de noter ici qu'il a été montré par Rima et al. 1995,<br />
suite à une étude phylogénétique, que la souche Hallé, longtemps considérée comme une<br />
souche de SSPE appartient au génotype A qui regroupe toutes les souches vaccinales) ont été<br />
déposés sur un gel de polyacrylamide. Après transfert sur membrane de nitrocellulose, la<br />
protéine F a été révélée avec un anticorps monoclonal (Ost-2) dirigé contre sa queue<br />
cytoplasmique et, de ce fait, reconnaît les formes F0 et F1 de la protéine. Les résultats<br />
(Annexe 2) montrent que la protéine F de la souche G954-Vp10 est aussi bien clivée que celle<br />
de la souche contrôle Hallé et est donc potentiellement fonctionnelle.<br />
Afin de déterminer les mécanismes par lesquels la souche G954 entre dans les cellules,<br />
l’interaction du virus avec les récepteurs cellulaires CD46 et S<strong>LA</strong>M a été examinée. Pour<br />
ce faire, les cellules B95a et Véro ont été infectées et une étude comparative de la modulation<br />
de S<strong>LA</strong>M et CD46 à la surface cellulaire a été réalisée. La molécule CD46 présente dans les<br />
cellules B95a comporte une délétion au niveau du SCR1 et de ce fait, n’est pas fonctionnelle<br />
comme récepteur pour la rougeole. Par contre, les cellules Véro n’expriment que CD46 et pas<br />
S<strong>LA</strong>M. L’infection des cellules B95a avec les souches Hallé et G954-Vp10 entraîne une<br />
régulation négative de S<strong>LA</strong>M, tandis que la molécule CD46 non fonctionnelle n’est pas<br />
modifiée. Par contre, l’infection des cellules Véro avec G954-Vp10 ne modifie pas le niveau<br />
de CD46, ce qui suggère que l’hémagglutinine de G954-Vp10 n’interagit pas avec CD46.<br />
Cependant, après infection avec le virus Hallé, la présence de CD46 n’est plus détectable avec<br />
l’anticorps monoclonal (13/42) dirigé contre le SCR1 de la molécule CD46. En revanche,<br />
l’utilisation de l’anticorps dirigé contre le SCR4 (10/88) montre seulement une petite<br />
79
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
1. Interaction virus-cellules<br />
diminution de CD46, ce qui suggère que l’absence de CD46 est due au fait que son site est<br />
masqué suite à l’interaction avec la protéine H.<br />
La capacité de G954-Vp10 à utiliser CD46 comme G954 a été étudiée. Pour cela,<br />
des cellules M12-CD46 (lignée cellulaire murine transfectée avec la molécule CD46 humaine)<br />
ont été infectées avec les souches G954-Vp10 et Edmonston (souche de type vaccinal).<br />
L’expression de la protéine H à la surface des cellules montre que seule la souche Edmonston<br />
est capable d’infecter ces cellules.<br />
Afin d’étudier la contribution de la molécule S<strong>LA</strong>M à la biologie des infections, les<br />
cellules Véro et Véro-S<strong>LA</strong>M (cellule Véro transfectées avec la molécule S<strong>LA</strong>M humaine),<br />
ont été infecté avec la souche G954-Vp10. Dans les cellules Véro-S<strong>LA</strong>M, la synthèse du<br />
virus est rapide et on observe le phénomène de fusion dès 24 heures après l’infection,<br />
conduisant à la destruction de la couche cellulaire au bout de 5 jours. De plus, la présence de<br />
S<strong>LA</strong>M est régulée négativement à cause de l’expression de la protéine H à la surface de ces<br />
cellules. Par contre, dans les cellules Véro, la synthèse du virus est lente, avec de faibles<br />
quantités de virus au départ, mais, en l’absence de fusion, le virus infectieux atteint au bout de<br />
7 jours des quantités 10 fois supérieures à celles présentent dans les cellules Véro exprimant<br />
S<strong>LA</strong>M. Ces observations montrent que l’infection des cellules par la souche G954-Vp10 est<br />
accélérée par la molécule humaine S<strong>LA</strong>M, ce qui entraîne la fusion.<br />
Dans cette étude, nous avons analysé un certain nombre de paramètres associés à<br />
l’adaptation du virus sauvage de la rougeole aux cellules en culture. Bien que le virus adapté<br />
aux B95a induise la formation des syncytia, le virus adapté aux cellules Véro quant à lui ne<br />
donne pas de fusion, mais produit de grandes quantités de virus sur une longue période. Nous<br />
avons montré que l’absence de fusion n’est pas due au blocage du processus de clivage de la<br />
protéine de fusion de G954-Vp10, cette dernière étant aussi bien clivé que la protéine de<br />
fusion de la souche Hallé. Les études d’adaptation des souches de virus de la rougeole aux<br />
cellules Véro ont montré que cette adaptation était accompagnée d’une atténuation de la<br />
virulence chez le singe (Kobune et al., 1996). Il a été montré que cette atténuation suite à<br />
l’adaptation du virus aux cellules Véro est associée à des mutations au niveau des gènes P et<br />
L ou P/V/C et M (Takeda et al., 1998 ; Takeuchi et al., 2000 ). Ainsi, si le virus entre dans les<br />
cellules, sa réplication serait limitée par le complexe transcriptase/réplicase. Les souches<br />
sauvages du virus de la rougeole utilisent CD150 (S<strong>LA</strong>M) comme récepteur, alors que les<br />
souches vaccinales peuvent en plus utiliser CD46. Notre étude sur les cellules Véro a montré<br />
que la souche sauvage G954-Vp10 du virus de la rougeole n’utilise pas CD46 ce qui confirme<br />
les résultats du séquençage c’est-à-dire aucun changement d’acide aminé dans la séquence de<br />
80
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
1. Interaction virus-cellules<br />
la protéine H. Etant donné que CD150 n’est pas exprimé sur les cellules Véro, le virus<br />
entrerait dans ces cellules soit par un troisième récepteur soit par un autre mécanisme.<br />
Le mécanisme d’entrée du virus dans les cellules reste à être élucidé. Ceci devrait<br />
aider à expliquer un certain nombre d’ambiguïtés observées dans le tropisme du virus de la<br />
rougeole. CD150 est présent dans les cellules T et B activées et les cellules dendritiques<br />
(Cocks et al., 1995 ; Tangye et al., 2000). Toutefois, on trouve des antigènes rougeoleux dans<br />
une variété de cellules, parmi lesquelles les cellules épithéliales et endothéliales où<br />
l’expression de CD150 n’a pas été montrée. Si les souches sauvages de virus de la rougeole<br />
utilisent CD150, elles utiliseraient soit un autre mécanisme pour infecter ces cellules, soit la<br />
molécule CD150 serait induite dans ces cellules au cours de l’infection.<br />
VI.1.3 Travaux additionnels à l’article<br />
Etant donné que la protéine M interagit avec les queues cytoplasmiques des<br />
glycoprotéines (Tyrell & Ehrnst, 1979), un changement de structure dans cette protéine<br />
pourrait affecter la fusion. Les séquences de la protéine M montrent une différence d’un acide<br />
aminé en position 89 entre le virus cultivé sur B95a (glu) et le virus adapté aux cellules Véro<br />
(lys) (Annexe 3).<br />
L’alignement des deux séquences de la protéine M de la souche G954 avec d’autres<br />
séquences présentes dans la base de données montre que la mutation introduite dans la<br />
protéine M après adaptation aux cellules Véro (lys en position 89) se retrouve dans les<br />
souches vaccinales. Par contre, la séquence de la protéine M obtenue après passage sur les<br />
cellules B95a est proche des séquences des souches sauvages ce qui suggère que cet acide<br />
aminé aurait un rôle dans l’atténuation des souches de virus de la rougeole.<br />
81
VI.1.4. Article 1 : Adaptation des souches sauvages du virus de la rougeole<br />
aux cellules en culture<br />
82
JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2002, p. 1505–1509 Vol. 76, No. 3<br />
0022-538X/02/$04.000 DOI: 10.1128/JVI.76.3.1505–1509.2002<br />
Copyright © 2002, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.<br />
NOTES<br />
Adaptation of Wild-Type Measles Virus to Tissue Culture<br />
Diane Waku Kouomou and T. Fabian Wild*<br />
INSERM U 404, CERVI, 69365 Lyon Cedex 07, France<br />
Received 31 July 2001/Accepted 24 October 2001<br />
Measles has a host range restricted to humans and monkeys in captivity. Fresh measles virus (MV) isolates<br />
replicate readily in several human and simian B-cell lines but need a period of adaptation to other types of<br />
cells. The identification of CD46 and CD150 (S<strong>LA</strong>M) as cellular receptors for MV has helped to clarify certain<br />
aspects of the immunobiology of MV infections. We have examined the properties of an MV wild-type strain<br />
grown in the epithelial cell line Vero. After adaptation, this virus expressed high levels of both the viral<br />
glycoproteins (hemagglutinin and fusion protein) but did not induce fusion (syncytia). No changes in the amino<br />
acid sequence were found in either of the viral glycoproteins. Using several approaches, the Vero-adapted virus<br />
could not be shown to interact with CD46 either in the initiation or during the course of infection. The presence<br />
of human S<strong>LA</strong>M expressed in the Vero cells rapidly gave rise to fusion and lower yields of infectious virus.<br />
Despite the availability of an efficient vaccine, measles remains<br />
one of the major causes of infant mortality. Molecular<br />
epidemiological studies have established that despite the monotypic<br />
status, measles viruses (MVs) from geographically different<br />
regions can be differentiated by nucleic acid sequence<br />
analysis (20); however, the biological significance of these observations,<br />
if any, remains to be established. MV was first<br />
isolated in 1953 and was initially passaged in primary embryo<br />
human kidney cells and then serially passaged in chicken embryo<br />
fibroblasts until it had an attenuated phenotype when<br />
reinoculated into children. During this adaptation, there were<br />
a number of mutations introduced into the MV genome (14).<br />
Among the properties associated with the vaccine virus was the<br />
ability to replicate in human and monkey epithelial and fibroblastic<br />
cell lines. This has been shown to be due in part to the<br />
ability of the vaccine virus to use the molecule CD46 as a cell<br />
receptor (1, 10). During MV replication the expression of the<br />
MV hemagglutinin (HA) at the surface of the cells leads to the<br />
down-regulation of the CD46 (11), which is one of the proteins<br />
responsible for protecting the cell from complement lysis, and<br />
this leads to an increased susceptibility to lysis by complement<br />
factors (16). It has been proposed that this may be an attenuating<br />
property.<br />
Whereas the virus can be rapidly isolated from clinical specimens<br />
in both human and monkey B-cell lines (6), isolation on<br />
epithelial cells such as Vero cells can take weeks and several<br />
blind passages. Recently it was shown that freshly isolated MV<br />
could attach to the cellular receptor CD150 (S<strong>LA</strong>M) and the<br />
vaccine strain could use either this molecule or CD46 (5, 12,<br />
19).<br />
After adaptation to Vero cells, the virus may induce syncytia<br />
similar to those in cells infected by the vaccine strain. This is<br />
* Corresponding author. Mailing address: INSERM U 404, CER<br />
VI - 21, Avenue Tony Garnier, 69365 Lyon Cedex 07, France. Phone:<br />
33 4 37 28 23 92. Fax: 33 4 37 28 23 91. E-mail: wild@cervi-lyon.inserm<br />
.fr.<br />
usually correlated to the introduction of certain mutations in<br />
the HA, especially at position 481, where the wild-type amino<br />
acid, which is normally Asn, may be mutated to Tyr in order to<br />
become syncytial (4, 7). Our studies have established that the<br />
amino acid at 481 and to a lesser extent that at amino acid 451<br />
govern the ability of the virus to efficiently use CD46 as a<br />
receptor and also its ability to down-regulate this molecule<br />
from the cell surface (8). In monkey models, MVs isolated in<br />
B-cell lines retain their virulent pathogenic phenotype, in contrast<br />
to viruses isolated in Vero cells, which become attenuated<br />
(17). Sequence studies have identified differences in the HA,<br />
P/V/C, M, and L genes between the virulent and attenuated<br />
strains (17, 18).<br />
In the present study we have examined the properties of<br />
an MV isolate during its adaptation to B95a (monkey B-cell<br />
line) or Vero (monkey epithelial) cell lines. We show that<br />
after adaptation to Vero cells, this virus is unable to induce<br />
fusion. The amino acid sequences of the HA and fusion (F)<br />
proteins are unchanged, and the F protein precursor, F0, is<br />
cleaved into the potentially biologically active subunits F1<br />
and F2. Further, we show that the Vero-adapted virus does<br />
not enter the cell by CD46. As Vero cells do not express<br />
S<strong>LA</strong>M, this poses the question of how the virus infects Vero<br />
cells.<br />
MV adaptation to B95a and Vero cells. An MV isolate,<br />
G954, which had been maintained by infection of phytohemagglutinin-stimulated<br />
peripheral blood lymphocyte (PBL) cultures<br />
was used to infect B95a and Vero cells. In B95a cells<br />
syncytia were observed within 24 h, rapidly extending to the<br />
majority of the cells. In contrast, a cytopathic effect or fusion<br />
was not observed in the Vero cells. These cells were passaged<br />
twice at 5-day intervals before detecting MV antigen-positive<br />
cells. In this case the cells became enlarged but did not display<br />
classical fusion. This virus (freeze-thawed cells) was serially<br />
passaged 10 times in Vero cells, and at this point the adapted<br />
virus, G954.V10, was further characterized.<br />
Infection of either B95a or Vero cells with G954.V10<br />
1505
1506 NOTES J. VIROL.<br />
FIG. 1. MV infection of Vero and B95a cells. (A) Flow cytometry<br />
analysis of MV G954.V10 infected cells. The cells were stained with<br />
anti-HA, monoclonal antibody 55 (2), or anti-F monoclonal antibody<br />
263 (9). Continuous lines represent infected cells, and the dotted lines<br />
represent the uninfected control cells. (B) Morphology (fusion) of<br />
MV-infected Vero and B95a cells. Cells were infected at 1 PFU/cell for<br />
G954.V10 and Hallé and 0.1 PFU/cell for G954-PBL. Photographs<br />
were taken 48 h after infection.<br />
showed that although there was a high expression of both<br />
viral glycoproteins at the cell surface as shown by FACScan<br />
analysis (Fig. 1A), no fusion was observed. In control cultures,<br />
infection of Vero or B95a cells with Hallé (vaccinelike)<br />
or B95a cells with G954-PBL induced fusion (Fig. 1B).<br />
To study whether the lack of fusion in the Vero-adapted<br />
G954 virus was due to modifications in the structure of<br />
either of the glycoproteins, the mRNA from PBLs and B95a<br />
and Vero cells infected with the corresponding virus were<br />
subjected to reverse transcription-PCR and the DNA was<br />
sequenced with the Big Dye terminator system (accession<br />
no. for H and F, AY059391 and AY059392, respectively). A<br />
single nucleotide change in the HA was found at position<br />
7278 in the genome (A3G) but did not lead to a change in<br />
the amino acid sequence. The same change was observed<br />
when the virus was adapted to either Vero or B95a cells.<br />
MV-F protein is synthesized as the precursor F0, which is<br />
cleaved into the biologically active form F1 plus F2. Although<br />
the sequence is unaltered, we examined the possibility<br />
that the F expressed in Vero cells by G954.V10 was not<br />
cleaved. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis<br />
and Western blotting of the virus-infected cell ex-
VOL. 76, 2002 NOTES 1507<br />
FIG. 2. Flow cytometry analysis of the cell surface expression of CD46 and S<strong>LA</strong>M in MV infection. B95a and Vero cells infected with either<br />
Hallé or G954.V10 were stained either with anti-CD46 monoclonal antibodies 13/42 and 10/88 (J. Schneider-Schaulies, Würzburg, Germany) or<br />
anti-S<strong>LA</strong>M IPO3 (Biodesign International). Continuous lines represent MV-infected cells. Dotted lines represent control uninfected cells.<br />
tracts showed that F was cleaved to the same extent in both<br />
viruses (results not shown).<br />
CD46 and S<strong>LA</strong>M as cell receptors. The interaction of MV<br />
HA with its cellular receptors initiates the infection. Later<br />
during the virus cycle when this viral glycoprotein is expressed<br />
at the surface of the cell, it can interact with the receptors on<br />
neighboring cells. It has been reported that MV lymphotropic<br />
strains use S<strong>LA</strong>M whereas vaccine strains can also use CD46.<br />
To investigate the mechanism(s) by which G954.V10 enters<br />
cells, we infected B95a and Vero cells and compared the modulations<br />
of CD46 and/or S<strong>LA</strong>M at the cell surface. In B95a<br />
cells, CD46 lacks SCR-1 and so is nonfunctional as an MV<br />
receptor (3). Infection by either Hallé or G954.V10 downregulated<br />
S<strong>LA</strong>M, whereas the nonfunctional CD46 in B95a<br />
cells was not modified (Fig. 2). Vero cells express only CD46<br />
and not S<strong>LA</strong>M. Infection with G954.V10 did not alter the<br />
levels of CD46 even though high levels of the HA were expressed.<br />
In contrast, after infection with Hallé the presence of<br />
CD46 was undetectable with an anti-CD46 monoclonal antibody<br />
directed to the SCR-1 (13/42,) but when an antibody to<br />
SCR-4 (10/88) was used the level of CD46 was only slightly<br />
reduced. This may suggest that the lack of detection with 13/42<br />
is due to the masking of the site caused by the interaction with<br />
the HA. Thus, either G954.V10 HA does not interact with<br />
CD46 or its interaction is of an affinity too low to be detected<br />
by this method.<br />
To compare the ability of Edmonston and G954.V10 to use<br />
CD46 as a receptor we infected a murine cell line (M12-CD46)<br />
which was transfected with the human CD46 (10). As measured<br />
by the expression of the HA at the cell surface, only the<br />
Edmonston strain could infect these cells (Fig. 3). We confirmed<br />
that infection of the cells was via CD46, as preincubation<br />
with the monoclonal anti-CD46 antibody 13/42 blocked<br />
infection (results not shown). These studies suggest that MV<br />
G954 in adapting to Vero cells does not use CD46, although<br />
when S<strong>LA</strong>M is available it can still use it.<br />
G954 adapted to grow in Vero retains its ability to interact<br />
(down-regulation) with simian S<strong>LA</strong>M but not to induce fusion.
1508 NOTES J. VIROL.<br />
FIG. 3. Flow cytometry analysis of MV-infected M12-CD46 cells. M12-CD46 cells were infected with Edmonston or G954.V10 (1 PFU/cell).<br />
At 72 h postinfection, cells were analyzed for HA (monoclonal antibody 55) and F (monoclonal antibody 263) expression. Continuous lines<br />
represent the infected cells. Dotted lines represent the uninfected control cells.<br />
In contrast, infection of Vero cells expressing human S<strong>LA</strong>M<br />
induced syncytia. To study the contribution of S<strong>LA</strong>M to the<br />
biology of the infections, Vero and Vero-S<strong>LA</strong>M cells were<br />
infected with G954.V10 virus and the virus synthesis and fusion<br />
properties were examined. In the Vero-S<strong>LA</strong>M cultures, fusion<br />
was initiated within 24 h, leading to the destruction of the cell<br />
monolayer by 5 days. In contrast, infection of Vero cells initially<br />
yielded lower levels of virus, but in the absence of fusion,<br />
the infectious virus yield eventually rose to more than 10 times<br />
that of the S<strong>LA</strong>M expressing cells (7 days) (Fig. 4).<br />
In our studies, we examined the adaptation of a wild-type<br />
MV to replicate in Vero cells. After a period of adaptation the<br />
virus grew to high titers without inducing fusion. As the predicted<br />
amino acid sequence of the two viral glycoproteins was<br />
unchanged, this suggests that the ability to replicate in Vero<br />
cells was not at the receptor level. This was substantiated by<br />
showing that the virus did not use CD46 as a receptor, which is<br />
in agreement with a lack of Tyr at position 481 for CD46 usage<br />
(7). However, as Vero cells do not express S<strong>LA</strong>M, the mechanism<br />
by which the virus infects the cell remains to be determined.<br />
In human immunodeficiency virus infections, the virus<br />
can incorporate cellular proteins which can attach to their<br />
corresponding ligands on host cells (reviewed in references<br />
13 and 15). However, in our system, anti-Vero sera failed to<br />
neutralize G954.V10 infection of Vero cells (T. F. Wild, unpublished<br />
results). In the present study, we have analyzed a<br />
number of the parameters displayed by wild-type MV when<br />
adapted to tissue culture. MV can enter such cells and following<br />
a period grows to high titers without giving classical fusion.<br />
These observations may be relevant to the in vivo situation in<br />
which viral antigen is found in cells which are not known to<br />
express the MV wild-type receptor S<strong>LA</strong>M. It remains to be<br />
established if these cells become infected by a mechanism<br />
similar to the present studies or via a third MV cell receptor.<br />
We thank Bernadette Maret for editorial assistance and H. Whittle<br />
(Gambia) for lymphocytes from measles patients.<br />
This work was supported by a grant (no. HHC02F) from the Rhône-<br />
Alpes Région. D. Waku Kouomou was supported by a scholarship<br />
from the Ministry of Foreign Affairs and Cooperation.<br />
FIG. 4. Comparison of MV G954.V10 growth cycles in Vero and<br />
Vero-S<strong>LA</strong>M cells. Vero and Vero-S<strong>LA</strong>M cells were infected with<br />
G954.V10 (0.1 PFU/cell). The yield of virus (cells plus supernatant)<br />
was titrated on Vero-S<strong>LA</strong>M cells.<br />
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Fernandez-Munoz, T. F. Wild, and R. Buckland. 1996. Identification of two<br />
amino acids in the hemagglutinin glycoproteins of measles virus (MV) that<br />
govern hemadsorption, HeLa cell fusion and C46 downregulation: phenotypic<br />
markers that differentiate vaccine and wild-type MV strains. J. Virol.<br />
70:4200–4204.<br />
8. Lecouturier, V., A. Rizzitelli, J. Fayolle, L. Daviet, T. F. Wild, and R. Buckland.<br />
1999. Interaction of measles virus (Hallé strain) with CD46: evidence<br />
that a common binding site on CD46 facilitates both CD46 downregulation<br />
and MV infection. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:268–275.<br />
9. Malvoisin, E., and T. F. Wild. 1990. Contribution of measles virus fusion<br />
protein in protective immunity: anti-F monoclonal antibodies neutralize<br />
virus infectivity and protect mice against challenge. J. Virol. 64:5160–5162.<br />
10. Naniche, D., G. Varior-Krishnan, F. Cervoni, T. F. Wild, B. Rossi, C. Rabourdin-Combe,<br />
and D. Gerlier. 1993. Human membrane cofactor protein<br />
(CD46) acts as a cellular receptor for measles virus. J. Virol. 67:6025–6032.<br />
11. Naniche, D., T. F. Wild, C. Rabourdin-Combe, and D. Gerlier. 1993. Measles<br />
virus haemagglutinin induces down regulation of gp57/67, a molecule involved<br />
in virus binding. J. Gen. Virol. 74:1073–1079.<br />
12. Ono, N., H. Tatsuo, Y. Hidaka, T. Aoki, H. Minagawa, and Y. Yanagi. 2001.<br />
Measles virus on throat swabs from measles patients use signaling lymphocytic<br />
activation molecule (CDw150) but not CD46 as a cellular receptor.<br />
J. Virol. 75:4399–4401.<br />
13. Ott, D. E. 1997. Cellular proteins in HIV virions. Rev. Med. Virol. 7:167–<br />
180.<br />
14. Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A.<br />
Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus<br />
strains in the Edmonston vaccine lineage. J. Virol. 75:910–920.<br />
15. Roberts, B. D., and S. T. Butera. 1999. Host protein incorporation is conserved<br />
among diverse HIV-1 subtypes. AIDS 13:425–427.<br />
16. Schnorr, J. J., L. M. Dunster, R. Nanan, J. Schneider-Schaulies, S. Schneider-Schaulies,<br />
and V. ter Meulen. 1995. Measles virus-induced down-regulation<br />
of CD46 is associated with enhanced sensitivity to complement-mediated<br />
lysis of infected cells. Eur. J. Immunol. 25:976–984.<br />
17. Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M.<br />
Asakawa, and Y. Nagai. 1998. Measles virus attenuation associated with<br />
transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase<br />
and accessory proteins. J. Virol. 72:8690–8696.<br />
18. Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune, and M. Tashiro. 2000. Comparative<br />
nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and<br />
vero cell-isolated measles viruses from the same patient. Virus Genes 20:<br />
253–257.<br />
19. Tatsuo, H., N. Ono, K. Tanaka, and Y. Yanagi. 2000. S<strong>LA</strong>M (CDw150) is a<br />
cellular receptor for measles virus. Nature 406:893–897.<br />
20. World Health Organization. 1998. Expanded Programme on Immunization<br />
(EPI). Standardization of the nomenclature for describing the genetic characteristics<br />
of wild-type measles viruses. Wkly. Epidemiol. Rec. 73:265–272.
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
2. Etudes épidémiologiques<br />
VI.2. ETU<strong>DE</strong>S EPI<strong>DE</strong>MIOLOGIQUES<br />
VI.2.1. Historique de la surveillance du virus de la rougeole en Afrique<br />
L’Afrique reste l’un des réservoirs majeurs de la rougeole dans le monde avec plus de<br />
500.000 décès par an dus à la rougeole. Cependant, la maladie y étant endémique, la diversité<br />
génétique des souches de virus de la rougeole est restreinte actuellement à 3 clades (A, B, D).<br />
Les premières souches africaines de virus de la rougeole ont été isolées à Yaoundé au<br />
Cameroun en 1983 par le Dr. Fabian WILD. Ces isolats forment actuellement le génotype B1<br />
(Taylor et al., 1991). Les souches isolées au Gabon en 1984 se sont révélées assez différentes<br />
de celles isolées l’année précédente au Cameroun pour former le génotype B2. Par la suite,<br />
d’autres virus ont été isolés dans plusieurs pays africains (Tableau 6), notamment en Afrique<br />
du sud, où on a trouvé des virus appartenant aux génotypes A et D2, au Kenya et en Ethiopie,<br />
où circulent les virus du génotype D4. En Gambie et au Ghana, on trouve les virus du<br />
génotype B3.2, tandis qu’au Soudan on a le génotype B3.1. En revanche, au Nigeria, les<br />
génotypes B3.1 et B3.2 co-circulent.<br />
La répartition des différents génotypes sur le continent Africain montre que les virus<br />
appartenant au clade B sont le plus souvent retrouvés en Afrique de l’Ouest et en Afrique<br />
Centrale, tandis que les virus du clade D se trouvent le long de la côte Est et au Sud (Figure<br />
9). Le génotype A retrouvé en Afrique du sud reste le seul cas en Afrique. Etant donné que les<br />
clades A et D sont également retrouvés en Europe, ces virus auraient été importés pendant la<br />
colonisation.<br />
Dans le cadre de la lutte contre la rougeole lancée par l’OMS, les campagnes de<br />
vaccination de masse sont mises en œuvre dans plusieurs pays d’Afrique. Une surveillance<br />
virologique avant la vaccination de masse est fondamentale en ce sens qu’elle permettra<br />
d’évaluer les programmes de vaccination. Le continent Africain représente aujourd’hui une<br />
région idéale pour suivre l’évolution de la lutte contre la rougeole par l’épidémiologie<br />
moléculaire.<br />
Pour cette étude, nous avons choisi deux sites :<br />
- Le Cameroun, où la couverture vaccinale est inférieure à 50 %. Le tourisme n’y étant<br />
pas très développé, les risques d’importation de virus sont limités. Nous avions au<br />
laboratoire des souches de virus isolés au Cameroun en 1983.<br />
- La Gambie, où la couverture vaccinale élevée a été maintenue au dessus de 84%<br />
pendant ces 10 dernières années. Ce pays est situé sur la côte Ouest et ancré dans le<br />
88
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
2. Etudes épidémiologiques<br />
Sénégal qui est un pays très touristique, les échanges internationaux y sont très<br />
fréquents.<br />
Tableau 6 : Isolement des souches de virus de la rougeole en Afrique par ordre<br />
chronologique (1983-2000).<br />
Année(s)<br />
d'isolement<br />
Pays Génotypes Références<br />
1983 Cameroun B1 Taylor et al., 1991<br />
1984 Gabon B2 Taylor et al., 1991<br />
1986-1989 Afrique du Sud D2, A Kreis et al., 1997<br />
1991 Gambie B3.2 Outlaw et al., 1997<br />
1994 Kenya (USA)* D4 Bellini & Rota, 1998<br />
1997-1998 Nigéria , Ghana B3.1, B3.2 Hanses et al., 1999<br />
1998-1999 Ethiopie D4 Nigatu et al., 2001<br />
1997-2000 Soudan B3.1 El Mubarak et al., 2002<br />
* Virus isolé aux Etats-Unies sur un patient arrivant du Kenya<br />
89
Figure 9 : Répartition géographique des différents génotypes du virus de la<br />
rougeole en Afrique<br />
Gambie<br />
B3<br />
B3.1 et<br />
B3.2<br />
B3.2<br />
Ghana<br />
Nigéria B1<br />
Cameroun<br />
Gabon<br />
B2<br />
B3.1<br />
Soudan<br />
D4<br />
Ethiopie<br />
D4<br />
Kenya<br />
A et D<br />
Afrique du Sud
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
2. Etudes épidémiologiques<br />
VI.2.2. Résumé de l'article 2<br />
Bien que le virus de la rougeole ait toujours été considéré comme sérologiquement<br />
monotypique, la diversité génétique des isolats obtenus de différentes régions géographiques<br />
ces dernières décennies a permis de les classer en 8 clades (Rima et al., 1995 ; WHO, 2001a).<br />
Cette classification est basée sur les séquences nucléotidiques du gène H entier et la partie C-<br />
terminale du gène N. Cependant, très peu d’informations sont disponibles quant à la variété<br />
des souches de virus circulant au cours d’une même épidémie et/ou entre plusieurs épidémies<br />
sur un même site géographique.<br />
Des études réalisées récemment au Soudan ont montré une variation des 0-0,5% entre<br />
les gènes H des souches isolées entre 1997 et 2000 (El-Mubarak et al., 2002). Par contre, les<br />
études réalisées au Nigeria ont montré que deux génotypes différents du virus de la rougeole<br />
co-circulaient à Lagos et Ibadan en 1998 (Hanses et al., 1999). Une autre étude réalisée en<br />
Australie sur des échantillons isolés sur une période de 25 ans (1973-1998) a monté une<br />
succession de différents génotypes de virus de la rougeole au cours du temps à Victoria<br />
(Chibo et al., 2000).<br />
Le but de cette étude est d’évaluer la diversité des souches de virus de la rougeole au<br />
cours de la même épidémie et entre différentes épidémies en Afrique centrale et en Afrique de<br />
l’ouest. Pour ce faire, nous disposions au laboratoire des souches de virus de la rougeole<br />
isolées au Cameroun en 1983 et en Gambie en 1993. Nous avions besoin de souches récentes<br />
et je me suis rendue à Yaoundé au Cameroun au début de l’année 2001 pour isoler les souches<br />
de virus de la rougeole circulant au Cameroun (voir paragraphe VI.3.) afin de les analyser et<br />
de les comparer à celles qui y avaient été isolées 18 ans auparavant, et aux souches de Gambie<br />
(1993).<br />
Afin d’étudier les caractéristiques génétiques de ces virus, le génome viral a été extrait<br />
et soumis à une RT-PCR. Le gène H entier et la partie C-terminale du gène N ont été<br />
amplifiés par PCR et séquencés.<br />
Pour établir la variabilité des virus circulant au cours d’une même épidémie, nous<br />
avons séquencé les gènes H et N de 3 isolats provenant de Gambie (1993) et 4 autres du<br />
Cameroun (2001). Les résultats montrent qu’il y a une différence de 2 nucléotides (mutations<br />
silencieuses) au niveau du gène H entre les isolats de Gambie (1993) (Annexe 4) et de 3<br />
nucléotides entre les isolats du Cameroun (2001) dont un est responsable du changement d’un<br />
acide aminé dans la souche CR 83 (Valine ->glycine en position 269). Par contre, aucune<br />
91
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
2. Etudes épidémiologiques<br />
différence n’a été détecté dans le gène N (Annexe 5) . Ces résultats montrent qu'il y a une<br />
forte homogénéité entre les virus de la même épidémie.<br />
La variabilité du virus de la rougeole entre différentes épidémies survenues sur<br />
le même site (Yaoundé) à 18 années d’écarts a été étudiée. La comparaison des séquences<br />
des gènes H et N des souches isolées en 2001 avec celles des souches isolées en 1983 indique<br />
une différence de 7 acides aminés dans la protéine H (Annexe 6).<br />
L’étude phylogénétique effectuée à partir des séquences des gènes H et N montre que<br />
les isolats de Yaoundé 2001 appartenaient au génotype B3.1 circulant au Nigeria et au Soudan<br />
(El-Mubarak et al., 2002, Hanses et al., 1999) et non pas au génotype B1 isolé au Cameroun<br />
en 1983. Etant donné que :<br />
- les séquences des gènes H et N de la souche de référence pour le génotype B1 (Y14)<br />
avaient été obtenues à partir d’un clone et n’étaient donc peut être pas représentatives<br />
des virus circulant à Yaoundé pendant cette période.<br />
- nous observons une grande différence entre la souches de 2001 et celles de 1983<br />
Pour lever toute ambiguïté, nous avons séquencé à nouveau les gènes H des souches<br />
Y14 et Y22 isolées en 1983 à partir de produit PCR direct. La séquence de Y14 que nous<br />
avons obtenue est identique à la séquence de référence, par contre elle diffère de Y22 par 2<br />
acides aminés seulement (Annexe 6). Les isolats de Gambie quant à eux appartenaient au<br />
génotype B3.2 circulant au Ghana (Hanses et al., 1999). Contrairement au observations<br />
précédentes, ces résultats montrent une grande hétérogénéité entre les virus de différentes<br />
épidémies.<br />
Afin de mieux établir la distribution des virus africains, nous avons séquencé un<br />
isolat obtenu à Lyon en 1994 (Lys-1) sur un patient qui avait contracté la rougeole au cours de<br />
son séjour en Gambie. La comparaison de la souche Lys-1 avec les souches de Gambie de<br />
1993, indique une différence de 8 nucléotides dans le gène H (Annexe 7) et 2 dans le gène N.<br />
Aucun changement d'acides aminés n'a été noté, ce qui confirme son origine et sa stabilité<br />
génétique. De plus, l’analyse phylogénétique montre que la souche lys-1 appartient au<br />
génotype B3.2 comme les souches gambiennes (1993).<br />
Il a été montré que la souche Lys-1 comporte une mutation (Arginine->Lysine en<br />
position 70) dans le site antigénique majeur de la protéine F (Fayolle et al., 1999). Cette<br />
mutation a été identifiée par l’absence de réactivité de la souche Lys-1 avec l’anticorps<br />
monoclonal dirigé contre la protéine F (F186), qui réagit avec la souche vaccinale et d’autres<br />
souches sauvages. Etant donné que la souche Lys-1 appartient au génotype B3.2, nous avons<br />
voulu savoir si cette mutation était spécifique à la souche Lys-1 où si elle était étendue à<br />
92
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
2. Etudes épidémiologiques<br />
d’autres souches. Pour ce faire, nous avons analysé plusieurs souches de virus d’origines<br />
différentes, appartenant au génotype B3. Les résultats montrent que toutes les souches du<br />
génotype B3.1 réagissent à l’anticorps F186, tandis que celles du génotype B3.2 ne sont pas<br />
reconnues par cet anticorps. L’analyse des séquences de trois souches de Gambie (génotype<br />
B3.2) a permis de confirmer la présence de la même mutation en position 70 de la protéine F<br />
(annexe 8).<br />
Il a été montré que les virus du génotype B3.1 peuvent être distingués des virus du<br />
génotype B3.2 par des tests de neutralisation avec l’anticorps BH30 dirigé contre<br />
l’hémagglutinine. Seuls les virus du génotype B3.1 sont neutralisés par cet anticorps (Hanses<br />
et al., 1999 ; Truong et al., 1999). Nous avons utilisé cet anticorps afin d’examiner par<br />
cytométrie en flux sa réactivité vis-à-vis de différentes souches du génotype B3. Les résultats<br />
montrent que l’anticorps BH30 s’attache avec la même affinité aux souches du génotype B3.1<br />
et aux souches vaccinales. Par contre, il s’attache aux souches du génotype B3.2 avec une<br />
affinité 10 fois inférieure à celle des souches vaccinales. L'alignement des séquences d'acides<br />
aminés de la protéine HA des virus des génotypes B3.1 et B3.2 montre une différence de 4<br />
acides aminés entre les deux groupes. Etant donné que seul l'acide aminé 471 est différent<br />
entre la souche vaccinale et les virus B3.2, il est probable que cet acide aminé joue un rôle<br />
crucial dans la reconnaissance de l'anticorps BH30.<br />
Dans cette étude, nous avons montré que les virus appartenant au génotype B3.2<br />
peuvent être distingués au niveau antigénique des virus appartenant au génotype B3.1 et des<br />
souches vaccinales. L'anticorps monoclonal dirigé contre la protéine F (F186) réagit avec les<br />
souches vaccinales et les virus des génotypes B3.1, mais ne reconnaît pas les virus du<br />
génotype B3.2. De plus, l'anticorps monoclonal dirigé contre la protéine H (BH30) réagit avec<br />
une moindre affinité avec les virus du génotype B3.2. L'analyse phylogénétique a permis de<br />
montrer que les souches B3.2 circulent en Afrique de l'ouest, tandis que les virus B3.1<br />
circulent en Afrique centrale et au Soudan. De plus nous avons montré que les souches<br />
circulant actuellement au Cameroun (B3.1) sont différentes de celles isolées sur le même site<br />
il y a 18 ans (B1). Il est possible que les virus isolés en 1983 n'aient pas été représentatifs des<br />
virus circulant à cette époque, ce qui expliquerait l'absence de virus appartenant au génotype<br />
B1 parmi les souches du Cameroun (2001) que nous avons analysées. Il est aussi possible que<br />
les virus du génotype B3.1 aient été importés du Nigeria où les virus appartenant à ce<br />
génotype ont été isolés (Hanses et al., 1999). Les virus B3.1 auraient été sélectivement<br />
avantagés, à cause des campagnes de vaccination au cours desquelles les virus B1 ont été<br />
réduits, ce qui a permis aux souches importées de mieux s'implanter au Cameroun.<br />
93
VI. Etude des souches Africaines du virus de la rougeole<br />
2. Etudes épidémiologiques<br />
Cependant, la couverture vaccinale étant inférieure à 50% au Cameroun, il est possible que<br />
d’autres facteurs soient impliqués dans la survie des souches B3.1 dans la population.<br />
La majorité des souches appartenant au génotype B3.2 circulent en Gambie où la<br />
couverture vaccinale a été maintenue élevée pendant ces 10 dernières années (>84%). Par<br />
contre, les virus appartenant au génotype B3.1 circulent dans les pays où la couverture<br />
vaccinale est faible (
VI.2.3. Article 2 : Etude des souches du virus de la rougeole circulant en<br />
Afrique Centrale et en Afrique de l’Ouest : répartition géographique des<br />
souches appartenant au génotype B3<br />
95
Measles virus strains circulating in Central and West Africa: Geographical distribution<br />
of two B3 genotypes<br />
D. Waku Kouomou 1 , E. Nerrienet 2 , J. Mfoupouendoun 2 , G. Tene 3 , H. Whittle 4 ,<br />
and T.F. Wild 1<br />
1 INSERM U404, CERVI, 69365 Lyon Cedex 07, France<br />
2 Centre Pasteur du Cameroun, BP. 1274, Yaoundé, Cameroon<br />
3 Hôpital Central de Yaoundé, Fondation Chantal Biya, - Centre mère-enfant, BP. 87,<br />
Yaoundé, Cameroon<br />
4 MRC Laboratories, Fajara, PO Box 273, Banjul, The Gambia.<br />
Short title : Epidemiology of measles in Africa<br />
Key words : epidemiology, Cameroon, vaccination<br />
Correspondence to : Dr T.F. Wild,<br />
INSERM U. 404 – Immunity and Vaccination<br />
CERVI<br />
21, Avenue Tony Garnier,<br />
69365 Lyon Cédex 03<br />
France<br />
Tel. 33 (0)4 37 28 23 92<br />
Fax. 33 (0)4 37 28 23 91<br />
e-mail : wild@cervi-lyon.inserm.fr<br />
96
ABSTRACT<br />
Africa remains one of the major reservoirs of measles infection. Molecular<br />
epidemiological studies have permitted different measles virus isolates to be grouped into<br />
clades and genotypes and the major group which has been identifed as indigenous to Africa is<br />
the clade B. We have analysed the viruses from epidemics in the Gambia (1993) and in the<br />
Cameroon (2001). In both studies, the homogeneity of the virus isolates within the epidemic<br />
as shown by sequence analysis revealed less than 0.2% variation of nucleotides between<br />
isolates. The measles viruses isolated in 1983 in Yaoundé, Cameroon, were designated as the<br />
B1 genotype. However, in 2001 only viruses belonging to the B3 genotype were found in this<br />
city. The viruses in the Gambia (1993) were also of the B3 genotype. However, these viruses<br />
could be distinguished from each other at the antigenic level and by comparative sequence<br />
analysis. The B3 Cameroon (2001) viruses were related to the proposed B3.1 subgroup,<br />
whereas the Gambian (1993) isolates corresponded to the B3.2 subgroup. The geographical<br />
distribution for the period 1993-2001 of these two viruses shows that B3.1 is found from the<br />
Sudan to Nigeria and Ghana extending south to the Cameroon, whereas the B3.2 genotype is<br />
found in West Africa. In Nigeria and Ghana the viruses co-circulate. The identification of<br />
these viruses will permit more meaningful epidemiological studies following the proposed<br />
increased measles vaccination coverage.<br />
INTRO<strong>DU</strong>CTION<br />
Epidemiological studies are essential for the successful planning and application of<br />
vaccination programs. The aim may be simply to reduce the disease burden or target<br />
eradication. Measles ranks as one of the most infectious diseases and although a vaccine<br />
exists for more than 30 years, measles is still responsible for the deaths of approximately 1<br />
million children each year. Under optimum conditions the vaccine has a sero-conversion rate<br />
of over 95%, but this is lower in children under 12 months of age due to the immaturity of the<br />
immune system and the presence of maternal antibody (Gans et al., 1998). Although natural<br />
infection gives a life-long immunity, vaccination has been shown to induce lower immune<br />
responses (Markowitz et al, 1990) and there are a number of reports showing subsequent<br />
infection when confronted by circulating measles viruses (Edmonson et al., 1990 ; Gustafson<br />
et al., 1987 ; Mathias et al., 1989 ; Pedersen et al., 1989 ; Whittle et al., 1999). These may<br />
range from silent infections to clinically diagnosed measles. Despite these reservations,<br />
intensive vaccination campaigns in the South American continent eliminated the endogenous<br />
virus (de Quadros et al., 1996). However, it is probable that re-introduction from outside was<br />
the source of further epidemics in Brazil (Siqueira et al., 2001).<br />
Measles virus is considered to be a single serotype. Over the past 20 years a number of<br />
virus isolates have been obtained from geographically distinct regions (Rima et al., 1995 ;<br />
Rota et al., 1996). Nucleotide sequence analysis of the different viral genes has shown that<br />
most variation is found in the haemagglutinin (HA) and the carboxy region of the<br />
nucleoprotein (NP). Sequence analysis of these two viral genes from different viruses has<br />
provided a classification in which isolates are separated into 8 clades (A-H) each containing<br />
variants or genotypes (WHO, 1998). This molecular epidemiological approach enables the<br />
origins of the measles viruses to be traced.<br />
Only limited information is available on the stability of measles viruses within and<br />
between epidemics. Further the increase in vaccine coverage may impose an immunoselection<br />
on the circulating viruses. El Mulbarak et al. (2002) have shown very little sequence<br />
variation in the HA (0-0.5%) in measles viruses isolated in the Sudan between 1997-2000. In<br />
contrast, Hanses et al. (1999) suggested that there were two measles virus strains cocirculating<br />
in epidemics in Nigeria and Ghana in 1998.<br />
97
In 1983, measles viruses isolated in Yaoundé, Cameroon. These viruses became the<br />
reference strains for the new genotype B1. The following year (1984), measles viruses<br />
circulating in the neighbouring Gabon were classified into a subsequent genotype, B2.<br />
Viruses isolated in the 1990s in West Africa by several laboratories were sufficiently distant<br />
from the previous viruses to classify them as B3 (Hanses et al., 1999). In the present study,<br />
measles viruses circulating in the Cameroon in 2001 were compared with the strains isolated<br />
18 years previously. It was shown that the B1 genotype was replaced by B3. Further, studies<br />
of a number of B3 isolates from countries situated to the north of the Cameroon confirmed the<br />
proposed heterogeneity in the B3 genotype. The viruses in the Cameroon (2001) were closely<br />
related to the B3 isolates in the Sudan and Nigeria and differed from those found in the more<br />
westerly situated countries.<br />
MATERIALS AND METHODS<br />
Patients and virus isolation<br />
Viruses were isolated in Febuary-March 2001 from blood of patients with clinically<br />
diagnosed measles living in Yaoundé, Cameroon. Samples were taken within 6 days after the<br />
onset of the rash. Peripheral blood mononuclear cells were isolated by ficoll gradient<br />
centrifugation and co-cultivated with B95a cells (Kobune et al., 1990) in DMEM<br />
supplemented with 2% FCS. Cells were cultured for up to 10 days, but cytopathic effects<br />
could be normally observed within 7 days. The isolated viruses were stored at – 80°C.<br />
Viruses<br />
Further measles virus strains representing isolates from Nigeria (1998) were obtained<br />
from C. Muller, Luxembourg and the Sudan (1997-2000) from R. de Swart, Rotterdam. These<br />
viruses were isolated in B95a cells and were received at the 2-3 cell passage level. Sudan –<br />
MVi/Khartoum.SUD/36. 97/2 (SM42), MVi/Khartoum.SUD.28. 00/6 (SM00-6) (El Mubarak<br />
et al., 2002). Nigeria MVi/Ibadan.NIE/9.98/3, NIE/10.98/3, NIE/11.98, NIE/8.98/10 (Hanses<br />
et al., 1999). Viruses from an epidemic in the Gambia in 1993 were received as infected<br />
lymphocytes and were subsequently co-cultivated with B95a cells (G943, G945, G954). The<br />
Lys-1 measles virus strain was isolated from a patient in Lyon (1994) after vacationing in<br />
West Africa (Fayolle et al., 1999). The viruses isolated and sequenced in the present study<br />
and those obtained from other laboratories are shown with their accession numbers in Table 1.<br />
ELISA<br />
Measles virus specific serum IgM was determined using the Enzygnost anti-measles<br />
virus/IgM test (Dade Behring Marburg GmbH).<br />
RT-PCR and PCR<br />
Total RNA was extracted from infected cells using RNA Now kit (OZYME)<br />
according to supplier’s protocol. Specific cDNAs of NP and HA genes were synthesized by<br />
reverse transcription at 55°C for 30 min followed immediately by amplification by PCR in the<br />
same tube using SuperScript One-Step RT-PCR with platinum Taq (Life Technologies).<br />
The NP gene, primers MVNPCR2 (nt 975-996,<br />
5’GCTGGTGAGTTATCCACACTTG3’) and MVNPCR4 (nt 1701-1722,<br />
5’GTAGGCGGATGTTGTTCTGGTC3’) were used to amplify a 747pb fragment. The PCR<br />
cycling program consisted of denaturation for 4 min at 94°C followed by 35 cycles of 30 s at<br />
94°C, 45 s at 55°C, 45 s at 72°C with final extension for 7 min at 72°C. All products were<br />
held at 4°C. The HA gene was amplified as two fragments of 1247pb and 914 pb using<br />
98
primers gHA004 (nt7254-7278, 5’GTGCAAGATCATCCACAATGTCACC3’) with<br />
mHA1251 (nt8480-8501, 5’CGTATGAAGGAATCCTGTTATC3’), and gHA1029 (nt8258-<br />
8278, 5’CCAACCGACATGCAATCCTGG3’) with mHA1922 (nt9151-9172,<br />
5’GTATGCCTGATGTCTGGGTGAC3’) respectively. The PCR cycling program consisted<br />
of denaturation for 4 min at 94°C followed by 35 cycles of 30 s at 94°C, 45 s at 57°C, 1 min<br />
30 s at 72°C with final extension for 7 min at 72°C. All products were held at 4°C. PCR<br />
products were electrophoresed on a 1.2% agarose gel then purified using a QUIAquick Gel<br />
Extraction Kit (Quiagen) following the manufacturer’s instructions.<br />
Nucleotide Sequence Determination<br />
Purified PCR products were sequenced using a cycle sequencing reaction with ABI<br />
Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems). The<br />
reaction products were analyzed on an ABI Prism automatic sequencer (Perkin Elmer).<br />
Multiple alignment of nucleotide sequences and construction of phylogenetic trees were<br />
carried out using the clustal X program version 1.81 (Jeanmougin et al,. 1998) and confirmed<br />
with 1000 bootstrap replicates.<br />
Flow cytometry<br />
Vero-slam cells (Waku & Wild, 2002) were infected (0.1 pfu/cell) with the different<br />
measles virus isolates. At 48 h after infection, cells were incubated for 30 min on ice with<br />
anti-measles virus HA Mabs 55 (Giraudon & Wild, 1985) and BH30 (gift from C. Muller,<br />
Luxembourg), anti-measles virus F Mabs 263 and 186 (Malvoisin & Wild, 1990), then<br />
washed once with PBS, and incubated with anti-mouse immunoglobulin G-fluorescein<br />
isothiocyanate (DAKO) for 30min on ice. After two washes with PBS, the cells were analysed<br />
by FACScan (Becton Dickinson) analysis.<br />
RESULTS<br />
Measles in the Cameroon 2001<br />
During a measles epidemic occurring in Yaoundé, Cameroon, in February-March of<br />
2001, blood samples from children with clinically diagnosed measles were analysed. The<br />
samples were initially examined for measles virus specific IgM and those which were positive<br />
were subjected to virus isolation (Table 2). Of the 38 cases of measles diagnosed clinically,<br />
measles virus specific IgM was found in 35 (92%). Twenty-one of the cases were studied for<br />
virus isolation leading to 17 isolates (81%). The age distribution of the laboratory confirmed<br />
cases (Table 2) showed the majority (62%) to be in the 1-5 year-old group. Amongst the<br />
measles confirmed patients (IgM+) 57% had a vaccination history (immunised between 9-13<br />
months) and so can be considered as primary vaccine failures.<br />
To characterize the viruses, the entire HA gene and the 456 nucleotides of the –COOH<br />
terminus of the NP of four isolates were analysed by RT-PCR and sequencing the resulting<br />
products. Comparison of the nucleotide and predicted amino acid sequences showed there<br />
was little variation in the HA, three nucleotide differences among the four viruses with only<br />
one amino acid change in CR83 (Valine -> glycine, position 269). There were no nucleotide<br />
differences in the NP sequence.<br />
Phylogenetic analysis using either the HA and NP sequences, Figure 1, showed that<br />
the Yaoundé measles virus isolates were related closely to the B3 genotype (Hanses et al.,<br />
1999) and not to the B1 genotype isolated originally in Yaoundé in1983. These observations<br />
were reconfirmed by resequencing the HA gene of the original and one additional isolate<br />
(Y14, and Y22) from the 1983 epidemic using the same RT-PCR techniques. The sequences<br />
99
obtained for the two 1983 isolates were identical and the same as that of the reference<br />
sequence (data not shown).<br />
B3 genotypes<br />
Measles viruses belonging to the B3 genotype have been isolated in West Africa and<br />
in the Sudan (Truong et al., 1999 ; El Mubarak et al,. 2002). From sequencing studies it has<br />
been suggested that these viruses are heterogeneous and could be sub-divided into 2 groups<br />
B3.1 and B3.2 (Hanses et al., 1999). The latter group being found to the West and the B3.1<br />
viruses in the Sudan. Both viruses where identified in Nigeria and Ghana (Hanses et al.,<br />
1999). The nucleotide sequence analysis of the 2001 Cameroon strains shows that they are<br />
closely related to the B3.1 subgroup.<br />
To substantiate further the geographical distribution of the B3 genotypes, an isolate<br />
obtained in Lyon in 1994 (Lys-1) from a patient who had contracted measles in the Gambia<br />
and also isolates in an epidemic occurring in the Gambia in 1993 were sequenced. The Lys-1<br />
isolate only varied from the 1993 viruses by 8 nucleotides in the HA and NP confirming both<br />
the origin of the Lyon virus and its genetic stability. Further, amongst three isolates examined<br />
from the 1993 epidemic, there were a maximum of 2 nucleotides changes in the HA sequence<br />
between isolates and in each case these were silent. Comparative analyses of the Gambian<br />
viruses showed they were in the B3.2 subgroup.<br />
It was observed previously that the measles virus strain Lys-1 had a mutation in the<br />
dominant antigenic site of the F protein, arginine -> lysine at position 70 (Fayolle et al.,<br />
1999). This was identified by the non-reactivity with an anti-F monoclonal antibody, F186<br />
which reacts with the F protein of the vaccine strain and many other wild-type strains. Using<br />
FACScan analysis we examined the B3 strains from a number of sources for their ability to<br />
react with F186 (Figure 2, Table 3). These results show that all the B3.1 strains reacted with<br />
F186, whereas B3.2 viruses were negative by FACScan analysis with this monoclonal<br />
antibody. Sequence analysis of the F gene of 3 measles virus isolates (B3.2) from the Gambia<br />
(1993) confirmed the same mutation at position 70 that we had previously reported ( data not<br />
shown).<br />
Studies by the Muller laboratory (Hanses et al., 1999, Truong et al., 1999) showed that<br />
both B3.1 and B3.2 viruses were circulating in Nigeria and Ghana in 1997 and 1998. An anti-<br />
HA monoclonal antibody (BH30) was able to distinguish between these B3 groups on the<br />
basis of virus neutralisation, only B3.1 being neutralised. This monoclonal antibody was used<br />
to examine its activity with the different B3 isolates using FACSCan analysis (Table 3, Figure<br />
2). In comparison with an anti-HA monoclonal antibody, Cl. 55 which recognises all measles<br />
viruses studied (Giraudon & Wild, 1985), BH30 attached to the H antigen with an affinity<br />
approximately ten-fold less to B3.2 viruses, but with equal affinity to B3.1 and vaccine strain<br />
viruses. Alignment of the amino acid sequences of the B3.1 and B3.2 HA proteins showed<br />
that the two groups could be differentiated by the amino acids at positions 240, 283, 303 and<br />
471 (Table 4). It is probable as previously suggested by Truong et al. (1999) that amino acid<br />
471 plays a role in the recognition by monoclonal BH30 as the other three amino acids of<br />
B3.2 strains are the same as the vaccine strain.<br />
100
DISCUSSION<br />
The major features that make measles a target for eradication is that there is a single<br />
serotype and the only natural host is man. Sequence analysis of the measles virus genes has<br />
enabled the differentiation of measles virus isolates from geographically different origins into<br />
8 clades and 21 genotypes (WHO, 2001). Although these viruses may have initially been<br />
more restricted geographically, the advent of modern travel has led to a more global<br />
distribution of the different genotypes. This is more evident in countries where there has been<br />
intensive vaccination programs and the only subsequent measles cases were due to the<br />
importation of the virus. This was the case in the South American continent (de Quadros et<br />
al., 1996) and is still the situation in the USA (Bellini & Rota, 1998).<br />
The African continent is one of the greatest challenges to the eradication campaign. As<br />
it represents one of the largest reservoirs of endemic measles, it is important to establish the<br />
epidemiology of both the transmission within and between epidemics and the virus strains<br />
involved. The B clade viruses are found in regions of Central Africa and in countries from<br />
West Africa to the Sudan. The clades A and D are found on the East coast stretching down to<br />
South Africa (Kreiss et al., 1997 ; Nigatu et al., 2001). Apart from two exported isolated<br />
infections, the B clade viruses have not been reported elsewhere. The first B clade viruses<br />
(B1) were isolated in 1983 in the Cameroon and measles viruses isolated the following year<br />
in the Gabon were sufficiently different to be designated as a B2 genotype. Subsequent<br />
measles virus isolates in countries to the north (Gambia, Ghana, Nigeria : Hanses et al.,<br />
1999 ; Truong et al., 1999 & the present paper) showed the viruses to be more heterogeneous<br />
and has led to the suggested grouping as B3.1 and B3.2.<br />
The vaccines used today whether they are based on the Edmonston strain which was<br />
isolated in 1954 or other isolates are clade A viruses. Although it has been reported that there<br />
are differences in the in vitro efficiency of virus neutralisation by serum from natural<br />
infection and immunised individuals (Klingele et al., 2000 ), it is generally agreed that sera<br />
from vaccinated children have lower levels of neutralising antibody than after natural<br />
infection (Christenson et al., 1994). The efficiency of protection after vaccination varies with<br />
a number of factors including age and time after immunisation (Christenson et al. 1994).<br />
However, there are now a number of well documented studies showing that measles can<br />
propagate in vaccinated populations giving rise to a range of conditions from silent infections<br />
to clinical measles (Edmonson et al., 1990 ; Gustafson et al., 1987 ; Mathias et al,. 1989 ;<br />
Pedersen et al., 1989 ; Whittle et al., 1999). Studies have established that although seroconversion<br />
after vaccination can be > 95%, protection can decline to 66% over 10 years<br />
(Samb et al., 1993 ; Cisse et al.,1999). This would have serious consequences in an<br />
eradication campaign as not only are the children not protected long term, but it could<br />
eventually lead to the immuno-selection of viruses which were less efficiently dealt with by<br />
the present vaccine. Thus, in the present study one of our initial aims was to examine the<br />
change in the endemic viruses over an 18 year period against known vaccination coverage.<br />
However, the viruses we isolated in the Cameroon in 2001 belonged to the B3 genotype and<br />
so had not been derived from the virus isolated 18 years previously, but presumably were<br />
imported from neighbouring countries. Within the epidemic the viruses were extremely<br />
stable diplaying a maximum of 3 nucleotides different in the HA and none in the NP. No<br />
viruses related to the original B1 viruses were isolated.<br />
Amongst possible explanations of our observations are that the B1 viruses isolated in<br />
1983 were not representative of the majority of the measles viruses present in the Cameroon<br />
at this time. Alternatively, after importation, the present B3 strain may have had a selective<br />
advantage. This may be due to its arrival following vaccination campaigns in which the level<br />
of circulating B1 was reduced or this virus strain may have a selective advantage for other<br />
101
easons. The available data for measles vaccination in the Cameroon show that in 1993 only<br />
32% of the children were vaccinated and by 2000 this only rose to 49%.<br />
More detailed phylogenetic analysis of the 2001 Cameroon viruses showed they were<br />
closely related to the B3 viruses isolated in the Sudan between 1997-2000 (El Mubarak et al.,<br />
2002) and certain isolates from Nigeria and Ghana in 1998 (Hanses et al., 1999). It has been<br />
previously proposed to separate the B3 viruses into the subgroups B3.1 and B3.2. As the<br />
present analysis was extended to the study of B3 viruses from the Gambia in 1993 and 1994,<br />
it was established that the B3.2 viruses are found in the more westerly countries and the B3.1<br />
viruses in the Sudan. Both viruses were circulating in Ghana and Nigeria. The Cameroon<br />
2001 viruses belonged to the B3.1 group. It was shown previously that the strain Lys-1 was<br />
mutated in the dominant antigenic site on the F protein (Fayolle et al.,1999). In the present<br />
study, we observed that this mutation was common to all B3.2 strains and that the B3.1<br />
viruses did not have this mutation confirming the subgrouping of these viruses. Thus,<br />
sequence analysis of the HA and NP genes, plus antigenic analysis of the F protein confirm<br />
that the Cameroon 2001 viruses are closely related to the B3.1 viruses circulating in the<br />
Sudan (1997-2000) and Nigeria (1998).<br />
The present studies have shown that the B3.2 viruses could be distinguished from the<br />
B3.1 and vaccine strains at the antigenic level. A monoclonal antibody against F (F 186)<br />
reacted with the vaccine and B3.1 strains but not with B3.2. Further, an anti-HA monoclonal<br />
had a greatly reduced affinity for B3.2 strains. The majority of these latter strains were<br />
originally isolated in 1993 in the Gambia where high levels of vaccination had been<br />
maintained (84%) over a 10 year period (Whittle et al.,1999). In contrast, the other countries<br />
had much lower levels of vaccination. However, it may be fortuitous that these antigenic<br />
markers are associated with these strains. It may therefore be important to monitor such<br />
changes in these countries with the proposed increase in vaccination levels.<br />
In the future the measles vaccine coverage in the African countries will be increased<br />
in an effort to control the disease. The identification of the circulating virus strains during<br />
this period will help to monitor the vaccine strategy in order to be most effective.<br />
ACKNOWLEDGEMENTS<br />
The studies were supported by a grant from the Région Rhône-Alpes. Diane Waku<br />
Kouomou received scholarships from the French Foreign Ministry and Fondation pour la<br />
Recherche Médicale. We would like to thank F. Pradel for advice in setting up the PCRsequencing,<br />
L. Duret for an introduction to phylogenetic methods, C. Muller (Luxembourg)<br />
for viruses, R. de Swart (Rotterdam) for viruses and access to sequence data prior to<br />
publication and B. Maret for editorial assistance.<br />
102
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104
A<br />
)<br />
Hunan.CHN/93/7<br />
Beijing.CHN/94/1<br />
Yaounde.CAE/9.01<br />
0.01<br />
Genotype<br />
H1<br />
H2<br />
86<br />
Yaounde.CAE/8.01<br />
Yaounde.CAE/6.01<br />
Yaounde.CAE/5.01<br />
96<br />
81<br />
Ibadan.NIE/11.98<br />
Ibadan.NIE/97/1<br />
Ibadan.NIE/10.98/3<br />
B3.<br />
1<br />
Khartoum.SUD/28.00/6<br />
Khartoum.36.97/1<br />
97<br />
Ibadan.NIE/9.98/3<br />
Ibadan.NIE/8.98/10<br />
96<br />
94<br />
New York.USA/94<br />
Gambia/93 (G954)<br />
B3.<br />
2<br />
Lyon.FRA/94 (Lys-1)<br />
Yaounde.CAE/83/14<br />
B1<br />
Libreville.GAB/84/96<br />
MVs/Madrid.SPA/94-SSPE<br />
Edmonston-wt.USA/54<br />
B2<br />
F<br />
A<br />
90<br />
Madrid.SPA/79<br />
“JM”USA/77<br />
Braxator.<strong>DE</strong>U/71<br />
Johannesburg.SOA/88/1<br />
C1<br />
C2<br />
E<br />
D2<br />
80<br />
Victoria.AUS/16.85<br />
Manchester.UNK/30.94<br />
Palau.B<strong>LA</strong>/93<br />
Montreal.CAN/89<br />
Chicago.USA/89/1<br />
New-Jersey.USA/94/1<br />
Bristol.UNK/74<br />
Berkeley.USA/83<br />
D7<br />
D8<br />
D5<br />
D4<br />
D3<br />
D6<br />
D1<br />
G1<br />
98<br />
MVs.Victoria.AUS/24.99<br />
Amsterdam.NET/49.97<br />
g3<br />
G2<br />
Fig 1 : Phylogenetic analysis of African measles isolates based on NP gene (A) and HA gene (B).<br />
Significant bootstrap values (>80%) are indicated.<br />
105
106<br />
0.005<br />
100<br />
82<br />
100<br />
86<br />
98<br />
New York.USA/94<br />
91<br />
98<br />
98<br />
100<br />
98<br />
98<br />
100<br />
93<br />
100<br />
100<br />
100<br />
97<br />
88<br />
Khartoum.SUD/28.00/6<br />
Berkeley.USA/83<br />
Hunan.CHN/93/7<br />
Beijing.CHN/94/1<br />
Bristol.UNK/74<br />
Johannesburg.SOA/88/1<br />
New-Jersey.USA/94/1<br />
Chicago.USA/89/1<br />
Palau.B<strong>LA</strong>/93<br />
Montreal.CAN/89<br />
Victoria.AUS/16.85<br />
Manchester.UNK/30.94<br />
Braxator.<strong>DE</strong>U/71<br />
“JM”USA/77<br />
Gambia/93 (G954)<br />
Lyon.FRA/94 (LYS-1)<br />
Ibadan.NIE/9.98/3<br />
IbadanNIE/8.98/10<br />
Yaounde.CAE/5.01<br />
Yaounde.CAE/9.01<br />
Yaounde.CAE/8.01<br />
Yaounde.CAE/6.01<br />
Ibadan.NIE/10.98/3<br />
Ibadan.NIE/11.98<br />
Khartoum.SUD/36.97/1<br />
Yaounde.CEA/83/14<br />
Libreville.GAB/84/96<br />
Madrid.SPA/79<br />
Edmonston-wt.USA/54<br />
MVs/Madrid.SPA/94-SSPE<br />
MVs.Victoria.AUS/24.99<br />
Amsterdam.NET/49.97<br />
Ibadan.NIE/97/1<br />
B3.1<br />
B3.2<br />
B)<br />
Genotype
F<br />
HA<br />
Halle<br />
Clade B3.1<br />
Clade B3.2<br />
Fig 2 : Flow cytometry analysis of African measles virus infected Vero-S<strong>LA</strong>M cells.<br />
The cells were stained with anti-F(mabs 263 and186) or anti-HA(mabs 55 and BH30).<br />
The solid line is infected cells (mabs HA 55 and F263). Gray filled histograms are mabs<br />
HA BH30 and F 186. Dotted line is non-infected control cells.<br />
107
Table 1 : African measles strains used in this study.<br />
Laboratory<br />
name<br />
Description<br />
Accession number<br />
HA gene NP gene<br />
Y14 MVi/yaounde.CAE/83 AF079552 mvu01998<br />
Lys-1 MVi/Lyon.FRA/94 AF484953* AF484944<br />
G943 MVi/Gambia/93 AF484954 Not done<br />
G945 MVi/Gambia/93 AF484955 Not done<br />
G954 MVi/Gambia/93 AY059391 AF484943<br />
SM42 MVi/Khartoum.SUD/36.97/2 K36972 AF311791<br />
Nie 8 MVi/Ibadan.NIE/8.98/10 AJ239140 AJ232191<br />
Nie 9 MVi/Ibadan.NIE/9.98/3 AJ239151 AJ232774<br />
Nie 10 MVi/Ibadan.NIE/10.98/3 AJ239164 AJ232215<br />
Nie 11 MVi/Ibadan.NIE/11.98 AJ239168 AJ232781<br />
SM00-6 MVi/Khartoum.SUD/28.00/06 K28006 AF311819<br />
CR67 MVi/yaounde.CAE/5.01 AF484949 AF484945<br />
CR72 MVi/yaounde.CAE/6.01 AF484950 AF484946<br />
CR82 MVi/yaounde.CAE/8.01 AF484951 AF484947<br />
CR83 MVi/yaounde.CAE/9.01 AF484952 AF484948<br />
* Sequences in bold were obtained in this work<br />
TABLE 2 : Age distribution of clinicaly diagnosed and<br />
laboratory confirmed measles cases<br />
Age group<br />
(years)<br />
Clinicaly diagnosed<br />
cases (%)<br />
ELISA confirmed<br />
(IgM) cases(%)<br />
0 - 1 8 (21) 6 (17,1)<br />
1 - 5 22 (57,8) 22 (62,8)<br />
5 - 10 5 (13,1) 4 (11,4)<br />
10 - 15 2 (5,2) 2 (5,7)<br />
15+ 1 (2,6) 1 (2,8)<br />
Total 38 35<br />
108
Table 3 : FACScan analysis of measles virus strains using monoclonal antibodies to the HA and<br />
F glycoproteins<br />
Origin<br />
Laboratory<br />
name<br />
F263 F186 HA 55 HA BH30 Genotype<br />
Cameroon CR67 ++++* +++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Cameroon CR72 ++++ ++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Cameroon CR82 ++++ ++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Cameroon CR83 ++++ ++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Nigeria Nie 10 ++++ ++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Nigeria Nie 11 ++++ ++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Sudan SM00-6 ++++ ++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Sudan SM42 ++++ ++++ ++++ ++++ B3.1<br />
Nigeria Nie 8 ++++ - ++++ ++ B3.2<br />
Nigeria Nie 9 ++++ - ++++ ++ B3.2<br />
France Lys-1 ++++ - ++++ ++ B3.2<br />
Gambia G943 ++++ - ++++ ++ B3.2<br />
Gambia G945 ++++ - ++++ ++ B3.2<br />
Gambia G954 ++++ - ++++ ++ B3.2<br />
Vaccine strain Halle ++++ ++++ ++++ ++++ A<br />
* Intensity of recognition, see figure 2.<br />
Table 4 : Comparison of amino acids within clade B isolates. Specific mutations in HA and NP genes for clades B3.1 and B3.2<br />
Edmonston<br />
Amino acid Clade B1<br />
Clade B3.1<br />
Clade B3.2<br />
Vaccine<br />
Position<br />
strain<br />
Y14 NIE 10 CR67 CR72 CR82 CR83 SM00-6 SM42 NIE 8 LYS-1 G954<br />
HA gene<br />
240 S S N N N N N N N S S S<br />
283 D D G G G G G G G D D D<br />
303 E E D D D D D D D E E E<br />
471 E E E E E E E E E A A A<br />
N gene<br />
443 S S S S S S S S S G G G<br />
451 Y Y H H H H H H H Y Y Y<br />
509 G G D D D D D D D G G G<br />
109
VI.3. <strong>LA</strong> <strong>ROUGEOLE</strong> AU CAMEROUN : ETU<strong>DE</strong> <strong>DE</strong> 38 CAS<br />
CLINIQUES. DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE, ISOLEMENTS VIRAUX<br />
ET CARACTERISATION GENETIQUE<br />
110
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
VI.3.1 Introduction<br />
La rougeole est une maladie endémique au Cameroun. Elle sévit pendant toute<br />
l’année, mais on observe un pic épidémiologique pendant la saison sèche (mois de mars,<br />
avril). En 2001, 23934 cas de rougeole, dont 352 décès, ont été déclarés au Cameroun. La<br />
rougeole est donc un problème de santé publique dans ce pays.<br />
L’OMS a lancé une campagne de surveillance des cas de rougeole et d’éradication<br />
future de cette maladie au Cameroun. Etant donné qu’il est difficile de distinguer la rougeole<br />
des autres maladies virales à exanthème (Cutts & Brown, 1995), il est conseillé de confirmer<br />
les cas de rougeole par un test d’anticorps IgM spécifiques de la rougeole sur un prélèvement<br />
sanguin effectué dans les 4 semaines qui suivent l’éruption. Pour ce faire, un réseau de<br />
laboratoires a été mis en place dans plusieurs pays. Le Centre Pasteur de Yaoundé est le<br />
Laboratoire de Référence National au Cameroun pour ce projet et dans ce contexte, le<br />
diagnostic sérologique a été mis en place au laboratoire de virologie du Centre Pasteur de<br />
Yaoundé en juin 2000.<br />
Ce travail réalisé au Centre Pasteur de Yaoundé en février et mars 2001 a contribué à<br />
mettre en place la technique d’isolement du virus de la rougeole au Cameroun, en<br />
collaboration avec l’unité INSERM 404, Immunité et vaccination, un des Laboratoire de<br />
Référence Mondiaux de OMS pour la rougeole en France.<br />
VI.3.2. Objectif<br />
L’objectif général de notre étude est d’aborder la problématique de la diversité<br />
génétique du virus de la rougeole au Cameroun.<br />
Les objectifs spécifiques viseront d’une part à mettre en place les techniques<br />
d’isolements viraux en complément du sérodiagnostic déjà en place au laboratoire de<br />
virologie au Centre Pasteur de Yaoundé. D’autre part, l’amplification des gènes des virus<br />
isolés et leur analyse nucléotidique nous apporteront des premiers éléments d’information<br />
quant à la circulation de différents génotypes à Yaoundé, et la présence éventuelle de<br />
certaines mutations décrites dans la littérature. Nous étudierons par la suite la variabilité du<br />
virus de la rougeole à l’intérieur d’une épidémie et entre différentes épidémies.<br />
Enfin, ces donnés compléteront celles que nous avons obtenues avec les souches<br />
rougeoleuses camerounaises isolées en 1983.<br />
111
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
VI.3.3. Stratégie expérimentale<br />
Notre stratégie consiste à confirmer par sérologie IgM les cas cliniques suspects de<br />
rougeole. A partir de prélèvements sanguins, les cellules mononucléées du sang périphérique<br />
(PBMC) seront isolées sur gradient de ficoll. Pour isoler le virus, les PBMC activées avec la<br />
PHA seront mises en coculture avec des cellules B95a (Kobune et al., 1990). Les gènes<br />
codant pour l’hémagglutinine et la nucléoprotéine seront amplifiés par RT-PCR, puis<br />
séquencés. Une étude phylogénétique sera réalisée par la suite.<br />
112
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
Figure 10 : Stratégie Expérimentale<br />
Malade<br />
Diagnostic<br />
Clinique<br />
Positif<br />
Négatif<br />
Diagnostic sérologique (Rougeole/Rubéole)<br />
ELISA IgM<br />
Positif<br />
Négatif<br />
Ficoll<br />
PBMC<br />
2 eme Prélèvement<br />
B95a<br />
6 jours<br />
Analyses<br />
Phylogénétiques<br />
Positif<br />
Négatif<br />
Séquençage<br />
Réinfection<br />
des B95a<br />
Extraction d’ARN<br />
après 48h<br />
RT-PCR<br />
Gènes<br />
amplifiés<br />
Syncytia<br />
113
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
VI.3.4. Matériels et méthodes<br />
VI.3.4.a. Patients<br />
Le matériel clinique est prélevé sur des enfants présentant des signes cliniques de la<br />
rougeole (fièvre, toux, conjonctivite, coryza, éruption cutanée). La collecte des échantillons<br />
fait partie de la surveillance des cas de rougeole à Yaoundé, lancé par le PEV (Programme<br />
élargi de vaccination) et l’OMS. Les échantillons collectés pendant les mois de février et mars<br />
2001 sont présentés dans cette étude.<br />
VI.3.4.b. Echantillons<br />
Les prélèvements sanguins sont effectués sur des tubes citratés (environ 2-3ml). Les<br />
cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont isolées sur gradient de ficoll, puis<br />
stimulées avec de la phytohémagglutinine dans du RPMI contenant 10% de sérum de veau<br />
fœtal (SVF) pendant 24h dans une étuve à 37°C contenant 5% de CO 2 .<br />
VI.3.4.c. Sérologie<br />
Les signes cliniques de la rougeole et de la rubéole étant très semblables, le test<br />
sérologique est effectué pour la rougeole en parallèle avec celui de la rubéole. Le prélèvement<br />
sanguin est décanté par centrifugation à 2500 rpm pendant 10mn à 20°C. Le taux d’IgM dans<br />
le plasma est mesuré par ELISA. Le plasma est dilué au 1/21 e dans le tampon de dilution du<br />
Kit Ezygnost Anti-Masern virus/IgM (DA<strong>DE</strong> BEHRING). A 200l d’échantillon dilué, on<br />
rajoute un volume égal de RF-absorbant (anticorps de mouton dirigés contre le fragment Fc<br />
de l’IgG humaine). Ce mélange est incubé 15mn à température ambiante, puis 150l sont<br />
rajoutés dans les puits des plaques ELISA contenant ou non l’antigène de la rougeole. Après<br />
1h d’incubation à 37°C, les plaques sont lavées trois fois avec la solution de lavage<br />
diluée, puis incubées avec le conjugué anti-IgM humaine. Après une autre heure d’incubation,<br />
les plaques sont encore lavées et colorées en utilisant du Téraméthylbenzidine dichlorure<br />
comme substrat. La réaction est arrêtée après 30mn d’incubation avec la solution d’arrêt<br />
(acide sulfurique 0,5N). La densité optique est lue à 450nm.<br />
114
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
VI.3.4.d. Isolement du virus<br />
Le virus de la rougeole est isolé à partir de PBMC (2x10 6 cellules) stimulées avec<br />
1g/ml de PHA mises en co-culture avec des B95a (5x10 6 cellules) dans du milieu DMEM<br />
contenant 2% de SVF. Dans les cas d’isolement positif, les effets cytophatiques (CPE) sont<br />
observés après 4 à 7 jours de culture à 37°C. Dans ce cas, les cellules et le milieu de culture<br />
sont mis à –80°C pendant 24h, puis centrifugés à 1500rpm pendant 10mn. Le surnageant<br />
enrichi en virus est aliquoté et conservé à –80°C. Les cellules B95a (10x10 6 cellules) sont<br />
réinfectées avec 1ml de ce surnageant pendant 3 heures à 37°C. L’extraction d’ARN a lieu 48<br />
heures après.<br />
VI.3.4.e. Extraction d’ARN<br />
Les cellules B95a infectées sont lysées par addition de RNA Now (OZYME) à raison<br />
de 1ml de réactif pour 5-10 x10 6 cellules. L’homogénat est aliquoté en volumes de 1ml auquel<br />
on rajoute 0,2ml de chloroforme, puis on mélange par simple inversion de tube. Après 5mn<br />
d’incubation sur la glace, l’échantillon est centrifugé à 13000 rpm pendant 10mn et la phase<br />
acqueuse supérieure contenant l’ARN est récupérée. L’ARN est prépicité par addition d’un<br />
volume égal d’isopropanol suivie d’une incubation d’une heure à –80°C. L’échantillon est<br />
centrifugé à 13000rpm pendant 15mn. Le culot d’ARN est lavé deux fois avec de l’éthanol<br />
70% et séché à température ambiante pendant 20mn. Le culot d’ARN est repris dans de l’eau<br />
distillée stérile.<br />
VI.3.4.f. RT-PCR<br />
La présence de l’ARN viral dans l’échantillon d’ARN total est détectée par RT-PCR<br />
en utilisant des amorces permettant d’amplifier les gènes qui codent pour l’hémagglutinine et<br />
la nucléoprotéine. La séquence des amorces est déterminée en se basant sur la séquence<br />
nucléotidique de la souche Edmonston. Les gènes sont amplifiés en utilisant le kit Superscript<br />
one-step RT-PCR System (Life Technologies).<br />
Pour amplifier un fragment (750 pb) du gène de la nucléoprotéine, nous avons utilisé les<br />
amorces suivantes :<br />
- MVNPCR2, 5’ GCTGGTGAGTTATCCACACTTG 3’ et<br />
- MVNPCR4, 5’ GTAGGCGGATGTTGTTCTGGTC 3’<br />
115
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
Le brin de cDNA est d’abord synthétisé à 55°C pendant 30mn, puis le programme<br />
d’amplification comporte une étape de dénaturation de 2mn à 94°C, suivie de 35 cycles de<br />
30s à 94°C, 30s à 55°C, 30s à 72°C, avec une extension finale de 7mn à 72°C.<br />
Pour obtenir le gène codant pour la protéine H, nous avons utilisé les amorces suivantes :<br />
CRMHPCR1 : 5’ CTTAGGGTGCAGGATCCTCCACAATGTCACC 3’<br />
CRMHPCR2 : 5’ TTAATTCTGATGTCGAATTCACACTAGTGGG 3’<br />
Le brin de cDNA est d’abord synthétisé à 55°C pendant 30mn, puis le programme<br />
d’amplification comporte une étape de dénaturation de 2mn à 94°C, suivie de 35 cycles de<br />
30s à 94°C, 30s à 60°C, 2mn à 72°C, avec une extension finale de 7mn à 72°C.<br />
Tous les produits PCR sont conservés à +4°C et séparés sur un gel d’agarose à 1,2%<br />
contenant du bromure d’éthidium. Les bandes d’ADN sont observées sous lampe<br />
ultraviolette.<br />
VI.3.5. Resultats<br />
VI.3.5.a. Diagnostic clinique<br />
Les cas présentés dans cette étude nous ont été rapportés par le Pavillon Mère et<br />
Enfant de la Fondation Chantal BIYA de l’Hôpital Central de Yaoundé. Les 38 patients<br />
vivant en zone urbaine, âgés de 8 mois à 15 ans ont été cliniquement diagnostiqués comme<br />
souffrant de la rougeole. Les prélèvements sanguins ont été effectués entre le 1 er et le 17 ème<br />
jour après l’éruption. Notons que pour certains cas certaines informations ne sont pas<br />
disponibles, notamment le sexe, l’âge, l’histoire de la vaccination. 20 patients parmi les 38<br />
auraient déjà reçu au moins une dose de vaccin.<br />
VI.3.5.b. Diagnostic sérologique<br />
Le dosage des IgM contenues dans le plasma par ELISA a permis de confirmer 35 cas.<br />
Les 3 autres cas étaient négatifs. Un deuxième prélèvement a été demandé pour confirmer les<br />
cas négatifs. Un seul cas de rubéole a été diagnostiqué sérologiquement.<br />
VI.3.5.c. Diagnostic virologique<br />
En plus du diagnostic sérologique, l’isolement du virus de la rougeole a été réalisé à<br />
partir de PBMC de patients. Comme le montre le tableau 7, parmi les 35 cas confirmés en<br />
sérologie, 21 ont été testés en culture. Le virus a été isolé dans 17 cas, les 4 autres étant<br />
négatifs. Les 14 autres cas n’ont pas encore été testés en culture.<br />
116
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
VI.3.5.d. RT-PCR<br />
L’isolement de virus a été confirmé par RT-PCR en utilisant des amorces spécifiques<br />
au virus de la rougeole. Le gène codant pour la nucléoprotéine a été amplifié pour les 8 cas<br />
testés. Nous avons obtenu un fragment d’ADN de taille attendue (environ 750 pb) qui<br />
correspond à la partie C-terminale du gène de la nucléoprotéine. Le gène codant pour<br />
l’hémagglutinine a été amplifié pour les 8 cas testés. Nous avons obtenu un fragment d’ADN<br />
de taille attendue (environ 2000 pb) qui contient le gène entier de l’hémagglutinine. Les 9<br />
autres virus isolés n’ont pas encore été testés par RT-PCR.<br />
117
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
Tableau 7 : Résumé des données des patients et résultats de laboratoire<br />
Numéro Sexe a Age<br />
(mois)<br />
Vaccin c Eruption d IgM R/r e<br />
(plasma)<br />
Isolement de Virus<br />
(PBMC)<br />
RT-PCR<br />
(H et N)<br />
R063 F 168 1 1j +/- + +<br />
R064 F 32 0 2j +/- + NF<br />
R065 F 12 0 5j +/- + NF<br />
R066 F 48 1 3j +/- + +<br />
R067 F 40 1 3j +/- + +<br />
R068 F 76 1 4j +/- + +<br />
R069 F 60 1 3j +/- + +<br />
R070 M 19 0 9j +/- + NF<br />
R071 M 8 0 4j +/- - NF<br />
R072 F 8 0 6j +/- + +<br />
R073 M 20 1 7j +/- - NF<br />
R074 F 22 1 1j +/- - NF<br />
R075 F 24 1 3j +/- - NF<br />
R076 M 11 1 7j +/- + NF<br />
R077 DND b 9 0 DND +/- + NF<br />
R078 DND 48 0 DND +/- + NF<br />
R079 F 14 0 4j +/- + NF<br />
R080 F 18 0 DND +/- + NF<br />
R081 F 42 0 9j +/- + NF<br />
R082 F 8 0 1j +/- + +<br />
R083 DND 60 DND DND +/+ + +<br />
R084 DND 7 0 DND -/- NF f NF<br />
R085 M 13 0 5j +/- NF NF<br />
R086 F 11 0 DND +/- - NF<br />
R087 F 36 1 8j +/- - NF<br />
R088 M 181 DND 10j +/- - NF<br />
R089 F 69 1 DND +/- NF NF<br />
R090 F 92 1 11j +/- NF NF<br />
R091 M 87 1 12j +/- NF NF<br />
R092 F 36 2 11j +/- NF NF<br />
R093 M 120 1 10j -/- NF NF<br />
R094 F 24 2 17j +/- NF NF<br />
R095 F 19 0 11j +/- NF NF<br />
R096 M 9 1 16j -/- NF NF<br />
R097 M 54 1 DND +/- NF NF<br />
R098 F 30 1 DND +/- NF NF<br />
R099 F 135 0 DND +/- NF NF<br />
R100 M 23 1 DND +/- NF NF<br />
a F, féminin ; M, masculin<br />
b DND, donnée non disponible<br />
c nombre de doses de vaccin reçues<br />
d Jours après éruption<br />
e R , Rougeole ; r, Rubéole<br />
f NF, non fait<br />
118
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
VI.3.6. Discussion<br />
Au cours de ce travail, nous avons analysé sérologiquement 38 cas cliniques de<br />
rougeole à Yaoundé au Cameroun. La mesure du taux d’IgM a montré que dans 35 cas (92%),<br />
la maladie est due à l’infection par le virus de la rougeole. Dans les trois autres cas (8%), la<br />
maladie avait une autre cause. Les échecs de diagnostic (même effectué par des médecins<br />
expérimentés) ont souvent été rapportés (Ferson et al., 1995). Il est connu que plusieurs autres<br />
agents infectieux, comme le virus de la rubéole, l’adénovirus, le parvovirus B19, l’herpes<br />
virus humain de type 6 (HHV6), entraînent des symptômes qui peuvent être confondus avec<br />
la rougeole (Nur et al., 1999), d’où l’importance des techniques de diagnostic au laboratoire<br />
dans la confirmation des cas de rougeole. Le diagnostic sérologique a permis de détecter dans<br />
cette étude un cas de coinfection par le virus de la rougeole et le virus de la rubéole.<br />
L’isolement viral est l’une des meilleures techniques de diagnostic pour les cas<br />
suspects de rougeole (surtout chez des sujets immunodéprimés pour lesquels le diagnostic<br />
clinique et sérologique sont difficiles). Cependant, cette méthode comporte certains aléas<br />
puisque sur les 21 cas positifs en ELISA IgM qui ont été mis en culture, 17 virus (78%) ont<br />
été isolés. Les 4 autres étaient négatifs. La discordance entre les tests IgM positifs et<br />
l'isolement négatif du virus pourait être le signe d'une vaccination antérieure de quelques<br />
semaines et l'éruption serait due à autre virus (adénovirus, HHV6 etc). Cette discordance<br />
pourrait aussi être due à des problèmes pratiques liés :<br />
- au volume de l’échantillon, le prélèvement sanguin est difficile à effectuer sur les enfants<br />
et les nourrissons,<br />
- au conditionnement de l’échantillon, le virus de la rougeole étant thermolabile,<br />
l’échantillon doit être transporté rapidement au laboratoire,<br />
- a la date du prélèvement ; en fait, pour optimiser l’isolement du virus, le prélèvement doit<br />
être effectué dans les 4 jours qui suivent l’éruption.<br />
Dans certains cas, le virus a été isolé à partir de prélèvements effectués 6, 7 voire<br />
même 9 jours après l’éruption. Ceci peut s’expliquer par le fait que les parents ne retiennent<br />
pas toujours la date exacte de l’éruption. On peut aussi penser à des patients immunodéprimés<br />
qui n’arrivent pas à fabriquer les anticorps et qui n’éliminent pas facilement le virus. En effet<br />
les travaux de Permar et al., (2001) montrent que l’ARN du virus de la rougeole est détectable<br />
chez les enfants infectés par le VIH , 46 jours après l’éruption.<br />
On constate aussi qu’il y a des patients qui consultent seulement 17 jours après<br />
l’éruption. Ce qui veut dire que malgré la fièvre, la toux, la conjonctivite, il y a des parents<br />
qui gardent leur enfant plus de deux semaines après l’éruption et ne le présentent au médecin<br />
119
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
que lorsque surviennent les problèmes de surinfection. Ce qui montre que la population n’est<br />
pas assez sensibilisée en matière de santé.<br />
Parmi les 35 cas confirmés par sérologie IgM, 20 cas (57,1%) sont des enfants qui<br />
auraient déjà été vaccinés. Le vaccin de la rougeole est efficace à 95% quand il est administré<br />
dans les conditions optimales, ce qui veut dire qu’avec une seule dose de vaccin, il y a une<br />
accumulation d’enfants susceptibles même si tous les enfants ont été vaccinés (Wild, 1999).<br />
L’échec de la vaccination dû à un conditionnement inadapté du vaccin (rupture de la chaîne<br />
du froid) peut être une explication à ces observations. Notons aussi qu’il y a dans notre étude<br />
des enfants infectés par le virus de la rougeole et qui auraient déjà reçu deux doses de vaccin.<br />
Le pourcentage élevé d’enfants malades qui auraient été vaccinés est dû au fait que les carnets<br />
de vaccination ne sont pas toujours présentés au médecin ; l’information ne peut pas donc être<br />
vérifiée.<br />
La RT-PCR est une technique de diagnostic qui n’est pas utilisée en routine.<br />
L’amplification des gènes codant pour l’hémagglutinine et la nucléoprotéine a permis de<br />
confirmer l’isolement du virus dans 9 cas testés. Une nomenclature unique des souches de<br />
virus de la rougeole et une définition de leurs génotypes ont été proposées (WHO, 1998).<br />
Suite à ces propositions, il a été décidé que les séquences des gènes codant pour<br />
l’hémagglutinine et la nucléoprotéine seront utilisées pour les études phylogénétiques.<br />
VI.3.7. Conclusions<br />
Ce travail a permis de mettre en place la technique d’isolement du virus de la rougeole<br />
au Centre Pasteur de Yaoundé. Nous avons isolé des souches de virus circulant à Yaoundé<br />
pendant les mois de février et mars 2001. L’isolement a été confirmé par l’amplification des<br />
gènes codant pour l’hémagglutinine et la nucléoprotéine par RT-PCR. Notre étude a montré<br />
que toutes les tranches d’âges (des nourrissons jusqu’aux adolescents) étaient touchées par<br />
cette maladie.<br />
Au Cameroun on constate que le nombre de cas de rougeole déclaré en 2001 est élevé<br />
par rapport à ceux des années antérieures, ceci grâce à la campagne de surveillance lancée par<br />
l’OMS. Cependant il y a encore du travail à faire, notamment la sensibilisation de la<br />
population à l’importance de la vaccination et une consultation rapide en cas de maladie. Il est<br />
nécessaire que la formation du personnel médical soit approfondie pour le remplissage des<br />
fiches de notifications. Il faudrait que ces fiches puissent comporter des donnés justifiées et<br />
fiables surtout en ce qui concerne l’histoire de la vaccination des patients. Ces données sont<br />
importantes pour l’étude de la propagation du virus au sein de la population vaccinée.<br />
120
VI. Etude des souches Africaines duVR<br />
3. La rougeole au Cameroun : Isolement viraux<br />
Les souches qui ont été isolées seront séquencées, une analyse phylogénétique et des<br />
études épidémiologiques seront par la suite effectuées. On pourra ainsi connaître l’origine de<br />
ces souches, l’histoire de leurs transmission, ce qui pourra aider à mieux lutter contre leurs<br />
propagation.<br />
121
CHAPITRE VII. DISCUSSION<br />
122
VII. Discussion<br />
1. Interaction virus-cellule<br />
VII.1. INTERACTION <strong>VIRUS</strong>-CELLULES<br />
Alors que le vaccin contre la rougeole est disponible de manière généralisée depuis<br />
plus de 30 ans, la rougeole reste une cause majeure de mortalité de l’enfant. On estime que le<br />
nombre de cas de rougeole en 2000 se situait entre 30 et 40 millions et que le nombre de<br />
décès atteignait 777 000 (WHO, 2002a). Le virus de la rougeole a été isolé pour la première<br />
fois en 1953 et a subi plusieurs passages dans les cellules primaires de reins de singe et dans<br />
les fibroblastes d’embryon de poulet jusqu'à l’obtention d’un phénotype atténué. Plusieurs<br />
mutations ont été introduites dans le génome viral pendant cette adaptation (Parks et al.,<br />
2001).<br />
Les souches vaccinales ont la propriété de se répliquer facilement dans les cellules<br />
épithéliales humaines et simiennes et dans les lignées cellulaires fibroblastiques. Ce ci est dû<br />
en partie à leur capacité à utiliser la molécule CD46 comme récepteur cellulaire (Naniche et<br />
al., 1993a). Il a été montré que l’utilisation CD46 est liée à la mutation d’une Asp en Tyr en<br />
position 481 dans la protéine H (Hsu et al., 1998).<br />
Nos travaux ont montré qu’après une période d’adaptation aux cellules Véro, la<br />
souche G 954Vp10 n’utilise pas le récepteur CD46, mais elle se réplique et atteint un titre<br />
élevé sans induire de fusion. La séquence en acide aminé des deux glycoprotéines de surface<br />
est identique à celle du virus non adapté, cultivé dans les PBL. Ceci suggère que la capacité<br />
de ce virus à se répliquer dans les cellules Véro ne dépend pas de l’interaction entre la<br />
protéine H et le récepteur CD46. Dans la plupart des études portant sur l’adaptation des<br />
souches de virus de la rougeole aux cellules Véro, les mutations N481Y et S 546G dans la<br />
protéine H ont été observées (Buckland & Wild, 1997 ; Rima et al., 1997 ; Hsu et al., 1998).<br />
Cependant, l’étude de Nielsen et al., (2001) publiée pendant la réalisation de nos travaux<br />
rapporte comme nous des cas d’adaptation de virus de la rougeole aux cellules Véro sans<br />
introduction de mutations dans la protéine H par rapport à la souche sauvage. De plus, ils<br />
montrent que bien que certaines souches après adaptation aux cellules Véro n’aient pas acquis<br />
la capacité à utiliser CD46 comme récepteur, elle se répliquent dans les cellules Véro avec<br />
une efficacité équivalente à celles des souches ayant acquis cette capacité. Ce qui suggère que<br />
l’adaptation des souches de virus de la rougeole aux cellules Véro ne requiert ni des<br />
changements dans la protéine H, ni l’utilisation de CD46 comme récepteur cellulaire.<br />
L’implication de la protéine H dans le tropisme cellulaire du virus de la rougeole est<br />
très controversée. Lecouturier et al., (1996) ont montré que la protéine H joue un rôle crucial<br />
dans la fusion des cellules HeLa et dans le tropisme du virus de la rougeole. En effet, ils ont<br />
123
VII. Discussion<br />
1. Interaction virus-cellule<br />
montré que la protéine H de la souche vaccinale Hallé qui induit la fusion dans les cellules<br />
HeLa, induit la fusion quand elle est co-exprimée avec la protéine F à partir de cDNA. Par<br />
contre la protéine H de la souche sauvage Ma93F, qui ne donne pas de fusion dans les cellules<br />
HeLa , n’induit pas de fusion quand elle est co-exprimée avec la protéine F à partir de cDNA.<br />
Cette différence de comportement a été attribuée aux acides aminés 451 et 481 de la protéine<br />
H. Par contre, des études plus récentes suggèrent que la protéine H du virus de la rougeole<br />
n’est pas impliquée dans la détermination de la fusion cellulaire, ni dans la détermination de<br />
la spécificité de l’hôte (Takeuchi et al., 2002). Ces auteurs ont montré que la co-expression de<br />
la protéine H d’une souche vaccinale de virus de la rougeole Edmonston (Ed) avec la protéine<br />
F induit la fusion dans les cellules Véro. Par contre, la co-expression de la protéine H d’une<br />
souche sauvage de virus de la rougeole (IC-B) avec la protéine F ne donne pas de fusion dans<br />
ces cellules. Afin de déterminer le rôle de la protéine H dans l’infection virale, un<br />
recombinant IC-B contenant le cDNA de la protéine H de la souche Ed (IC/Ed-H) et un autre<br />
recombinant Ed contenant le cDNA de la protéine H de la souche IC-B (Ed/IC-H) ont été<br />
générés. Dans les deux cas, on observe la formation de syncytia dans les cellules Véro ce qui<br />
suggère que d’autres protéines du virus de la rougeole que la protéine H déterminent le<br />
tropisme cellulaire. De plus, dans cette étude, l’utilisation d’un anticorps monoclonal dirigé<br />
contre CD46 ne bloque pas la réplication, ni la formation de syncytia par le recombinant<br />
Ed/IC-H. La question relative au mode d’entrée du recombinant Ed/IC-H dans les cellules<br />
Véro soulignée dans cette étude est similaire à celle que nous avons posée. Sachant que la<br />
molécule S<strong>LA</strong>M n’est pas exprimée sur les cellules Véro, par quel mécanisme le recombinant<br />
Ed/IC-H infecte t-il ces cellules ? Cette question vient conforter notre idée, à savoir la<br />
présence éventuelle d’un troisième récepteur, non encore identifié, sur les cellules Véro, pour<br />
certaines souches de virus de la rougeole.<br />
L’idée de l’existence d’un troisième récepteur pour le virus de la rougeole est de plus<br />
en plus présente et plusieurs autres études en font allusion. En effet, Hashimoto et al., (2002)<br />
ont généré un virus recombinant MV(IC 323-EGFP) qui exprime une protéine fluorescente à<br />
partir de la souche sauvage de la rougeole IC-B. Leur étude montre que ce virus recombinant<br />
infecte non seulement les cellules exprimant la molécule S<strong>LA</strong>M (B95a, Véro/S<strong>LA</strong>M), mais<br />
aussi les cellules S<strong>LA</strong>M-négatives (Véro/Néo, Jurkat). Bien que l’infection des cellules<br />
S<strong>LA</strong>M-négatives par ce virus recombinant puisse être bloqué par les anticoprs dirigés contre<br />
l’hémagglutinine et la protéine de fusion, les anticorps dirigés contre la molécule CD46 quant<br />
à eux, ne bloquent pas l’infection. Ces résultats indiquent que ce virus recombinant utilise un<br />
récepteur autre que CD46 et S<strong>LA</strong>M. Dans le même ordre d’idée, les études de Manchester et<br />
124
VII. Discussion<br />
1. Interaction virus-cellule<br />
al., (2002) montrent que des cellules humaines CD34 + obtenues à partir de sang de cordon<br />
ombilical sont bien infectées in vitro par la souche sauvage MV-JW du virus de la rougeole.<br />
Les auteurs ont montré que plus de 98% des cellules CD34 + expriment CD46 et moins de 2%<br />
expriment S<strong>LA</strong>M. Un suivi de l’expression des récepteurs à la surface cellulaire pendant 5<br />
jours après l’infection montre que l’expression de CD46 reste constante et que S<strong>LA</strong>M est très<br />
peu ou pas exprimée. L’utilisation des anticorps dirigés contre ces deux récepteurs (anti CD46<br />
(MCI20.6) et anti SlAM IPO-3) ne bloquent pas l’infection des cellules CD34 + . Ceci suggère<br />
également l’existance d’un troisième récepteur non identifié, utilisé par le virus de la rougeole<br />
pour infecter les cellules CD34 + .<br />
Une autre explication possible au fait que certaines cellules S<strong>LA</strong>M-négatives soient<br />
infectées par le virus de la rougeole est qu’un récepteur serait induit au cours de l’infection<br />
des cellules Véro comme c’est les cas dans les monocytes. En effet, les travaux de Minagawa<br />
et al., (2001) ont montré que les monocytes, qui normalement n’expriment pas S<strong>LA</strong>M,<br />
deviennent positifs pour S<strong>LA</strong>M après incubation avec une souche sauvage de virus de la<br />
rougeole. De plus, ils ont montré que l’infection de ces monocytes se fait via S<strong>LA</strong>M car<br />
l’utilisation d’un anticorps dirigé contre S<strong>LA</strong>M (IPO3) bloque efficacement l’infection des<br />
monocytes par une souche sauvage. Par contre, l’infection avec la souche vaccinale<br />
Edmonston n’est pas bloqué, ce qui indique que l’inhibition de l’infection des monocytes par<br />
la souche sauvage est due à au blocage de l’interaction entre le virus et le récepteur S<strong>LA</strong>M.<br />
La présence de S<strong>LA</strong>M jusqu’ici détecté sur les lymphocytes T et B activés et sur les cellules<br />
dendritiques activées s’est ainsi élargie aux monocytes.<br />
Bien que la molécule S<strong>LA</strong>M soit connue comme récepteur pour les souches sauvages<br />
de virus de la rougeole, son rôle dans la biologie de l’infection est encore mal connu. Nos<br />
travaux ont montré que le virus G954 Vp10 interagit avec la molécule S<strong>LA</strong>M simienne, mais<br />
n’induit pas de fusion dans les cellules B95a. De même, ce virus infecte les cellules Véro sans<br />
induire de fusion. Par contre, lorsqu’on infecte des cellules Véro exprimant la molécule<br />
S<strong>LA</strong>M humaine, cette souche induit la fusion. Ce qui indique que la présence de S<strong>LA</strong>M dans<br />
les cellules Véro favorise le processus de fusion et donc la propagation rapide de l’infection à<br />
d’autre cellules. Il est possible que la présence de S<strong>LA</strong>M joue sur l’interaction entre les<br />
glycoprotéines H et F d’une façon analogue aux épitopes Tag ajoutés sur la protéine H dans<br />
l’étude de Plemper et al., (2002). En effet, ces auteurs ont montré qu’un virus modifié par<br />
l’ajout d’un épitope Tag constitué de 8 acides aminés au niveau de la queue cytoplasmique de<br />
la protéine H possède une infectivité par particule plus élevé et induit des syncytia plus large<br />
125
VII. Discussion<br />
1. Interaction virus-cellule<br />
que le virus non modifié. Ce changement dans la cytopathogénicité du virus a été attribué à la<br />
modification de la stabilité du complexe H/F suite à l’ajout des épitopes Tag.<br />
Des études supplémentaires sur la fonction et la distribution de la molécule S<strong>LA</strong>M<br />
dans les cellules cibles du virus de la rougeole, comme les cellules épithéliales et<br />
endothéliales, les cellules du système nerveux central, devraient aider à approfondir nos<br />
connaissances sur la pathogenèse de la rougeole.<br />
126
VII. Discussion<br />
2. Epidémiologie<br />
VII.2. EPI<strong>DE</strong>MIOLOGIE<br />
Depuis l’introduction de la vaccination contre la rougeole, la mortalité et la morbidité<br />
ont été réduites de façon drastique. Dans certaines régions du monde (par exemple les Etats-<br />
Unis) les souches endogènes ont été éradiquées et ceci constitue une étape importante vers<br />
l’éradication globale de la rougeole dans le monde. Cependant, pour interrompre la<br />
transmission du virus, plus de 95% de la population devrait être protégée. Il s’est avéré<br />
impossible d’atteindre des niveaux élevés de protection avec la vaccination de routine. De ce<br />
fait, dans plusieurs régions, la vaccination de routine à l’âge de 9 mois a été supplémentée par<br />
une seconde dose à un âge tardif. D’autres pays ont opté pour des campagnes de vaccination<br />
de masse, au cours desquelles tous les enfants sont vaccinés sans tenir compte de l’histoire de<br />
leur vaccination.<br />
Notre étude réalisée sur des souches de virus de la rougeole isolées en Afrique de<br />
l’Ouest et en Afrique Centrale se situe juste avant la mise en œuvre de ces grandes campagnes<br />
de vaccination dans les pays africains. Bien que la diversité génétique entre les isolats obtenus<br />
de différentes régions géographiques soit établie, il existe par contre très peu d’informations<br />
quant à la variété du virus de la rougeole au cours de la même épidémie.<br />
Notre étude a montré qu’il y avait une forte homogénéité entre les virus isolés pendant les<br />
épidémies de rougeole en Afrique. En effet, les séquences de trois souches isolées en Gambie<br />
(1993) montrent une différence de trois nucléotides au niveau du gène H. Toutes ces<br />
mutations sont silencieuses. De même, l’analyse des séquences de quatre autres souches<br />
isolées au Cameroun (2001) indique une différence de trois nucléotides dans le gène H dont<br />
une seule entraîne un changement d’acide aminé dans la souche CR83. Ces résultats<br />
concordent avec les données obtenues en Corée, au Japon. En effet, les travaux de Na et al.,<br />
(2001) montrent que les séquences de gènes H et N des souches de virus de la rougeole<br />
isolées pendant l’épidémie de 2000 ont un degré d’homologie supérieur à 99,8%. Ces souches<br />
appartiennent toutes au génotype H1. Des résultats similaires ont été obtenus avec les souches<br />
circulant au Brésil pendant l’épidémie de 1997. L’analyse des séquences des gènes N de 8<br />
souches isolées pendant cette période montre qu’elles sont identiques et appartiennent toutes<br />
au génotype D6 (Siqueira et al., 2001). De même, les résultats obtenus (El-Mubarak et al.,<br />
2002) sur les souches isolées au Soudan montrent une homologie de séquences dans le gène N<br />
avec une divergence nucléotidique inférieure à 1,3% sur une période de 3 ans (1997-2000).<br />
Toutes ces souches appartenaient au génotype B3.1.<br />
127
VII. Discussion<br />
2. Epidémiologie<br />
Cependant, des études réalisées au Nigeria ont montré que les virus circulant à Lagos en<br />
1998 étaient hétérogènes, avec une différence nucléotidique atteignant 3,7% dans le gène N,<br />
et appartenaient à deux génotypes différents (B3.1 et B3.2) (Hanses et al., 1999). Bien que ces<br />
virus soient différents, ils appartiennent tous au clade B. Ceci suggère qu’ils ont évolués au<br />
cours du temps suite à des pressions naturelles à partir du même virus. Ce type<br />
d’hétérogénéité est tout à fait différent de la diversité de virus de la rougeole observée aux<br />
Etats-Unis pendant l’épidémie de 1994. En fait, il a été montré que les virus impliqués dans<br />
cette épidémie appartenaient à 5 génotypes différents (Rota et al., 1996). Cette diversité a été<br />
attribuée à des origines d’importation différentes.<br />
L’un des avantages de l’épidémiologie moléculaire est de pouvoir suivre la variabilité du<br />
virus au cours du temps sur le même site géographique. Notre étude menée sur le site de<br />
Yaoundé au Cameroun a permis de comparer les souches de virus de la rougeole isolées en<br />
1983 avec des souches isolées en 2001 (18 années d’écart). Cette étude montre que les<br />
souches de 2001 appartiennent au génotype B3.1, qui est différent du génotype B1 qui<br />
circulait à Yaoundé en 1983. Cette observation suggère que les virus B3.1 auraient été<br />
importés du Nigeria ou des autres pays voisins.<br />
L’analyse phylogénétique des souches isolées en Gambie en 1993 a montré qu’elles<br />
appartenaient au génotype B3.2, ce qui concorde avec l’étude de Hanses et al., (1999) qui ont<br />
trouvé le génotype B3.2 au Ghana. Ces résultats indiquent que les virus du génotype B3.2<br />
circulent en Afrique de l’Ouest tandis que les virus du génotype B3.1 se trouvent en Afrique<br />
Centrale et au Soudan. Le Nigeria ayant une position charnière entre ces deux régions, cela<br />
peux expliquer pourquoi les génotypes B3.1 et B3.2 y co-circulent (Figure 11).<br />
Les travaux de Chibo et al., (2000), réalisés à Victoria en Australie sur des souches isolées<br />
entre 1973 et 1998, juste après les campagnes de vaccination, ont montré une succession de 6<br />
génotypes au cours de 25 années. Le génotype D1, ayant circulé de 1973 à 1985 a été<br />
remplacé par le génotype D7 (1986-1989), suivi du génotype C2 (1990-1991) et du génotype<br />
H en 1993. Les génotypes D4 et D5 auraient co-circulé en 1998. Il ressort de cette étude que<br />
le génotype D1 représenterait le virus endogène et que les 5 autres proviendraient de<br />
l’importation. Cependant, aucune souche de virus n’ayant été isolée a Victoria avant les<br />
campagnes de vaccination de masse, il est difficile d’affirmer que D1 est bien le génotype<br />
endogène. A ce jour, notre étude sur les souches de virus de la rougeole isolées à Yaoundé est<br />
la première à avoir examiné la diversité du virus de la rougeole dans un site géographique, sur<br />
une période aussi longue avant l’introduction des campagnes de vaccination.<br />
128
VII. Discussion<br />
2. Epidémiologie<br />
Des efforts considérables ont été déployés dans le monde entier pour lutter contre ce fléau<br />
qu’est la rougeole. Depuis 1995, près de 25 million d’enfants ont été vaccinés dans le cadre<br />
des campagnes de rattrapage dans 7 pays d’Afrique Australe (Afrique du Sud, Botswana,<br />
Lesotho, Malawi, Namibie, Swaziland et Zimbabwe). Il en résulte une diminution<br />
spectaculaire des cas de rougeole passant de plus de 50 000 par an avant les campagnes de<br />
vaccination à 100 cas en 1999. Les décès dus à la rougeole ont été ramenés d’un nombre<br />
estimé à 3 700 avant ces campagnes, à 2 en 1999 et à zéro en 2000 (WHO, 2002a). Malgré<br />
ces efforts, l’Afrique continue de signaler les taux de couverture vaccinales les plus faibles et<br />
les taux d’incidence les plus élevés. On estime que la majorité (>90%) des décès liés à la<br />
rougeole survient en Asie du Sud-Est et en Afrique (WHO, 2002b). Ceci peut s’expliquer par<br />
le fait que :<br />
La vaccination de routine ne couvre pas toute la population ciblée ; de plus, la majorité<br />
des pays africains ne proposent pas de deuxième dose de vaccin qui permettrait de<br />
rattraper les enfants ayant échappé à la première vaccination et de corriger les échecs<br />
primaires de vaccination chez ceux qui ont été vaccinés.<br />
Plusieurs régions en Afrique sont accablées par la forte prévalence de l’infection par le<br />
VIH. Bien que les études de Moss et al., (2002) aient montré que la réplication du VIH<br />
est supprimée au cours de la rougeole, on ne peut pas en dire autant quant à l’impact<br />
du VIH sur la pathologie de la rougeole. Plusieurs facteurs suggèrent que l’épidémie<br />
de VIH augmente la transmission du virus de la rougeole et empiète sur les efforts<br />
d’éradication de cette maladie :<br />
- la prévention est entravée par l’immunogénicité réduite du vaccin contre la<br />
rougeole chez les personnes infectées par le VIH. En effet, une étude réalisée au Zaire<br />
montre que la vaccination contre la rougeole induit une faible réponse anticorps chez<br />
les personnes infectées par le VIH par rapport à des personnes saines (Oxtoby et al.,<br />
1989).<br />
- la période de contagion est rallongée chez les sujets immunodéprimés. Chez<br />
les sujets normaux infectés par le virus de la rougeole, le virus peut être isolé à partir<br />
de PBMC dans les 4 jours suivant l’éruption. Or les travaux de Permar et al., (2001)<br />
ont montré que l’ARN du virus de la rougeole est encore présent chez les personnes<br />
infectées par le VIH 46 jours après l’éruption. Ce qui suggère que ces personnes<br />
excrètent le virus de la rougeole pendant longtemps et augmentent ainsi la<br />
transmission du virus de la rougeole. Ces résultats offrent une explication possible au<br />
129
VII. Discussion<br />
2. Epidémiologie<br />
fait que pendant nos travaux effectués à Yaoundé, le virus de la rougeole a été isolé<br />
dans certains cas 9 jours après l’éruption.<br />
Plusieurs études ont noté l’existence d’une différence d’antigénicité entre certaines<br />
souches sauvages africaines et les souches vaccinales de virus de la rougeole.<br />
Notre étude montre que, contrairement à la souche vaccinale Hallé, les souches de<br />
virus appartenant au génotype B3.2 ne sont pas reconnues par l’anticorps F186<br />
dirigé contre la protéine F du virus de la rougeole. De plus, un autre anticorps<br />
BH30 dirigé contre l’hémagglutinine, se lie à ces virus avec une efficacité 10 fois<br />
inférieure à celle de la souche vaccinale. Les études réalisées dans le laboratoire de<br />
Muller ont donné des résultats qui vont dans le même sens que notre étude. En<br />
effet, des tests de neutralisation effectués avec une série d’anticorps monclonaux et<br />
polyclonaux montre que toutes les souches vaccinales sont neutralisées par tous les<br />
anticorps monoclonaux, tandis que certaines souches sauvages sont neutralisées<br />
par seulement 60% des anticorps monoclonaux (Muller, 2001). Ces résultats<br />
suggèrent qu’il existe une différence d’antigénicité significative entre certaines<br />
souches sauvages et les souches vaccinales, qui rend les premières plus résistantes<br />
aux anticorps induits par la vaccination. De telles souches seraient à l’origine de<br />
l’infection observée dans les populations vaccinées.<br />
130
Figure 11 : Situation actuelle de la répartition géographique des différents<br />
génotypes de virus de la rougeole en Afrique<br />
Gambie<br />
B3.2 (1993)<br />
B3.2<br />
B3.2<br />
B3.1 et<br />
B3.2<br />
Ghana<br />
Nigeria<br />
Cameroun<br />
Gabon<br />
B1? (1983),<br />
B3.1(2001)<br />
B2<br />
B3.1<br />
B3.1<br />
Soudan<br />
D4<br />
Ethiopie<br />
D4<br />
Kénya<br />
A et D<br />
Afrique du Sud<br />
Les génotypes identifiés dans cette étude sont indiqués en marron. Les hypotèses de circulation du virus de<br />
la rougeole en Afrique de l’ouest et en Afrique centrale sont indiquées en Rouge.
CHAPITRE VIII. CONCLUSION ET<br />
PERSPECTIVES<br />
132
VIII. Conclusions et perspectives<br />
L’OMS estime qu’il y a environ 800 000 morts par an dans le monde dus à la<br />
rougeole. L’Afrique sub-Saharienne compte à elle seule plus de la moitié de ce chiffre. La<br />
réduction de la mortalité associée à la rougeole est un problème prioritaire de santé public<br />
dans les pays en développement. L’éradication de la rougeole est théoriquement possible car<br />
aucun réservoir animal n’est connu et le vaccin contre la rougeole est efficace. En pratique, la<br />
rougeole est une maladie très contagieuse, ce qui rend son éradication difficile. L’interruption<br />
de la transmission nécessite que plus de 95% de la population soit vaccinée. La difficulté à<br />
atteindre la couverture vaccinale requise dans les pays en développement et le fait que le<br />
public dans les pays industrialisés ne soit pas conscient de l’impact de la rougeole sur la santé<br />
ne facilitent pas la lutte contre cette maladie. Cependant, le succès des programmes de lutte<br />
contre la rougeole aux Etats-Unis et en Amérique du Sud a montré que la rougeole peut être<br />
éliminée. Mais la réintroduction du virus importé a fait prendre conscience que la lutte contre<br />
la rougeole devrait être effectuée en même temps dans toutes les régions du monde. Les<br />
campagnes de vaccination lancées par l’OMS sont actuellement mises en place dans le monde<br />
entier.<br />
L’épidémiologie moléculaire est un outil indispensable au suivi de l’impact de ces<br />
campagnes sur l’épidémiologie de la rougeole. Elle a permis de montrer une diversité<br />
génétique parmi les différentes souches de virus de la rougeole. Pour faciliter ces études, une<br />
banque de séquences a été mise en place par l’OMS. Cependant, plusieurs études ayant<br />
montré des différences antigéniques entre les souches vaccinales et certaines souches<br />
sauvages, il serait intéressant d’établir une banque d’anticorps qui permettrait de faire la<br />
différence entre les génotypes. La technique de marquage avec les anticorps est plus rapide et<br />
facile à réaliser dans les laboratoires des pays en développement que la technique de<br />
séquençage qui nécessite un équipement onéreux.<br />
Les études d’adaptation du virus de la rougeole aux cellules en culture a permis de<br />
suggérer qu’il y aurait des récepteurs autres que S<strong>LA</strong>M pour les souches sauvages du virus de<br />
la rougeole. L’identification de ces récepteurs permettra de mieux comprendre les<br />
observations faites sur la pathologie de la rougeole où l’on constate qu’il y a des différences<br />
entre la distribution tissulaire du virus et la distribution des récepteurs à la surfaces des<br />
cellules.<br />
133
ANNEXES<br />
134
Consensus ATGTCACCRC AACGAGACCG GATAAATGCC TTCTACAAAG ATAACCCTTA TCCCAAGGGA AGTAGGATAG TTATTAACAG AGAACATCTT ATGATTGACA 100<br />
HA 954_véro ........G. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
HA 954_PBL ........A. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
HA 954_B95a ........G. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
Consensus GACCTTATGT TTTGCTGGCT GTTCTGTTCG TCATGTTTCT GAGCTTGATC GGGTTGCTGG CCATTGCAGG CATTAGACTT CATCGGGCAG CCATCTACAC 200<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
Consensus CGCGGAGATC CATAAAAGCC TCAGCACCAA TCTAGATGTA ACTAACTCAA TCGAGCATCA GGTCAAGGAC GTGCTGACAC CACTCTTTAA AATCATCGGG 300<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
Consensus GATGAAGTGG GCCTGAGAAC ACCTCAGAGA TTCACTGACC TAGTGAAATT CATCTCTGAC AAGATTAAAT TCCTTAATCC GGATAGGGAG TACGACTTCA 400<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
Consensus GAGATCTCAC TTGGTGTATC AACCCGCCAG AGAGAATCAA ACTGGATTAT GATCAATACT GTGCAGATGT GGCTGCTGAA GAGCTCATGA ATGCATTGGT 500<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
Consensus GAACTCAACT CTACTGGAGA CCAGAACAAC CAATCAGTTC CTAGCTGTCT CAAAGGGAAA CTGCTCAGGG CCCACTACAA TCAGAGGTCA ATTCTCAAAC 600<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
Consensus ATGTCGCTGT CCTTATTGGA CCTGTACTTA GGTCGGGGTT ACAATGTGTC ATCTATAGTC ACTATGACAT CCCAGGGAAT GTATGGGGGA ACCTACTTAG 700<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 700<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 700<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 700<br />
Consensus TGGAAAAGCC TAATCTGAGC AGCAAAGGGT CAGAGTTGTC ACAACTGAGC ATGTACCGAG TGTTTGAAGT AGGTGTTATC AGAAACCCGG GTTTGGGGGC 800<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
Consensus TCCGGTGTTC CATATGACAA ACTATTTTGA GCAACCAGTC AGTAATGATC TCGGCAACTG TATGGTAGCT TTGGGGGAGC TCAAACTCGC AGCCCTTTGT 900<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
Consensus CACGGGGAAG ATTCTATCAC AATTCCCTAT CAGGGATCAG GGAAAGGTGT CAGCTTCCAG CTCGTCAAGC TAGGTGTCTG GAAATCCCCA ACCGACATGC 1000<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1000<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1000<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1000<br />
Consensus AATCCTGGGT CCCCTTATCA ACGGATGATC CAGTGGTAGA CAGGCTTTAC CTCTCATCTC ACAGAGGTGT CATCGCTGAC AATCAAGCAA AATGGGCTGT 1100<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
Consensus CCCGACAACA CGAACAGATG ACAAGTTGCG AATGGAGACA TGCTTCCAGC AGGCGTGTAA AGGTAAAATC CAAGCACTCT GCGAGAATCC CGAGTGGGCA 1200<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
Consensus CCATTGAAGG ATAACAGGAT TCCTTCATAC GGGGTCCTGT CTGTTGATCT GAGTCTGACA GTTGAGCTTA AAATCAAGAT TGCTTCGGGA TTCGGACCAT 1300<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1300<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1300<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1300<br />
Consensus TGATTACGCA CGGCTCAGGG ATGGACCTAT ACAAATCCAA CCGCAACAAT GTGTATTGGC TGACTATCCC GCCAATGAGG AATCTAGCCT TAGGTGTAAT 1400<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
Consensus CAACACATTG GCGTGGATAC CGAGATTCAA GGTTAGTCCC AACCTCTTCA CTGTCCCAAT TAAGGAAGCA GGCGAAGACT GCCATGCCCC AACATACCTA 1500<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
Consensus CCTGCGGAGG TGGACGGTGA TGTCAAACTC AGTTCCAATC TGGTGATTCT ACCTGGTCAA GATCTCCAAT ATGTTTTGGC AACCTACGAT ACTTCCAGGG 1600<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1600<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1600<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1600<br />
Consensus TTGAACATGC TGTGGTTTAT TACGTTTACA GCCCAAGCCG CTCATTTTCT TACTTTTATC CTTTTAGGTT GCCTATAAAG GGGGTCCCAA TCGAATTACA 1700<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1700<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1700<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1700<br />
Consensus AGTGGAATGC TTCACATGGG ACCAAAAACT CTGGTGCCGT CACTTCTGTG TGCTTGCGGA CTCGGAATCC GGTGGACATA TCACTCACTC TGGGATGGTG 1800<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
Consensus GGCATGGGAG TCAGCTGCAC AGCCACCCGG GAAGATGGGA CCAATCGCAG ATAG 1854<br />
HA 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
HA 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
HA 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
Annexe 1: Comparaison des séquences des gène H et F de la souche G954 après passage dans<br />
les cellules Véros, les PBLet les cellules B95a.
Consensus ATATCCATCA TGGGTCTCAA GGTGAACGTC TCTGCCATAT TCATGGCAGT ACTGTTAACT CTCCAAACAC CCGCCGGTCA AATCCATTGG GGCAATCTCT 100<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
Consensus CTAAGATAGG GGTAGTAGGA ATAGGAAGTG CAAGCTACAA AGTTATGACT CGTTCCAGCC ATCAATCATT AGTCATAAAA TTAATGCCCA ATATAACTCT 200<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
Consensus CCTCAATAAC TGCACGAAGG TAGAGATTGC AGAGTACAGG AGACTACTAA GAACAGTTCT GGAACCAATT AGAGATGCAC TTAATGCAAT GACCCAGAAC 300<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
Consensus ATAAGGCCGG TTCAGAGCGT AGCTTCAAGT AGGAGACACA AGAGATTTGC GGGAGTAGTC CTGGCAGGTG CGGCCCTAGG CGTTGCCACA GCTGCTCAGA 400<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
Consensus TAACAGCCGG CATTGCACTT CACCGGTCCA TGCTGAACTC TCAAGCCATC GACAATCTGA GAGCGAGCCT GGAAACTACT AATCAGGCAA TTGAGGCAAT 500<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
Consensus CAGACAAGCA GGGCAGGAGA TGATCTTGGC TGTTCAGGGT GTCCAAGACT ACATCAATAA TGAGCTGATA CCATCTATGA ACCAGCTATC TTGTGATTTA 600<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
Consensus ATCGGCCAGA AGCTCGGGCT CAAATTGCTC AGATACTATA CAGAAATCCT GTCATTATTT GGCCCCAGCC TACGAGACCC CATATCTGCG GAGATATCTA 700<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 700<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 700<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 700<br />
Consensus TCCAGGCTTT GAGCTATGCA CTTGGAGGAG ATATCAATAA GGTGTTAGAA AAGCTCGGAT ACAGTGGAGG CGATTTACTG GGCATCTTAG AGAGCAGAGG 800<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
Consensus AATAAAGGCT CGGATAACTC ACGTCGACAC AGAGTCCTAC TTCATTGTCC TCAGTATAGC CTATCCGACA CTGTCCGAGA TTAAGGGGGT GATTGTCCAC 900<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
Consensus CGGCTAGAGG GGGTCTCGTA CAACATAGGC TCTCAAGAGT GGTATACCAC TGTGCCCAAG TATGTTGCAA CCCAAGGGTA CCTTATCTCG AATTTTGATG 1000<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1000<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1000<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1000<br />
Consensus AGTCATCGTG TACCTTCATG CCAGAGGGGA CTGTGTGCAG CCAAAATGCC TTGTACCCGA TGAGTCCTCT GCTCCAAGAA TGCCTCCGGG GGTCCACCAA 1100<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
Consensus GTCCTGTGCT CGTACACTCG TATCCGGGTC TTTTGGGAAC CGGTTCATTT TATCACAAGG GAACCTAATA GCCAATTGTG CATCAATTCT TTGCAAGTGT 1200<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
Consensus TACACAACAG GAACGATCAT TAATCAAGAC CCTGACAAGA TCCTAACATA CATCGCTGCC GATCGCTGCC CGGTAGTCGA GGTAAACGGC GTGACCATCC 1300<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1300<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1300<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1300<br />
Consensus AAGTCGGGAG CAGGAGGTAT CCAGACGCTG TGTATTTGCA CAGAATTGAC CTCGGTCCTC CCATATCATT GGAGAGGTTG GACGTAGGGA CAAATCTGGG 1400<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
Consensus GAATGCAATT GCCAAATTGG AGGATGCCAA GGAATTGTTG GAGTCATCGG ACCAGATATT GAGGAGTATG AAAGGTTTAT CGAGCACTAG CATAGTCTAC 1500<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
Consensus ATCCTGATTG CAGTGTGTCT TGGAGGGCTG ATAGGGATCC CCACTTTAAT ATGTTGCTGC AGGGGGCGTT GTAACAAAAA GGGAGAACAA GTTGGTATGT 1600<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1600<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1600<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1600<br />
Consensus CAAGACCAGG CCTAAAGCCT GATCTTACAG GAACATCAAA ATCCTATGTA AGGTCGCTTT GA 1662<br />
F 954_véro .......... .......... .......... .......... .......... .......... .. 1662<br />
F 954_B95a .......... .......... .......... .......... .......... .......... .. 1662<br />
F 954_PBL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .. 1662<br />
Annexe 1: suite
Véro<br />
G954<br />
Véro<br />
Hallé<br />
Véro<br />
F0 (60kDa)<br />
F1 (40kDa)<br />
Annexe 2 : Marquage de la protéine F par Western Blot des extraits de cellules<br />
Véros infectées par la souche G954 ou par la souche Hallé
Consensus MTEIYDFDKS AWDIKGSIAP IQPTTYSDGR LVPQVRVIDP GLGDRK<strong>DE</strong>CF MYMFLLGVVE 60<br />
Trans of M G954/B95 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 60<br />
Trans of M Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... 60<br />
Trans of M G954/ver .......... .......... .......... .......... .......... .......... 60<br />
89<br />
Consensus DSDPLGPPIG RAFGSLPLGV GRSTAKPEKL LKEATELDIV VRRTAGLNEK LVFYNNTPLT 120<br />
Trans of M G954/B95 .......... .......... ........E. .......... .......... .......... 120<br />
Trans of M Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... 120<br />
Trans of M G954/ver .......... .......... .......... .......... .......... .......... 120<br />
Consensus LLTPWRKVLT TGSVFNANQV CNAVNLIPLD TPQRFRVVYM SITRLSDNGY YTVPRRMLEF 180<br />
Trans of M G954/B95 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 180<br />
Trans of M Edmonsto .......... .......... .S........ .......... .......... .......... 180<br />
Trans of M G954/ver .......... .......... .......... .......... .......... .......... 180<br />
Consensus RSVNAVAFNL LVTLRIDKAI GPGKIIDNTE QLPEATFMVH IGNFRRKKSE VYSADYCKMK 240<br />
Trans of M G954/B95 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240<br />
Trans of M Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240<br />
Trans of M G954/ver .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240<br />
Consensus IEKMGLVFAL GGIGGTSLHI RSTGKMSKTL HAQLGFKKTL CYPLMDINED LNRLLWRSRC 300<br />
Trans of M G954/B95 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
Trans of M Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
Trans of M G954/ver .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
Consensus KIVRIQAVLQ PSVPQEFRIY DDVIINDDQG LFKVL 335<br />
Trans of M G954/B95 .......... .......... .......... ..... 335<br />
Trans of M Edmonsto .......... .......... .......... ..... 335<br />
Trans of M G954/ver .......... .......... .......... ..... 335<br />
Annexe 3 : Comparaison des séquences de la protéine M de la souche G954 dans les cellules B95a et<br />
après adaptation aux cellules Véro avec celle de la souche vaccinale Edmonston. La mutation au<br />
niveau de la position 89 est indiquée.
Consensus ATGTCACCRC AACGAGACCG GATAAATGCC TTCTACAAAG ATAACCCTTA TCCCAAGGGA AGTAGGATAG TTATTAACAG AGAACATCTT 90<br />
HA G954 ........G. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 90<br />
HA G943 ........A. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 90<br />
HA G945 ........G. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 90<br />
Consensus ATGATTGACA GACCTTATGT TTTGCTGGCT GTTCTGTTCG TCATGTTTCT GAGCTTGATC GGGTTGCTGG CCATTGCAGG CATTAGACTT 180<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 180<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 180<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 180<br />
Consensus CATCGGGCAG CCATCTACAC CGCGGAGATC CATAAAAGCC TCAGCACCAA TCTAGATGTA ACTAACTCAA TCGAGCATCA GGTCAAGGAC 270<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 270<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 270<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 270<br />
Consensus GTGCTGACAC CACTCTTTAA AATCATCGGG GATGAAGTGG GCCTGAGAAC ACCTCAGAGA TTCACTGACC TAGTGAAATT CATCTCTGAC 360<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 360<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 360<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 360<br />
Consensus AAGATTAAAT TCCTTAATCC GGATAGGGAG TACGACTTCA GAGATCTCAC TTGGTGTATC AACCCGCCAG AGAGAATCAA ACTGGATTAT 450<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 450<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 450<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 450<br />
Consensus GATCAATACT GTGCAGATGT GGCTGCTGAA GAGCTCATGA ATGCATTGGT GAACTCAACT CTACTGGAGA CCAGAACAAC CAATCAGTTC 540<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 540<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 540<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 540<br />
Consensus CTAGCTGTCT CAAAGGGAAA CTGCTCAGGG CCCACTACAA TCAGAGGTCA ATTCTCAAAC ATGTCGCTGT CCTTATTGGA CCTGTACTTA 630<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 630<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 630<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 630<br />
Consensus GGTCGGGGTT ACAATGTGTC ATCTATAGTC ACTATGACAT CCCAGGGAAT GTATGGGGGA ACCTACYTAG TGGAAAAGCC TAATCTGAGC 720<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... .......... 720<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......C... .......... .......... 720<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......C... .......... .......... 720<br />
Consensus AGCAAAGGGT CAGAGTTGTC ACAACTGAGC ATGTACCGAG TGTTTGAAGT AGGTGTTATC AGAAACCCGG GTTTGGGGGC TCCGGTGTTC 810<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 810<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 810<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 810<br />
Consensus CATATGACAA ACTATTTTGA GCAACCAGTC AGTAATGATC TCGGCAACTG TATGGTAGCT TTGGGGGAGC TCAAACTCGC AGCCCTTTGT 900<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
Consensus CACGGGGAAG ATTCTATCAC AATTCCCTAT CAGGGATCAG GGAAAGGTGT CAGCTTCCAG CTCGTCAAGC TAGGTGTCTG GAAATCCCCA 990<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 990<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 990<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 990<br />
Consensus ACCGACATGC AATCCTGGGT CCCCTTATCA ACGGATGATC CAGTGGTAGA CAGGCTTTAC CTCTCATCTC ACAGAGGTGT CATCGCTGAC 1080<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1080<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1080<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1080<br />
Consensus AATCAAGCAA AATGGGCTGT CCCGACAACA CGAACAGATG ACAAGTTGCG AATGGAGACA TGCTTYCAGC AGGCGTGTAA AGGTAAAATC 1170<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... 1170<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... 1170<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....T.... .......... .......... 1170<br />
Consensus CAAGCACTCT GCGAGAATCC CGAGTGGGCA CCATTGAAGG ATAACAGGAT TCCTTCATAC GGGGTCCTGT CTGTTGATCT GAGTCTGACA 1260<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1260<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1260<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1260<br />
Consensus GTTGAGCTTA AAATCAAGAT TGCTTCGGGA TTCGGACCAT TGATTACGCA CGGCTCAGGG ATGGACCTAT ACAAATCCAA CCGCAACAAT 1350<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1350<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1350<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1350<br />
Consensus GTGTATTGGC TGACTATCCC GCCAATGAGG AATCTAGCCT TAGGTGTAAT CAACACATTG GCGTGGATAC CGAGATTCAA GGTTAGTCCC 1440<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1440<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1440<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1440<br />
Consensus AACCTCTTCA CTGTCCCAAT TAAGGAAGCA GGCGAAGACT GCCATGCCCC AACATACCTA CCTGCGGAGG TGGACGGTGA TGTCAAACTC 1530<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1530<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1530<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1530<br />
Consensus AGTTCCAATC TGGTGATTCT ACCTGGTCAA GATCTCCAAT ATGTTTTGGC AACCTACGAT ACYTCCAGGG TTGAACATGC TGTGGTTTAT 1620<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..T....... .......... .......... 1620<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..C....... .......... .......... 1620<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..C....... .......... .......... 1620<br />
Consensus TACGTTTACA GCCCAAGCCG CTCATTTTCT TACTTTTATC CTTTTAGGTT GCCTATAAAG GGGGTCCCAA TCGAATTACA AGTGGAATGC 1710<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1710<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1710<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1710<br />
Consensus TTCACATGGG ACCAAAAACT CTGGTGCCGT CACTTCTGTG TGCTTGCGGA CTCGGAATCC GGTGGACATA TCACTCACTC TGGGATGGTG 1800<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
Consensus GGCATGGGAG TCAGCTGCAC AGCCACCCGG GAAGATGGGA CCAATCGCAG ATAG 1854<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
HA G943 .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
HA G945 .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
Annexe 4 : Comparaison des séquences de gène H des souches G954, G943,<br />
G945 isolées en Gambie en 1993.
Consensus ATGTCACCGC AACGAGACCG GATAAATGCC TTCTACAAAG ATAACCCTTA TCCCAAGGGA AGTAGGATAG TTATTAACAG AGAACATCTT ATGATTGACA GACCCTATGT TCTGCTGGCT 120<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 120<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 120<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 120<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 120<br />
Consensus GTTCTGTTCG TCATGTTTCT GAGCTTGATC GGATTGCTGG CAATTGCAGG CATTAGACTT CATCGGGCAG CCATCTACAC CGCGGAGATC CATAAAAGCC TCAGTACCAA TCTAGATGTG 240<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240<br />
Consensus ACTAACTCAA TCGAGCATCA GGTCAAGGAC GTGCTGACAC CACTCTTTAA AATCATCGGG GATGAAGTGG GCCTGAGAAC ACCTCAGAGA TTCTCTGACC TAGTGAAATT CATCTCTGAC 360<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 360<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 360<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 360<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 360<br />
Consensus AAGATTAAAT TCCTTAATCC GGATAGGGAG TACGACTTCA GAGATCTCAC TTGGTGCATC AACCCGCCAG AGAGGATCAA ACTAGATTAT GATCAATACT GTGCAGATGT GGCTGCTGAA 480<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 480<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 480<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 480<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 480<br />
Consensus GAGCTCATGA ATGCATTGGT GAACTCAACT CTACTGGAGA CCAGAACAAC CAATCAGTTC CTAGCTGTCT CAAAGGGAAA CTGCTCAGGG CCCACTACAA TCAGAGGTCA ATTCTCAAAC 600<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
Consensus ATGTCGCTGT CCTTGTTGGA CTTGTACTTA GGTCGAGGTT ACAATGTGTC ATCTATAGTC ACTATGACAT CCCAGGGAAT GTATGGGGGA ACCTACCTAG TTGAAAAGCC TAATCTGAAC 720<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 720<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 720<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 720<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 720<br />
Consensus AGCAAAGGGT CAGAGTTGTC ACAACTGAGC ATGTACCGAG TGTTTGAAGT AGGTGTTATC AGAAACCCGG GTTTGGGGGC TCCGGKGTTC CATATGACAA ACTATTTTGA GCAACCAGTC 840<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....G.... .......... .......... .......... 840<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....T.... .......... .......... .......... 840<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....T.... .......... .......... .......... 840<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....T.... .......... .......... .......... 840<br />
Consensus AGTAATGGTC TCGGCAACTG TATGGTGGCT TTGGGGGAGC TCAAACTCGC AGCCCTTTGT CACGGGGACG ATTCTATCAC AATTCCCTAT CAGGGRTCAG GGAAAGGTGT CAGCTTCCAG 960<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .......... 960<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....G.... .......... .......... 960<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .......... 960<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .......... 960<br />
Consensus CTCGTCAAGC TGGGTGTCTG GAAATCCCCA ACCGACATGC AATCCTGGGT CCCCTTATCA ACGGATGATC CAGTGGTAGA CAGGCTTTAC CTCTCATCTC ACAGAGGTGT CATCGCTGAC 1080<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1080<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1080<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1080<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1080<br />
Consensus AATCAAGCAA AATGGGCTGT CCCGACAACA CGAACAGATG ACAAGTTGCG AATGGAGACA TGCTTCCAGC AGGCGTGTAA GGGTAAAATC CAAGCACTCT GCGAGAATCC CGAGTGGGCA 1200<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
Consensus CCATTGAAGG ATAACAGGAT TCCTTCATAC GGGGTCTTGT CTGTTGATCT GAGTCTGACA GTTGAGCTTA AAATCAAAAT TGCTTCGGGA TTCGGGCCAT TGATCACACA CGGCTCAGGG 1320<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1320<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1320<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1320<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1320<br />
Consensus ATGGACCTAT ACAAATCCAA CCGCAACAAT GTGTATTGGC TGACTATCCC GCCAATGAGA AATCTAGCCT TAGGCGTAAT CAACACATTG GAGTGGATAC CGAGATTCAA GGTTAGTCCC 1440<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1440<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1440<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1440<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1440<br />
Consensus AACCTCTTCA CTGTCCCAAT TAAGGAAGCA GGCGAAGACT GCCATGCCCC AACATACCTA CCTGCGGAGG TGGACGGTGA TGTCAAACTC AGTTCCAACC TGGTGATTCT ACCTGGTCAA 1560<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1560<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1560<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1560<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1560<br />
Consensus GATCTCCAAT ATGTTTTGGC AACCTACGAT ACCTCCAGGG TTGAGCATGC TGTGGTTTAT TACGTTTACA GCCCAAGCCG CTCATTTTCT TACTTTTATC CTTTTAGGTT GCCTATAAAG 1680<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1680<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1680<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1680<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1680<br />
Consensus GGGGTCCCAA TCGAACTACA AGTGGAATGC TTCACATGGG ACCAAAAACT CTGGTGCCGT CACTTCTGTG TGCTTGCGGA CTCARAATCC GGTGGACATA TCACTCACTC TGGGATGGTG 1800<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....G..... .......... .......... .......... 1800<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....G..... .......... .......... .......... 1800<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... 1800<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....G..... .......... .......... .......... 1800<br />
Consensus GGCATGGGAG TCAGCTGCAC AGCCACCCGG GAAGATGGAA CCAATCGCAG ATAG 1854<br />
HA R83 .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
HA R72 .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
HA R82 .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
HA R67 .......... .......... .......... .......... .......... .... 1854<br />
Annexe 5: comparaison des séquences des gènes H des souches CR67, CR72, CR82, CR83<br />
isolées au Cameroun en 2001.
Consensus KVSST<strong>LA</strong>SEL GITAEDARLV SEIAMHTTED RISRAVGPRQ AQVSFLHGDQ 50<br />
Trans of N CR83 .......... .......... .......... .......... .......... 50<br />
Trans of N CR82 .......... .......... .......... .......... .......... 50<br />
Trans of N CR72 .......... .......... .......... .......... .......... 50<br />
Trans of N CR67 .......... .......... .......... .......... .......... 50<br />
Consensus SENELPRLGG KEDRRVKQSR GEAGESHRET GPSRASDARA AHPPTGTPLD 100<br />
Trans of N CR83 .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
Trans of N CR82 .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
Trans of N CR72 .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
Trans of N CR67 .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
Consensus IDTASEFSQD PQDSRRSADA LLRLQAMAGI SEEQDSDTDT PRVYNDRDLL 150<br />
Trans of N CR83 .......... .......... .......... .......... .......... 150<br />
Trans of N CR82 .......... .......... .......... .......... .......... 150<br />
Trans of N CR72 .......... .......... .......... .......... .......... 150<br />
Trans of N CR67 .......... .......... .......... .......... .......... 150<br />
Consensus D 151<br />
Trans of N CR83 . 151<br />
Trans of N CR82 . 151<br />
Trans of N CR72 . 151<br />
Trans of N CR67 . 151<br />
Annexe 5 (suite) : Comparaison des séquences de la partie C-terminale de la protéine N<br />
des souches CR67, CR72, CR82, CR83 isolées au Cameroun en 2001.
Consensus MSPQRDRINA FYKDNPYPKG SRIVINREHL MIDRPYVL<strong>LA</strong> VLFVMFLSLI GL<strong>LA</strong>IAGIRL HRAAIYTAEI HKSLS 75<br />
Trans of HA CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Trans of HA CR72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Trans of HA B1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Consensus TNLDVTNSIE HQVKDVLTPL FKIIG<strong>DE</strong>VGL RTPQRFTDLV KFISDKIKFL NPDREYDFRD LTWCINPPER IKLDY 150<br />
Trans of HA CR67 .......... .......... .......... ......S... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of HA CR72 .......... .......... .......... ......S... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of HA B1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Consensus DQYCADVAAE ELMNALVNST LLETRTTNQF <strong>LA</strong>VSKGNCSG PTTIRGQFSN MSLSLLDLYL GRGYNVSSIV TMTSQ 225<br />
Trans of HA CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of HA CR72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of HA B1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Consensus GMYGGTYLVE KPNLSSKGSE LSQLSMYRVF EVGVIRNPGL GAPVFHMTNY FEQPVSNDLG NCMVALGELK <strong>LA</strong>ALC 300<br />
Trans of HA CR67 .......... ....N..... .......... .......... .......... .......G.. .......... ..... 300<br />
Trans of HA CR72 .......... ....N..... .......... .......... .......... .......G.. .......... ..... 300<br />
Trans of HA B1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... ..H....... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Consensus HGEDSITIPY QGSGKGVSFQ LVKLGVWKSP TDMQSWVPLS TDDPVIDRLY LSSHRGVIAD NQAKWAVPTT RTDDK 375<br />
Trans of HA CR67 ..D....... .......... .......... .......... .....V.... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of HA CR72 ..D....... .......... .......... .......... .....V.... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of HA B1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Consensus LRMETCFQQA CKGKIQALCE NPEWAPLKDN RIPSYGVLSV DLSLTVELKI KIASGFGPLI THGSGMDLYK SNHNN 450<br />
Trans of HA CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..R.. 450<br />
Trans of HA CR72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..R.. 450<br />
Trans of HA B1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 450<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 450<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 450<br />
Consensus VYWLTIPPMR N<strong>LA</strong>LGVINTL EWIPRFKVSP NLFTVPIKEA GEDCHAPTYL PAEVDGDVKL SSNLVILPGQ DLQYV 525<br />
Trans of HA CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of HA CR72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of HA B1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Consensus <strong>LA</strong>TYDTSRVE HAVVYYVYSP SRSFSYFYPF RLPIKGVPIE LQVECFTWDQ KLWCRHFCVL ADSESGGHIT HSGMV 600<br />
Trans of HA CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 600<br />
Trans of HA CR72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 600<br />
Trans of HA B1 .......... .......... G......... .......... .......... .......... .......... ..... 600<br />
Trans of HA Y14 .......... .......... G......... .......... .......... .......... .......... ..... 600<br />
Trans of HA Y22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 600<br />
Consensus GMGVSCTATR EDGTNRR 617<br />
Trans of HA CR67 .......... ....... 617<br />
Trans of HA CR72 .......... ....... 617<br />
Trans of HA B1 .......... ....... 617<br />
Trans of HA Y14 .......... ....... 617<br />
Trans of HA Y22 .......... ....... 617<br />
Annexe 6: Comparaison des séquences des protéines HA des souches du Cameroun ; Y14 et Y22 (1983),<br />
CR67, CR72 (2001), B1 (référence clade B1).
Consensus ATGTCACCGC AACGAGACCG GATAAATGCC TTCTACAAAG ATAACCCTTA TCCCAAGGGA AGTAGGATAG TTATTAACAG AGAACATCTT ATGATTGACA 100<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 100<br />
Consensus GACCTTATGT TTTGCTGGCT GTTCTGTTCG TCATGTTTCT GAGCTTGATC GGGTTGCTGG CCATTGCAGG CATTAGACTT CATCGGGCAG CCATCTACAC 200<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 200<br />
Consensus CGCGGAGATC CATAAAAGCC TCAGCACCAA TCTAGATGTA ACTAACTCAA TCGAGCATCA GGTCAAGGAC GTGCTGACAC CACTCTTTAA AATCATCGGG 300<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 300<br />
Consensus GATGAAGTGG GCCTGAGAAC ACCTCAGAGA TTCACTGACC TAGTGAAATT CATCTCTGAC AAGATTAAAT TCCTTAATCC GGATAGGGAG TACGACTTCA 400<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 400<br />
Consensus GAGATCTCAC TTGGTGTATC AACCCGCCAG AGAGAATCAA ACTGGATTAT GATCAATACT GTGCAGATGT GGCTGCTGAA GAGCTCATGA ATGCATTGGT 500<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 500<br />
Consensus GAACTCAACT CTACTGGAGA CCAGAACAAC CAATCAGTTC CTAGCTGTCT CAAAGGGAAA CTGCTCAGGG CCCACTACAA TCAGAGGTCA ATTCTCAAAC 600<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 600<br />
Consensus ATGTCGCTGT CCTTATTGGA CCTGTACTTA GGTCGGGGTT ACAATGTGTC ATCTATAGTC ACTATGACAT CCCAGGGAAT GTATGGGGGA ACCTACYTAG 700<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......T... 700<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......C... 700<br />
Consensus TGGAAAAGCC TAATCTGAGC AGCAAAGGGT CAGAGTTGTC ACAACTGAGC ATGTACCGAG TGTTTGAAGT AGGTGTTATC AGAAACCCGG GTTTGGGGGC 800<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 800<br />
Consensus TCCGGTGTTC CATATGACAA ACTATTTTGA GCAACCAGTC AGTAATGATC TCGGCAACTG TATGGTAGCT TTGGGGGAGC TCAAACTCGC AGCCCTTTGT 900<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 900<br />
Consensus CACGGGGAAG ATTCTATCAC AATTCCCTAT CAGGGATCAG GGAAAGGTGT CAGCTTCCAG CTCGTCAAGC TRGGTGTCTG GAAATCCCCA ACCGACATGC 1000<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .A........ .......... .......... 1000<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .G........ .......... .......... 1000<br />
Consensus AATCCTGGGT CCCCTTATCA ACGGATGATC CAGTGGTAGA CAGGCTTTAC CTCTCATCTC ACAGAGGTGT CATCGCTGAC AATCAAGCAA AATGGGCTGT 1100<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1100<br />
Consensus CCCGACAACA CGAACAGATG ACAAGTTGCG AATGGAGACA TGCTTCCAGC AGGCGTGTAA AGGTAAAATC CAAGCACTCT GCGAGAATCC CGAGTGGGCA 1200<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1200<br />
Consensus CCATTGAARG ATAACAGGAT TCCTTCATAC GGGGTCCTGT CTGTTGATCT GAGTCTGACA GTTGAGCTTA AAATCAARAT TGCTTCGGGA TTCGGACCAT 1300<br />
HA G954 ........G. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... 1300<br />
HA Lys ........A. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......A.. .......... .......... 1300<br />
Consensus TGATYACGCA CGGCTCAGGG ATGGACCTAT ACAAATCCAA CCGCAACAAT GTGTATTGGC TGACTATCCC GCCAATGAGG AATCTAGCCT TAGGTGTAAT 1400<br />
HA G954 ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
HA Lys ....C..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1400<br />
Consensus CAACACATTG GCGTGGATAC CGAGATTCAA GGTTAGTCCC AACCTCTTCA CTGTCCCAAT TAAGGAAGCA GGCGAAGACT GCCATGCCCC AACATACCTA 1500<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1500<br />
Consensus CCTGCGGAGG TGGACGGTGA TGTCAAACTC AGTTCCAATC TGGTGATTCT ACCTGGTCAA GATCTCCAAT AYGTYTTGGC AACCTACGAT ACTTCCAGGG 1600<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .T..T..... .......... .......... 1600<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .C..C..... .......... .......... 1600<br />
Consensus TTGAACATGC TGTGGTTTAT TACGTTTACA GCCCAAGCCG CTCATTTTCT TACTTTTATC CTTTTAGGTT GCCTATAAAG GGGGTCCCAA TCGAATTACA 1700<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1700<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1700<br />
Consensus AGTGGAATGC TTCACATGGG ACCAAAAACT CTGGTGCCGT CACTTCTGTG TGCTTGCGGA CTCGGAATCC GGTGGACATA TCACTCACTC TGGGATGGTG 1800<br />
HA G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
HA Lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1800<br />
Consensus GGCATGGGAG TCAGCTGCAC AGCCACCCGG GAAGATGGRA CCAATCGCAG ATAG 1854<br />
HA G954 .......... .......... .......... ........G. .......... .... 1854<br />
HA Lys .......... .......... .......... ........A. .......... .... 1854<br />
Annexe 7 : Comparaison des séquences des gènes HA de la souches G954<br />
isolée en Gambie en 1993 et de la souche Lys-1 isolée à Lyon en 1994 sur un<br />
patient arrivant de la Gambie
Consensus MGLKVNVSAI FMAVLLTLQT PAGQIHWGNL SKIGVVGIGS ASYKVMTRSS HQSLVIKLMP NITLLNNCTR VEIAE 75<br />
Trans of F lys .......... .......... .......... .......... .......... ........I. .........K ..... 75<br />
Trans of F G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........K ..... 75<br />
Trans of F CR67 .........V .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Trans of F CR 72 .........V .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... .T........ .......... .......... .......... .......... ..... 75<br />
Consensus YRRLLRTVLE PIRDALNAMT QNIRPVQSVA SSRRHKRFAG VV<strong>LA</strong>GAALGV ATAAQITAGI ALHRSMLNSQ AIDNL 150<br />
Trans of F lys .......... .......... .......... ..M....... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of F G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of F CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of F CR 72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 150<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...Q...... ..... 150<br />
Consensus RASLETTNQA IEAIRQAGQE MI<strong>LA</strong>VQGVQD YINNELIPSM NQLSCDLIGQ KLGLKLLRYY TEILSLFGPS LRDPI 225<br />
Trans of F lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of F G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of F CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of F CR 72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 225<br />
Consensus SAEISIQALS YALGGDINKV LEKLGYSGGD LLGILESRGI KARITHVDTE SYFIVLSIAY PTLSEIKGVI VHRLE 300<br />
Trans of F lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Trans of F G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Trans of F CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Trans of F CR 72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 300<br />
Consensus GVSYNIGSQE WYTTVPKYVA TQGYLISNFD ESSCTFMPEG TVCSQNALYP MSPLLQECLR GSTKSCARTL VSGSF 375<br />
Trans of F lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of F G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of F CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of F CR 72 .......... ...P...... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 375<br />
Consensus GNRFILSQGN LIANCASILC KCYTTGTIIN QDPDKILTYI AADRCPVVEV NGVTIQVGSR RYPDAVYLHR IDLGP 450<br />
Trans of F lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 450<br />
Trans of F G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 450<br />
Trans of F CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 450<br />
Trans of F CR 72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 450<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... .......... .......... ...H...... .......... .......... ..... 450<br />
Consensus PISLERLDVG TNLGNAIAKL EDAKELLESS DQILRSMKGL SSTSIVYILI AVCLGGLIGI PTLICCCRGR CNKKG 525<br />
Trans of F lys .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of F G954 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of F CR67 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of F CR 72 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..... 525<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... .......... .......... .......... .......... .A........ ..... 525<br />
Consensus EQVGMSRPGL KPDLTGTSKS YVRSL 550<br />
Trans of F lys .......... .......... ..... 550<br />
Trans of F G954 .......... .......... ..... 550<br />
Trans of F CR67 .......... .......... ..... 550<br />
Trans of F CR 72 .......... .......... ..... 550<br />
Trans of F Edmonsto .......... .......... ..... 550
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171
TABLE <strong>DE</strong>S ILLUSTRATIONS<br />
Figure 1. Représentation Schématique du virus de la rougeole…………………………… …6<br />
Figure 2. Organisation et transcription du génome du virus de la rougeole…………………..6<br />
Figure 3. Représentation schématique des récepteurs cellulaires du virus de la rougeole…..15<br />
Figure 4. Processus de fusion membranaire…………………………………………………..16<br />
Figure 5. Transcription et réplication du génome du virus de la rougeole………………...…17<br />
Figure 6. Les vaccins ; Souches, méthodes d’atténuation, et producteurs……………………30<br />
Figure 7. Courbe épidémiologique de la rougeole au Cameroun (année 2001)…………...…68<br />
Figure 8. Répatition des cas de rougeole au Cameroun : année 2000………..………………72<br />
Figure 9. Répartition géographique des différents génotypes de virus de la<br />
rougeole en Afrique…………………………………………………………………………..90<br />
Figure 10. Stratégie expérimentale…………………………………………………………113<br />
Figure 11. Situation actuelle de la répartition géographique des différents génotypes<br />
de virus de la rougeole en Afrique…………………………………………………………131<br />
Tableau 1. Classification des paramyxovirus…………………………………………………4<br />
Tableau 2. Souches de référence utilisées pour l’analyse phylogénétique des souches<br />
sauvages du virus de la rougeole…………………………………………………….…….…8<br />
Tableau 3. Cas et Décès de la rougeole par province en 1999, 2000 et 2001 au Cameron…..71<br />
Tableau 4. Evolution de la couverture vaccinale et de l’incidence de la rougeole<br />
au Cameroun de 1993 à 2001……………………………………………………. ………….71<br />
Tableau 5. Calendrier de vaccination infantile recommandé par le PEV dans<br />
les pays en développement……………………………………..……………………….…….74<br />
Tableau 6. Isolement des souches de virus de la rougeole en Afrique par ordre<br />
chronologique (19983-2001)…………………………………………………..……………..89<br />
Tableau 7. Résumé des données des patients et résultats de laboratoire ………………..…118<br />
172
TABLE <strong>DE</strong>S ANNEXES<br />
Annexe 1. Comparaison des séquences des gènes H et F de la souche G954 dans les<br />
cellules Véro, les B95a et les PBL. …………………………………………………………135<br />
Annexe 2. Détection de la protéine F par Western Blot………………………………...…..137<br />
Annexe 3 . Comparaison des séquences de la protéine M de la souche G954 dans<br />
les cellules Véro et B95a……………………………..…………………………………….138<br />
Annexe 4. Comparaison des séquences de gènes H des souches G954, G943, G945<br />
isolées en Gambie en 1993…………………………………………………………………139<br />
Annexe 5. Comparaison des séquences des gènes H et de la partie C-terminale de<br />
la protéine N des souches CR67, CR72, CR82, CR83 isolées au Cameroun en 2001. ……140<br />
Annexe 6. Comparaison des séquences des gènes H des souches isolées au Cameroun ;<br />
Y14 et Y22 (1983), la souche de référence du génotype B1, et CR67, CR72 (2001)……..142<br />
Annexe 7. Comparaison des séquences des gènes H de la souche G954 (Gambie 1993)<br />
et Lys-1 (Lyon-France, 1994)……………………………………………………………...143<br />
Annexe 8 : Comparaison des séquences de la protéine F des souches appartenant au<br />
génotype B3.1(CR 67, CR 72) avec les souches du génotype B3.2 (Lys, G954) et<br />
la souche vaccinale Edmonston…………………………………………………………....144<br />
173
Abstract<br />
Despite the availability of an effective vaccine, measles still causes an important<br />
mortality in developing countries. Improving the actual vaccine is necessary. This depends<br />
upon a better knowledge of the genetic and antigenic variability of the measles virus (MV).<br />
Furthermore, a better understanding of infection and attenuation mechanisms of measles virus<br />
is required. The identification of CD46 and CD150 as cellular receptors for measles virus has<br />
helped to clarify certain aspects of the immunobiology of MV infection.<br />
In the first part of this study, we have examined the properties of a wild-type MV<br />
strain (G954) grown in the epithelial cell line Vero. After adaptation, the wild-type did not<br />
induce fusion (syncytia), but produced high levels of virus during long period. Sequence<br />
analysis of the glycoprotein established there were no amino acid changes. Further, the F0<br />
precursor was cleaved into the fusogenic form F1. Using several approaches, the Veroadapted<br />
virus could not be shown to use CD46 as cell receptor. Knowing that there is no<br />
CD150 on Vero cells, it remains to be established if these cells become infected via a third<br />
cell receptor or by another mechanism.<br />
In the second part of this study we have analysed the viruses from epidemics in the<br />
Gambia (1993) and in the Cameroon (1983, 2001). Sequence analysis revealed less than 0,2%<br />
variation of nucleotides in the H gene, between virus isolates within the same epidemic. The<br />
MVs in 2001 in Yaoundé, Cameroon belongs to the B3.1 genotype and are different from<br />
those isolated in the same region in 1983, that belong to genotype B1. The viruses isolated in<br />
the Gambia correspond to the genotype B3.2. Using monoclonal antibodies against H and F<br />
protein, we show that these African measles strains were antigenically different from each<br />
other and from the vaccine strain. Based on the fact that the same vaccine has been used<br />
during 30 years, antibodies induced by the vaccine strain can exerted a selective pressure on<br />
circulating wild type virus with antigenic modulation.<br />
Key words : measles virus, virus/cell interaction, adaptation, molecular epidemiology,<br />
Cameroon, vaccination.<br />
174