Fluorimétrie - IUT Annecy

TECHNIQUES SPECTROSCOPIQUES ET NUCLEAIRESFluorescence des molécules : fluorimétrieIUT AnnecyDépartement Mesures PhysiquesMPh2 – SE3 – ME3Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie1

Certains composés organiques ou minéraux, liquides ou solidesémettent de la lumière lorsqu’ils sont excités par des photonsvisibles ou du proche UV.C’est le phénomène de photoluminescence.Si l’émission a lieu immédiatement après l’excitation (quelquesnanosecondes), on parle de fluorescence.La technique d’analyse correspondante est la fluorimétrie⇒ dosage et analyse qualitativeSi l’émission se produit au bout de quelques secondes, on parlede phosphorescence.1- Fluorescence et phosphorescence : origineCertains composés sont fluorescents, d’autressont phosphorescents, d’autres les deux à la fois.Après excitation à t = 0, l’intensité de photoluminescence à unedécroissance exponentielle :If( t) = I ( ) exp( −kt)f0 (équation 1)La durée de vie de luminescence τ 0 est définie par :τk 10=(équation 2)Au bout du temps τ 0 , l’émission vaut 37% de sa valeur initiale.63% des espèces sont revenus à un état non-émissif.Fluorescence ⇒ τ 0 = quelques nanosecondesPhosphorescence ⇒ τ 0 = quelques secondes à plusieursminutesMesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie2

La photoluminescence met en jeu des transitions entredifférents niveaux électroniques.FluorescenceEtape d’excitationLa molécule passe de son état fondamental S 0 , V 0 à unétat excité S 1 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …) sous l’effet d’un photonUV / visible.S 0 , V 0 ⇒ S 1 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …)S 0 = niveau électronique fondamentalS 1 = niveau électronique excitéV 0 , V 1 , V 2 … = niveaux de vibration(Passage d’un électron sur une O.M. d’énergie supérieure+ augmentation de l’énergie de vibration)Etape de conversion internePerte d’énergie vibrationnelle (τ = 10 -12 s)S 1 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …) ⇒ S 1 , V 0Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie3

FluorescenceRetour à l’état électronique fondamental avec une énergiede vibration variable (τ = 10 -9 à 10 -7 s)S 1 , V 0 ⇒ S 0 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …)Retour à l’état fondamentalRelaxation vibrationnelle ou émission d’un photon de bienmoindre énergie (moyen IR)Remarques :S 0 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …) ⇒ S 0 , V 0Lors du processus d’absorption, le spin de l’électron quisubit la transition ne se retourne pas.Une partie de l’énergie acquise est dissipée sous forme devibration ⇒ les spectres d’absorption et d’émission necoïncident pas.Les molécules non rigides perdent facilement toutel’énergie par relaxation vibrationnelle ⇒ la fluorescenceest l’apanage des molécules cycliques, rigides possédantdes liaisons π.Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie4

PhosphorescenceLa désexcitation est plus complexe.Croisement intersystèmePassage par un état triplet plus stable par retournement duspin de l’électron si la conversion interne est lenteS 1 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …) ⇒ T 1 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …)Conversion interneT 1 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …) ⇒ T 1 , V 0PhosphorescenceNécessite un second retournement du spin : 10 8 fois pluslong que la fluorescence.T 1 , V 0 ⇒ S 1 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …)Retour à l’état fondamentalS 0 , (V 0 , V 1 , V 2 , V 3 …) ⇒ S 0 , V 0Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie5

2- Intensité de fluorescenceL’intensité de fluorescence dépend de nombreux paramètres :- la probabilité de transition du niveau fondamental vers unniveau excité sous l’effet du rayonnement ;- la probabilité de retour au fondamental par un processusqui inclut une étape de fluorescence ;- l’absorption du rayonnement d’excitation ;- l’absorption du rayonnement de fluorescence par l’espèceémettrice en raison du recouvrement partiel des spectresd’émission et d’absorption (quenching couleur) ;- le transfert d’énergie d’espèces excitées vers d’autresmolécules ou ions (quenching chimique).On définit le rendement de fluorescence :φ =fnombre de photons émisnombre de photons absorbésIf=IaDonc :If⎛ I= φ I = φ0 0 ⎜1 f a f t f −⎝ I0( − ) =tI I φ I⎞⎟ ⎠En supposant que la loi de Beer-Lambert s’applique pour lerayonnement et l’échantillon considérés :f−A( 1−)I f= φ I 100où A est l’absorbance. On peut écrire la puissance de 10 demanière différente et effectuer un développement en série :10−A= exp( − A ln10 )= 1−A ln10 +2( A ln10 ) ( A ln10 )2!−3!3+ ...Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie6

Si la concentration en espèce fluorescente est petite, on peutlimiter le développement en série au premier ordre :−A10 = 1−A ln10Dans ce cas, on obtient :If= φ ⋅I⋅ln10⋅ Af0et en remplaçant l’absorbance par son expression bienconnue :If = φf⋅I0 ⋅ln10⋅ l ⋅c⋅ε avecl = trajet optique dans la solution ;c = concentration massique (molaire) de la substance ;ε = coefficient d’absorption massique (molaire) de la substance.On aboutit au résultat que l’intensité de fluorescence estproportionnelle à la concentration en espèce fluorescente :I f=0K ⋅I⋅csi les hypothèses faites plus haut sont valables :- validité de la loi de Beer-Lambert ;- valeur petite de l’absorbance.Dans la pratique, l’intensité de fluorescence croit de manièrelinéaire puis sature et enfin diminue lorsque la concentrationaugmente.Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie7

Remarque :Compte tenu des interactions du rayonnement d’excitationet du rayonnement de fluorescence avec la solution, onutilise un iris pour ne recueillir que le rayonnementprovenant du centre de la cuve.Rayonnements parasitesCes rayonnements peuvent être gênants quand les longueursd’onde d’excitation et d’émission sont voisines.Diffusion Rayleigh :Diffusion élastique d’une petite partie de l’excitation par lesolvant.Diffusion Raman :Transfert d’une partie de la lumière excitatrice auxmolécules de solvant.Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie8

3- InstrumentationLes sourcesLes sources sont en général des lampes à arc au xénond’une puissance variant de 100 à 800 watts. Elles émettentune lumière polychromatique qui couvre la totalité duspectre d’intérêt.Les détecteursOn utilise des tubes photomultiplicateurs ou desphotodiodes.Géométrie de mesureAvec l’iris précédemment mentionné, on peut détecter lerayonnement fluorescent :o à 90° du rayonnement d’excitation ;o à 180° pour les échantillons opaques ;o à un angle aigu.Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie9

Fluorimètres à rapport de fluorescence (longueur d’onde fixe)source ⇒ monochromateur d’excitation ⇒ échantillonןן⇓détecteur ⇐ monochromateur d’émissionLe monochromateur d’excitation permet de sélectionnerune bande étroite de longueur d’onde (15 nm)Le monochromateur d’émission permet par rotation dechoisir une bande étroite correspondant au dosage àeffectuer.On mesure alternativement l’échantillon et des étalonspour s’affranchir des fluctuations de la lampe et desmodifications éventuelles des conditions expérimentales.Les spectrofluorimètresLes deux monochromateurs sont motorisés : on peutchoisir les longueurs d’onde d’excitation et d’émission.On a ainsi accès à la matrice d’émission-excitation :représentation 3D de l’intensité émise en fonction deslongueurs d’onde d’émission et d’excitation.Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie10

Cette matrice est une signature de la substance analysée⇒ analyse qualitativeElle permet de trouver les longueurs d’onde optimalespour un dosage ⇒ optimisation de l’analyse quantitative.Ces appareils permettent, par leur flexibilité, d’étudier tousles composésFluorescence résolue dans le tempsCertains appareils permettent de déterminer lesconstantes de décroissance. On utilise pour cela dessources pulsées telles des diodes laser.Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie11

4- ApplicationsIndustrie agroalimentaire : dosagesProtéines, amines, aides aminés, vitamines, additifs,résidus de pesticides, microtoxines …Industrie pharmaceutique, biologie :dosagesAnesthésiques, analgésiques, neuroleptiques,tranquillisants, diurétiques, sulfamides, antibiotiques …microfluorimétrie : analyse à l’échelle cellulairecytofluorimétrie en flux : tri des cellulesIndustrie chimiqueComposés aromatiques, aldéhydes, cétones, produitspétroliers, caoutchouc, colorants …Mesures Physiques Annecy – MPh2 SE3 ME3 – 2011 – Philippe GalezTechniques spectroscopiques d’analyse / Fluorimétrie12