MA. 700 - Colph 1.0 - Centre d'expertise en analyse ...

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B.3.6.3B.3.6.4B.3.6.5Additionner les volumes d’échantillons non dilués utilisés pour l’ensemble des replicaet l’ensemble des dilutions ayant des résultats compris entre 30 et 300 UFP(voir équation dans la section B.3.6.5).Diviser la somme des UFP par la somme des volumes d’échantillons non dilués pourobtenir des UFP/ml (voir équation dans la section B.3.6.5).ÉquationUFP1+ UFP2+ ... + UFPnUFP/ml=V + V + ... + V12noùUFP : unité formant des plages de lyse provenant des échantillons desdilutions comptables;V : volume total des échantillons non dilués comptables.Énumération du lysat du phage φX174 :B.4 Pour l’énumération du phage φX174, répéter les étapes B.1 à B.3.5 en remplaçant lephage MS2 par le phage φX174 (cf. 6.4.2), en remplaçant la bactérie hôte E. coli F amppar la bactérie hôte E. coli CN-13 (cf. 7.2) et en remplaçant les antibiotiquesampicilline/streptomycine 100X par la solution d’antibiotique d’acide nalidixique100X (cf. 6.2.2).Les limites de quantification (inférieure et supérieure) pour l’énumération du phagesont respectivement 30 et 100 UFP par boîte de Pétri. Lorsque le dénombrementexcède la limite de quantification, inscrire TNC comme résultat.24 de 25 MA. 700 – Colph 1.0
Annexe C – Étapes de la méthode7.1 Pré-culture de la bactérie hôteJour -1• E. coli F amp congelé• TSB 1X• Ampicilline/streptomycineIncuber à 36 °C avec agitation, une nuit7.2 Culture en phaseexponentielle de labactérie hôtePré-culture d’E. coli F amp•TSB 1X•Ampicilline/streptomycine• Incuber à 36 °C avec agitation, environ1 h 30 à 2 h 30, jusqu’à l’atteinte d’uneDO 520 de 0,1 à 0,5• Ensuite, refroidir rapidement à 4 °CJour 07.3.1 EnrichissementE. coli F amp phaseexponentielle• 5,0 ml TSB 10X• MgCl2• Ampicilline/streptomycineÉchantillons100 ml• 100 ml d’eaustérile• Coliphage MS2Incuber à 36 °C sansagitation, une nuitÉchantillons Blanc Contrôle +Jour 17.3.2 Mise enévidence - Spot Test7.3.2.2 Centrifuger ou filtrerIncuber à 36 °C,une nuitJour 27.4 Lecture des résultatsAbsence de lyse = absence de coliphageLyse = présence de coliphageMA. 700 – Colph 1.0 25 de 25
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